茶樹Na+/H+逆向轉運蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表達分析

陳江飛，余津銘，楊建坤，余有本，肖斌，楊亞軍,2，王偉東*

1. 西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008

茶樹[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]是我國重要的葉用經濟作物，其生長發育過程中經常遭受各種環境脅迫，嚴重影響茶葉產品的產量和品質，制約茶產業的發展[1]。因此，研究茶樹的抗逆機制，鑒定抗性基因，對通過分子育種技術培育抗性茶樹優良品種具有重要意義。

Na+/H+逆向轉運蛋白（Na+/H+antiporter，NHX）是一種高度保守的跨膜轉運蛋白，根據其在細胞中定位不同分為兩大類，一類位于質膜上（Plasma membrane，PM），另一類位于細胞內部（Intra-cellular，IC），其中 IC類成員進一步分為定位于液泡膜上的Class I和定位于內囊體膜上的Class II[2-3]。大量研究證實，NHX參與了對植物生長發育，如下胚軸生長、葉片發育、花粉生長、花色形成的調控[4-7]，且在鹽脅迫響應過程中發揮重要作用[8]。鹽脅迫下，NHX依賴H+-ATPase和H+-PPase所形成的H+電化學梯度將細胞質內Na+/K+排出體外或區域化到液泡中，從而避免或降低鹽脅迫對植物體的傷害[9]，如 Quintero等[10]研究顯示，AtNHX1能夠恢復酵母突變體nhxl對Na+的轉運能力從而增加了其對NaCl的抗性，而過表達OsNHX1亦能夠提高轉基因植株對Na+的耐受性[11]。此外，越來越多的研究證實NHX也參與了植物對干旱、極端溫度以及ABA等脅迫的響應過程，如Yokoi等[12]發現擬南芥AtNHX1和AtNHX2的表達水平受ABA誘導，Venema等[13]亦發現ABA能夠誘導番茄LeNHX2上調表達；柑橘NHX受到短暫高溫脅迫后能夠提高其 mRNA轉錄水平[14]；同樣，5% PEG 6000模擬干旱處理能夠顯著誘導大豆GmNHX1的表達[15]。上述研究結果表明，NHX在植物脅迫應答中具有廣泛功能，其在植物抗逆生理中具有廣闊的研究前景及應用價值。目前，在擬南芥[10]、棉花[16]、玉米[17]、小麥[18]中已成功克隆出多個NHX基因，然而茶樹NHX目前仍未被克隆，其在茶樹脅迫響應中的功能尚不清楚。

本研究以龍井長葉品種茶樹為材料，克隆獲得了CsNHX1和CsNHX2基因 cDNA全長序列，利用生物信息學手段初步分析了2個基因及其編碼蛋白的結構特征，并利用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）分析了CsNHX1和CsNHX2在多種非生物脅迫下的表達模式，以探討其在逆境脅迫下的生物學功能，為茶樹抗逆分子遺傳育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

選取長勢良好、一致的2年生龍井長葉品種茶樹扦插穴盤苗于人工氣候箱中預培養，培養條件為：晝夜溫度24℃/22℃，光周期12 h/12 h，光照強度240 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%～80%。2周后將茶苗隨機分組進行不同的脅迫處理：將茶苗分別置于控溫為40℃或4℃的人工氣候箱進行高溫和低溫脅迫處理；將茶苗連同穴盤一起置于含有 200 mmol·L-1NaCl或20% PEG 6000的溶液中，使根系完全浸泡在溶液中進行高鹽脅迫和干旱脅迫處理；用100 μmol.L-1外源 ABA 噴施茶苗葉片進行ABA誘導處理；保持原培養條件不變，未做任何處理的茶苗作為對照。每個處理設3次重復。于處理后 0、1、2、4、8、12、24、48 h取芽下第一、二葉各 0.1 g，液氮速凍后存于-80℃備用。

