含洛匹那韋/利托那韋二線方案抗HIV病毒治療失敗基因型耐藥情況分析

劉家法，張 米，李健健，楊壁琿，鄧雪媚，雷素云

(云南省傳染病?？漆t院/艾滋病關愛中心，昆明 650301)

云南省是我國人類免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)的傳播、流行和危害最為嚴重的地區之一，目前治療人數較多，基因型較為復雜，已成為云南省的重大公共衛生問題和社會問題之一，引起社會各界的高度重視。據云南省防治艾滋病局的報道，截至2016 年12 月，全省存活HIV感染者92 957例，累計治療患者88 549例，正在治療70 317例，其中因耐藥發生治療失敗總人數9 344例，累計治療總人數中耐藥發生率為10.55%。對于治療失敗的患者不得不更換治療方案，使用二線治療方案，提高治療效果。本文對云南省更換含洛匹那韋/利托那韋(LPV/r)二線抗病毒治療方案治療失敗的患者進行基因型耐藥檢測，以便了解目前云南省二線治療方案的耐藥情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月1日至2016年12月31日來自云南省傳染病?？漆t院接受免費抗病毒治療的患者治療信息，篩選出更換含LPV/r治療方案且治療時間大于6個月、檢測病毒載量大于1 000 copy/mL的血漿標本共計162份。同時收集這部分患者的人口學、臨床及實驗室資料。

1.2 方法

1.2.1HIV-1病毒載量檢測 參照《HIV-1病毒載量測定及質量保證指南》(2013版)。采用羅氏公司的HIV病毒載量檢測儀，以及其配套試劑COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0定量檢測HIV-1病毒載量，具體檢測方法參見儀器說明書及試劑盒說明書。

1.2.2血漿RNA提取 采用美國雅培公司m2000sp全自動核酸提取儀及配套試劑從待檢血漿中提取病毒RNA，具體提取方法參見儀器說明書及試劑盒說明書。

1.2.3基因型耐藥性檢測 采用自建基因型耐藥檢測方法進行逆轉錄擴增，并參照《HIV-1基因型耐藥檢測及質量保證指南》(2013版)，通過套式聚合酶鏈反應擴增覆蓋蛋白酶基因全序列和反轉錄酶1～300位密碼子序列，擴增產物送北京諾賽基因有限公司進行純化和序列測定。擴增及測序引物參照文獻[1]。

1.2.4序列拼接與分析 耐藥分析應用Contig Express 軟件拼接原始核苷酸序列，用BioEdit 軟件對拼接后的序列校對、整理和比對分析，整理后序列提交美國斯坦福大學HIV耐藥基因型檢測數據分析和解釋系統(http://hivdb.stanford.edu)進行耐藥突變位點的分析和解釋耐藥變異情況。

2 結 果

2.1 人口學特征

篩選云南省抗病毒治療數據庫，篩選出符合條件樣本162份,其病毒載量均值為40 951 copy/mL,CD4+T淋巴細胞計數均值為249個/μL，平均治療時間為42.3個月。這部分患者中男96例，女66例，男女比率為1.45∶1.00；年齡4～81歲，平均年齡為43歲。患者具體信息見表1。

2.2 耐藥基因擴增和測序結果

162例樣本經自建基因型耐藥檢測方法RT-PCR擴增陽性，將擴增出來的片段進行基因序列測序，共獲得162份完整基因序列。

2.3 耐藥情況

以出現任意1種藥物耐藥突變(低、中、高度耐藥)統計為耐藥，將162例完整基因序列，上傳美國斯坦福大學HIV-1耐藥基因型檢測數據分析和解釋系統結果顯示，65(40.1%)例對核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)以蛋白酶抑制劑 (PIs)有不同程度耐藥；其中對NRTIs和NNRTIs的耐藥分別有34例(21.0%)和54例(33.3%)，對PIs耐藥5例(3.1%)。在已檢出具有不同程度耐藥的65例患者中，有3例(1.9%)出現對3類藥同時耐藥的患者；有28例(17.3%)的患者對NRTIs及NNRTIs兩種藥物同時出現耐藥。在使用過的藥物中，對NVP、EFV、3TC、FTC高度耐藥的情況分別是45例(27.8%)、35例(21.6%)、26例(16.0%)、26例(16.0%)，對PIs有2例患者出現高度耐藥的情況。具體對每種藥物的耐藥情況見表2。

表1 162例患者的臨床資料

EFV：依非韋倫；NVP：奈韋拉平；3TC：拉米夫定；AZT：齊多夫定；D4T：司他夫定；TDF：替諾福韋；ABC：阿巴卡韋

表2 3類藥物的耐藥數量及耐藥水平

P：代表潛在耐藥；L：低度耐藥；I：代表中度耐藥；H：高度耐藥

2.4 基因型耐藥突變位點情況

162例患者的檢測結果中，與PIs相關的主要耐藥基因突變位點有M46I、V82A、L76V、I84V和I54V各1例。與NRTIs相關的突變中，突變位點發生頻率前3位的是M184V/I、T69N/D和K70R,分別為16.0%(26/162)、8.0%(13/162)和4.3%(7/162)。與NNRTIs的突變中，突變位點發生頻率前3位的是K103N/E、V179D/E/T和V90I,分別為15.4%(25/162)、14.2%(23/162)和8.6%(14/162)。具體耐藥位點情況見表3。

