單核苷酸多態性結合位點C19007T與宮頸癌患者易感性的相關研究

秦 梅，武紅權，厲 勇，楊 旭，胡苑苑

(1.貴州省貴陽市第一人民醫院輸血科 550002；2.貴州省人民醫院檢驗科，貴陽 550002；3.貴州省貴陽市婦幼保健院輸血科 550003)

宮頸癌是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤發病率中排第3位。近年來，宮頸癌的發病趨于年輕化[1]，廣大女性的健康及生命安全受到了嚴重威脅。通過對宮頸癌相關易感因素的研究表明，遺傳基因的突變很有可能是引起宮頸癌的一個重大因素[2]。到目前為止，針對宮頸癌易感性與基因多態性的研究已有較大進展[3-4]。本研究旨在通過探討位于caspase-3基因C19007T位點的多態性與宮頸癌易感性的關系，為宮頸癌的病因學研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取從2013年2月至2016年9月于貴州省人民醫院、貴陽市婦幼保健院、貴陽市第一人民醫院婦科住院的100例宮頸癌患者(觀察組)，均未曾在采血前行放療、化療、免疫治療等其他針對腫瘤的治療，平均年齡為(46.0±10.1)歲，經術后的宮頸活組織病理檢查結果判定，所有患者腫瘤病理類型都是宮頸鱗狀細胞癌。根據國際婦產科聯盟(FIGO)的2009年臨床分期標準：Ⅰ、Ⅱ期有60例，Ⅲ、Ⅳ期有40例；局部的淋巴結轉移情況：32例有轉移，68例無轉移。患者各項信息(年齡、吸煙狀態、孕產次、HPV感染情況等)均來源于病歷記錄。選取同期于該院體檢未檢出宮頸病變的100例健康女性作為對照組，平均年齡為(47.8±9.4)歲。所有研究對象間相互均無直系親屬關系，且均無遺傳病病史。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取 采集所有受試者晨起空腹時的靜脈血3～5 mL，運用TIANamp試劑盒提取所采血液中基因組DNA，于-80 ℃保存。

1.2.2基因分型 選取caspase-3上3′-UTR端的microRNA結合位點C19007T，使用PCR-PIRA方法進行引物設計，于多態性位點的上游用堿基A代替T，進而引入TaqⅠ酶切位點。其中，上游的引物為：5′-TTG TGA AAA AGT TAA ACA TTG AAG TAT-3′，下游的引物：5′-TTC AGG ACA AAC ATC ACA AA-3′，擴增的產物片斷長度是230 bp(圖1)。PCR擴增反應體系的總體積為25 μL，包括10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.15 μL，dNTP 0.5 μL，MgCl22.5 μL，P 10.3 μL，rTaq酶0.25 μL，P2 0.3 μL。PCR擴增條件：95 ℃條件下預變性10 min，95 ℃條件下變性45 s，退火45 s，72 ℃ 50 s，擴增35個循環，72 ℃ 7 min，4 ℃保存，反應結束。電泳槽中放入2%瓊脂糖凝膠，并加11 μL PCR反應產物后電泳(30 min)。在凝膠成像儀下成像、拍照。酶切反應體系為15 μL，包括ddH2O 1.5 μL，XspI 1 μL(8 U/μL)，Buffer(10×K)1.5 μL及PCR反應產物11 μL。在37℃恒溫水浴箱過夜。用3.5%的瓊脂糖凝膠電泳(30 min)后觀察并記錄酶切結果，見圖2。

圖1 caspase-3基因的PCR產物

圖2 caspase-3基因的C19007T多態性的分析

1.2.3免疫組織化學 從觀察組中選取100例宮頸鱗癌組織的石蠟標本。標本來源于貴州省人民醫院、貴陽市婦幼保健院病理科。常規石蠟包埋，4 μm連續切片后，給予免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察。結果分析：以細胞質或細胞膜中出現棕黃色顆粒為caspase-3蛋白的陽性表達。當物鏡下的陽性細胞，≤10%記0分；>10%～50%記1分；>50%～75%記2分；>75%記3分。染色強度的區分標準：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。上述兩項的得分相加以后：0分為“-”，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～6分為“+++”。

1.3 統計學處理

所有數據采用SPSS19.0軟件進行處理，計數資料采用率表示，組間采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，等級資料的相關性分析采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 caspase-3基因上C19007T 位點多態性的基因分布情況

對照組與觀察組在年齡、吸煙狀況、婚次、產次方面均無明顯差異。而HPV感染在觀察組84例(84%)的分布頻率明顯高于對照組24例(24%)且有統計學意義(P<0.01)。