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

采用CTAB法提取葉片材料總RNA[19]，用 NanoDrop 2000c（Thermo Scientific，美國）檢測RNA濃度與質量，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（ABM，加拿大）反轉錄得到 cDNA第一鏈，用于基因克隆與熒光定量PCR分析。

1.3 茶樹CsNHX1、CsNHX2基因的克隆

從龍井長葉品種茶樹轉錄組（NCBI SRA數據庫：SRP128078）中檢索獲得CsNHX1和CsNHX2序列信息[20]，利用 IDT（http：//sg.idtdna.com/calc/analyzer)在線軟件設計各自特異性引物（表1），以龍井長葉品種茶樹葉片cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為：2×Taq Master Mix 25 μL，模板 5 μL，上下游引物各 2.5 μL，ddH2O補齊至 50 μL。程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 7 min。PCR產物經凝膠電泳檢測后用 Gel Extraction Kit（OMEGA，美國）試劑盒進行回收，回收產物連接至 pMD19-T載體（TaKaRa，大連），轉入DH5α感受態細胞（唯贊生物，南京）后送楊凌奧科生物科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI中的Blast工具對獲得的基因及其編碼蛋白進行同源比對和保守結構域分析；ProtParam tool預測氨基酸的組成與理化性質；DNAMAN 6.0與MEGA 7.0進行多序列比對并用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統進化樹；ProtScale（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）進行氨基酸親/疏水性分析；Netphos 3.0 Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos）預測蛋白質磷酸化位點；SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線網址預測信號肽；TMHMM Server 2.0（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進行跨膜結構域分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in the study

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據克隆得到的基因序列設計定量引物（表1），以茶樹CsPTB基因為內參基因[21]，按 SYBR? Premix Ex Taq II（TaKaRa，大連）使用說明進行 qRT-PCR分析。使用 IQ5 Multi-Color Real time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）進行qRT-PCR反應，95℃3 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min 30 s，循環 40次；60℃ 30 s，71個循環，每次循環上升0.5℃。每個樣品均設 3次技術重復，采用算法分析結果[22]。

1.6 數據統計與分析

試驗數據用 SPSS 22軟件統計分析，以Duncan′s新復極差法進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 CsNHX1、CsNHX2基因克隆與序列分析

以龍井長葉品種茶樹葉片的 cDNA為模板，用特異性引物進行 RT-PCR擴增，產物經過 1%瓊脂糖凝膠電泳獲得 2條單一條帶（圖1），測序結果顯示序列分別長 1 691 bp和1 757 bp，均包含1個1 626 bp的開放閱讀框，編碼 541個氨基酸，與轉錄組檢索序列一致，為CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全長序列，序列已經上傳至GeneBank數據庫，登錄號為：MG722977和MG515211。編碼蛋白序列比對結果顯示，CsNHX1和 CsNHX2蛋白序列與其他植物NHX蛋白具有較高同源性，均包含1個保守的Na+/H+Exchanger結構域和 1個糖基化位點，且在保守結構域上游均包含1個NHX蛋白抑制劑：氨氯吡嗪脒的結合位點（LFFIYLLPPI）（圖2）。

圖1 CsNHX1和CsNHX2基因的RT-PCR擴增Fig. 1 RT-PCR amplification of CsNHX1 and CsNHX2 genes

圖2 茶樹和其他植物NHX的多重序列比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of NHXs from Camellia sinensis and other plants

2.2 系統進化樹分析

利用 23個不同植物的 NHX構建系統進化樹，結果顯示 CsNHX1與可可TcNHX1及葡萄 VvNHX1親緣關系較近，CsNHX2則與可可TcNHX2及煙草NtNHX2親緣關系較近，均屬于 IC類的 Class I成員，即液泡膜型Na+/H+逆向轉運蛋白；而均與質膜型 Na+/H+逆向轉運蛋白（PM）如擬南芥 AtNHX8、葡萄VvNHX7等的親緣關系較遠（圖3）。