表3 常見耐藥突變類型及比例

續表3 常見耐藥突變類型及比例

2.5 基因型耐藥突變位點情況

不同感染方式中的基因型分布見表4。

表4 不同感染方式中HIV-1基因型分布[n(%)]

表5 針對不同治療方案耐藥發生情況及耐藥比例

2.6 不同抗病毒治療方案耐藥發生情況

對不同治療方案的耐藥情況見表5。

3 討 論

為了有效控制AIDs疫情的蔓延，我國從2002年開始試行AIDs免費抗病毒治療項目，自2003年起全面開展落實國家“四免一關懷”政策[2-3]。經過10多年來各級政府逐步落實AIDs患者免費抗病毒治療的政策，建立起了免費AIDs抗病毒治療的各級保障機制，符合治療標準且接受抗病毒治療的患者比例逐年增多。隨著抗病毒治療時間延長，治療失敗的患者逐年增多。對于治療失敗的患者，需要選擇更換為二線治療方案。在我國，主要的二線治療方案為兩種NRTIs加一種PI共同治療[4]。目前國內免費使用的PIs主要是LPV/r，對于更換含LPV/r二線治療方案治療失敗的患者，將面臨無免費抗病毒藥可用的情況。

HIV屬于反轉錄病毒，病毒在復制過程中伴隨著高度變異性。經過長時間的治療，在抗病毒藥物的選擇壓力下，HIV基因易發生突變而對多種藥物的產生耐藥[5]。在本研究中，65(40.1%)例對NRTIs、NNRTIs和PIs有不同程度耐藥；其中對NRTIs和NNRTIs的耐藥分別有34例(21.0%)和54例(33.3%)，對PIs耐藥5例(3.1%)。在已檢出具有不同程度耐藥的65例患者中，有3例(1.9%)出現對3類藥同時耐藥的患者；有28例(17.3%)的患者對NRTIs及NNRTIs兩類藥物同時出現耐藥。云南省2012年所有治療失敗人群的耐藥率為58.9%[1]，2008-2012年所有治療失敗人群的耐藥率為53.8%[6]，本研究耐藥率低于之前的研究。究其原因一方面是這些更換二線治療方案的患者可能僅有少數是因為耐藥更換治療方案，還有一部分是因為免疫重建不良、藥物不良反應及懷孕等原因更換，其患者對藥物本身并不耐藥。另一方面可能是由于PIs比NNRTIs有更高的耐藥屏障，不易產生耐藥。

在使用過的藥物中，耐藥率較高的幾種藥仍然是NVP、EFV、3TC、FTC，耐藥率低于其他研究[1,6-7]。對PIs有5例患者出現耐藥的情況，其中2例患者對LPV/r產生高水平耐藥。本次研究中有3例患者對PIs、NRTIs和NNRTIs這3類藥均出現耐藥，這3例患者均是通過性傳播方式感染的男性患者，出現多重耐藥的原因可能跟性傳播導致交叉感染有關。本研究中，PIs的主要突變位點M46I、I54V、L76V、I84V和V82A各出現1次。M46I為輔助突變，當與其他PIs突變同時出現時，可降低PIs敏感性；I54V與其他PIs突變同時出現時，會增加PIs的耐藥性；V82A是PIs較常出現的耐藥突變，通常在PIs治療失敗早期出現；I84V常出現在PIs持續治療無效時，可使全部PIs的敏感性降低[8]。在本研究中與NRTIs和NNRTIs相關的耐藥突變中，排名前3位的耐藥突變分別是M184、T69、K70和K103、V179、V90，這與云南省楊紹敏等[6]的研究結果不一致。其主要原因一方面是云南省處于邊境地區，人員流動性大，導致HIV毒株在不停地變化，重組毒株在不斷增加，而耐藥突變與HIV-1基因亞型相關[9]，導致耐藥位點也在不停地變化。另一方面是本次研究的患者都是先使用一線治療方案后再改為含LPV/r的二線治療方案，在不同的藥物作用下，導致耐藥位點發生改變。

在更換的二線治療方案中，主要使用的是3TC+TDF+LPV/r和3TC+AZT+LPV/r兩種治療方案，兩種方案的耐藥率分別為35.5%(36/102)和21.4%(12/56)，使用3TC+TDF+LPV/r的耐藥率高于使用3TC+AZT+LPV/r方案的患者，其主要原因可能為TDF易出現胃腸道不良反應和腎毒性[10]，從而影響藥物的吸收有關。

隨著抗病毒治療時間的延長，因為一線藥物耐藥屏障低，同時不良反應大，在藥物壓力作用下治療失敗的患者會越來越多，未來會有更多的患者使用二線治療方案，而我國目前可供免費使用的二線藥物有限。因此，在治療過程中應加強對患者依從性教育，同時加強監測檢測，減少對二線藥物耐藥的產生，同時減少耐藥毒株的傳播，是以后抗病毒治療的重點工作。