2.2 caspase-3結合位點上C19007T 的基因型分布及其與宮頸鱗狀細胞癌遺傳易感性的關系

所有研究對象的C19007T 多態位點共計有3種基因型：C/C、T/C及T/T，其在觀察組中的基因型頻率依次為58%、37%、5%，在對照組中依次為55%、29%、16%，將基因型T/C、T/T分別與等位基因C/C作對比，兩組間基因型C/C和T/C的分布頻率差異無統計學意義(P=0.540)，C/C、T/T基因分布頻率差異有統計學意義(P=0.020)，見表1。T/T基因型較C/C基因型可更明顯降低宮頸鱗狀細胞癌發病的可能性，見表2。經χ2檢驗，caspase-3 rs1049216多態位點在兩組中均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 caspase-3上3′-UTR端microRNA結合位點的SNP與宮頸鱗狀細胞癌轉移的關系

有淋巴轉移組的caspase-3 C19007T 的C/C、T/C、T/T基因型頻率分別為31.0%、35.1%、20.0%，無轉移組的分別為69.0%、64.9%、80.0%，分別將基因型T/C、T/T與基因型C/C作對比，兩組基因型的分布頻率均差異無統計學意義(P=0.678、0.606)，見表3。

表1 C19007T SNP基因型在觀察組和對照組的分布(n)

表2 C19007T 基因型和宮頸癌臨床分期的關系[n(%)]

表3 C19007T 基因型與淋巴轉移的關系[n(%)]

A:正常宮頸組織；B:C/C基因型患者的瘤組織；C：T/C基因型患者的瘤組織；D：T/T基因型患者的瘤組織

表4 3種基因型的宮頸癌組織中的caspase-3蛋白表達水平[n(%)]

2.4 免疫組織化學

癌組織中caspase-3蛋白的表達減少，免疫組織化學染色結果提示：陽性顆粒位于腫瘤細胞的細胞質中，部分間質細胞內亦有所發現。以上研究結果表明，caspase-3蛋白的表達情況與rs1049216的基因型類型(C/T、C/C、T/T)沒有顯著的關聯(P=0.903)，見表4、圖3。

3 討 論

在女性所有的生殖系統腫瘤中，宮頸鱗狀細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一。目前，宮頸鱗狀細胞癌的致命性在全球引起廣泛關注，在發展中國家的進展速度更為引人注目[5]。宮頸鱗狀細胞癌的發生、發展是個多因素參與的復雜過程，隨著近年來的深入研究，眾多研究表明，遺傳因素的改變是引起宮頸鱗狀細胞癌出現易感性的重要原因。遺傳易感性雖然不能直接引起腫瘤，但會使腫瘤發生的可能性增加，而其中的SNP及其相關組合，可增加復雜性遺傳病的發病風險[6]。有研究表明，microRNA結合位點的SNP可明顯改變生物合成和/或相應的microRNA的功能表達，并由此增加惡性腫瘤的患病風險[7]。同時，有大量研究表明，基因3′-UTR的SNP功能位點可大大增加惡性腫瘤發生的可能性[8-9]。

caspase-3是一種與細胞凋亡有關的蛋白，caspase-3在整個細胞凋亡過程中發揮著關鍵作用[10]。有研究表明，caspase-3在宮頸鱗狀細胞癌中表達減低，使得癌細胞在向周圍正常組織及全身各器官的擴散轉移速度加快。有文獻報道，caspase-3基因的多態性與許多種惡性腫瘤易感性有關[11-12]。本研究顯示，在caspase-3基因中的結合位點C19007T 的T/T基因型可導致宮頸癌的發生。與HPV感染和宮頸鱗狀細胞癌的臨床分期都有顯著的相關性。相關研究表明，SNP的很多位點與多種腫瘤的轉移與預后有關[13-14]。

細胞增殖與凋亡失衡、促細胞凋亡的蛋白表達減少均會誘發腫瘤，而caspase-3在細胞的凋亡中極為重要。相關研究表明，caspase-3在很多婦科惡性腫瘤中的表達出現變化[15]。但caspase-3在宮頸鱗狀細胞癌細胞中的表達可能與C19007T 位點的多態性無明顯相關性。

總之，caspase-3基因3′端非翻譯區microRNA結合位點的C19007T 可能與宮頸癌的淋巴轉移無關，同時，caspase-3的蛋白表達情況與rs1049216的多態性無明顯相關性。這些發現可用于對易感人群進行宮頸鱗狀細胞癌的篩查，對宮頸鱗狀細胞癌的預防及治療具有重要意義。