2.3 CsNHX1、CsNHX2蛋白的生物信息學分析

2.3.1 蛋白理化性質預測

蛋白理化性質預測結果顯示，CsNHX1和CsNHX2的分子式分別為 C2752H4285N671O759S17和C2749H4303N687O739S29，分子量為59.5 kD和59.7 kD，理論等電點（pI）為 7.07和 8.79，分別含有負電荷殘基（Asp+Glu）39個和 31個，正電荷殘基（Arg+Lys）39個和 36個，蛋白質三維結構不穩定系數為34.48和40.63，推測CsNHX1為穩定的堿性蛋白，而CsNHX2為不穩定的堿性蛋白。

2.3.2 磷酸化位點與親/疏水性分析

磷酸化位點分析結果如圖4-A、4-B所示，CsNHX1和CsNHX2均包含多個磷酸化位點，其中以絲氨酸磷酸化位點最多，且多個位點的預測值在0.90以上，推測2個蛋白很有可能受到磷酸化作用的調控。另外，親/疏水預測結果顯示CsNHX1、CsNHX2的疏水區域均大于親水性區域，GRAVY值分別為0.586和0.574，表明其均屬于疏水性蛋白（圖4-C、4-D）。

圖3 不同物種的NHX蛋白的系統進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of NHX protein sequences from different species

2.3.3 跨膜結構域分析

跨膜結構預測結果顯示（圖5），CsNHX1和 CsNHX2均屬于典型的跨膜蛋白，分別具有11、10個跨膜結構域。同時，SignalP預測結果顯示CsNHX1和CsNHX2的D值分別為0.357和 0.193（小于 cut off值 0.5），表明它們均沒有信號肽，屬于非分泌蛋白。

圖4 CsNHX1和CsNHX2磷酸化位點與疏水性分析Fig. 4 Phosphorylation site prediction and hydrophobicity analysis of CsNHX1 and CsNHX2

圖5 CsNHX1和CsNHX2跨膜結構域分析Fig. 5 Transmembrane domains analysis of CsNHX1 and CsNHX2

2.3.4 非生物脅迫下的表達分析

熒光定量分析結果如圖6和圖7所示，20% PEG 6000、低溫和 NaCl處理下茶樹CsNHX1和CsNHX2基因均被誘導表達，其表達水平整體呈現出先升高后降低的表達模式。不同的是，低溫處理下CsNHX2表達水平緩慢增加并維持在一定水平，而CsNHX1在迅速增加后于24 h開始明顯降低。高溫脅迫處理下，CsNHX1和CsNHX2基因表現出相反的表達模式，其中CsNHX1表達水平于4 h開始顯著降低并維持在較低水平，而CsNHX2表達水平顯著增加，在8 h達到的峰值后開始回落，但仍顯著高于對照。ABA處理下，CsNHX1在4 h和24 h分別出現了上調和下調表達，CsNHX2的表達水平則在8 h和12 h出現降低，但整體變化趨勢均不顯著。

3 討論

圖6 CsNHX1在非生物脅迫下的表達分析Fig. 6 Expression analysis of CsNHX1 under abiotic stresses

圖7 CsNHX2在非生物脅迫下的表達分析Fig. 7 Expression analysis of CsNHX2 under abiotic stresses

NHX在植物的生長發育以及逆境脅迫應答過程中起著至關重要的作用，其生物學功能及分子調控機制受到越來越多的關注[23]。本研究基于茶樹轉錄組數據克隆獲得了茶樹CsNHX1和CsNHX2基因，其編碼蛋白均含有 NHX蛋白典型的功能結構域——Na+/H+Exchanger，且該結構域上游均包含 1個氨氯吡嗪脒的結合位點：LFFIYLLPPI[24]。已有研究證實，氨氯吡嗪咪及其類似物是NHX蛋白的競爭性抑制劑[25]，如MIA[5-(N-甲基-N-異丁)-氨氯吡嗪咪]可顯著抑制水稻根 NHX 的轉運活性[26]，故推測茶樹CsNHX1和CsNHX2蛋白轉運活性可能也受到類似抑制作用。另外，跨膜結構域預測顯示CsNHX1和CsNHX2分別含有11個和10個跨膜區，且分別含有1個和2個未完全跨膜區，未完全跨膜區域被認為是與Na+結合的重要位點[27]，表明CsNHX1和CsNHX2在與Na+結合上存在一定的差異。系統進化樹分析表明茶樹 CsNHX1和CsNHX2均屬于IC類中的Class I分支成員，意味著其可能主要定位于液泡膜上發揮Na+/H+區域化功能。

眾多研究已證實植物NHX基因會被鹽脅迫顯著誘導表達，以提高植物對鹽脅迫的耐受性[28]。本研究亦顯示鹽脅迫下CsNHX1和CsNHX2均被顯著誘導表達，表明其參與了茶樹對鹽脅迫的響應過程，這與其他物種中相關研究結果高度一致[29-30]。最近，Brinin等[31]發現干旱脅迫能夠增加小麥TaNHX1的mRNA轉錄水平；蘋果MdNHX1同樣受到干旱脅迫的誘導[32]，這與本研究顯示PEG 6000處理顯著誘導了茶樹CsNHX1和CsNHX2基因的表達相一致，暗示CsNHX1和CsNHX2基因同樣參與了茶樹對干旱脅迫的響應。現有研究表明，植物NHX基因在低溫脅迫下具有不同的應答模式，如玉米ZmNHX1基因不能被低溫脅迫誘導表達[17]，而小果白刺NsNHX1在低溫脅迫下被顯著誘導表達[33]，本研究顯示茶樹CsNHX1和CsNHX2基因在低溫脅迫下亦被誘導表達，與小果白刺中研究結果一致。另外，茶樹CsNHX2在高溫處理后表達量顯著增加，這與Porat等[14]報道的高溫處理顯著提高柑橘NHX1表達水平的結果類似，但茶樹CsNHX1基因表達水平在高溫脅迫處理下顯著下調，推測CsNHX1和CsNHX2在茶樹響應高溫脅迫過程中發揮不同的生物功能。ABA與植物抗逆性有著密切的聯系，是植物逆境響應過程中最初的信號物質，根據其是否參與分為依賴ABA途徑與不依賴 ABA途徑[34]。擬南芥AtNHX1、AtNHX2受到ABA的誘導，依賴ABA途徑參與對逆境脅迫的響應[12]，棉花GhNHX1[16]、水稻OsNHX1和OsNHX2均與之類似[35]，而菊苣CiNHX1[36]及甜菜BvNHX1[37]不受 ABA誘導為不依賴 ABA途徑。本研究中，外源ABA處理下茶樹CsNHX1和CsNHX2表達水平變化趨勢不顯著，意味著其可能在茶樹逆境響應過程中也是不依賴ABA途徑。

植物液泡膜 NHX的抗鹽機制已較為明確[38]，Na+經長距離運輸到地上部分后 NHX利用跨膜 H+電化學梯度將其區域化到液泡中，使地上部分能夠積累較多的Na+，從而降低鹽脅迫對植物體的影響[39]。此外，大量研究表明，NHX可以通過維持細胞正常的滲透壓，從而緩解高溫、干旱等多種逆境脅迫的影響[40]。本研究中，茶樹CsNHX1和CsNHX2均受到高溫、干旱、低溫和鹽脅迫的誘導表達，我們推測茶樹CsNHX1和CsNHX2亦可能通過區域化 Na+和維持細胞正常滲透壓提高茶樹對鹽脅迫和其他脅迫的耐受性，其功能機制將是我們今后深入研究的重點。