高尿酸血癥患者尿液外泌體源性microRNA表達譜的初步研究

胡艷艷 徐紅 朱仁杰 楊汝春 陳堅翱

1浙江中醫藥大學附屬嘉興中醫院（浙江嘉興 314001）；2浙江中醫藥大學附屬廣興醫院（杭州 310007）；3浙江中醫藥大學（杭州 310053）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是人體內嘌呤代謝發生紊亂，致使血液中尿酸增高而引起的一種代謝性疾病。隨著我國社會經濟發展，人們生活方式及飲食結構改變，高尿酸血癥的患病率逐年增高，并呈年輕化趨勢，已成為僅次于糖尿病的第二大代謝性疾病［1］。有研究發現，在細胞、動物水平，及高尿酸血癥患者血液中不同的microRNA可能參與了高尿酸血癥的多個病理過程，如抑制血管再生、形成尿酸鹽結晶、損傷腎功能等，從而在一定程度上影響高尿酸血癥的發生發展［2］，但其發病機制目前仍不十分清楚。

1 對象與方法

1.1研究對象本研究經浙江中醫藥大學附屬廣興醫院倫理委員會批準，收集2016年7-12月期間就診于浙江中醫藥大學附屬廣興醫院的原發性無癥狀高尿酸血癥患者及體檢中心的健康人群，獲得受試者知情同意并簽署知情同意書，每組3例。其中男5例，女1例，年齡24～28周歲。

1.2主要實驗試劑和儀器設備TRIzol LS Re-agent（美國Invitrogent公司），超速離心機（Optima XPN-90美國Beckman公司），Illumina NexSeq 500（美國Illumina公司）；PMSF（Amresco 0754 Biosharp公司），Leupeptin（Amresco J580 Biosharp公司），DTT（Amresco 0281 Biosharp公司）等。

1.3實驗方法

1.3.1尿液外泌體分離每位受試者收集隨機中段尿液標本140 mL，每70 mL尿液中加入350 μL 0.1 mol/L的PMSF和42 μL 0.001 mol/L的Leupeptin，通過超速離心機低溫差速離心法（4℃17 000×g離心30 min；4 ℃ 200 000×g離心60 min）收集外泌體，每70 mL尿液管底沉淀物用56 μL 0.01 mol/L的PBS緩沖液懸浮混勻后加入等體積含60 mg/mL DTT的上樣緩沖液；于恒溫水浴箱中60℃加熱10 min；最后置于-80℃冰箱儲存備用。

1.3.2樣本總RNA的抽提使用TRIzol法提取外泌體中的總RNA，用NanoDrop ND-1000測定樣本總RNA濃度和純度。

1.3.3microRNA表達譜測序在每個樣本總RNA的3′和5′端添加RNA接頭，使用Illumina RT引物和擴增引物進行反轉錄擴增，隨后從PAGE膠上挑選130～150 bp的PCR擴增片段，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer定量文庫。再將樣本滴定到最終濃度8 pmol/L，并根據Illumina NexSeq 500說明書，使用TruSeq Rapid SR cluster Kit在Illumina cBot上進行簇生成。最后使用TruSeq Rapid SBS Kit在Illumina NextSeq 500測序儀上進行50個周期的測序。再計算兩組樣品間各microRNA的差異倍數（Fold change），把區別兩組間差異表達的閾值設定為1.5倍，即上調＞1.5倍的，Fold Change＞1.5，下調＞ 1.5倍的，Fold Change＜ 1/1.5（0.67），組間參數檢驗應用t檢驗，非參數檢驗應用Mann-Whitney秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，最后根據Fold Change和P值篩選差異microRNA，繪制microRNA聚類圖。該測序過程主要由上海康成生物有限公司完成。

1.3.4實時熒光定量PCR先將microRNA逆轉錄成cDNA，然后使用引物設計軟件Primer 5.0設計microRNA與內參基因U6的反應引物，再通過384-PCR板于Real-time PCR儀上進行PCR反應。利用2-△△CT方法分析microRNA相對表達量，再將2-△△CT與Fold change進行比較，驗證microRNA高通量測序結果的準確性。

2 結果

2.1樣品總RNA濃度和純度檢測結果外泌體總RNA經NanoDrop ND-1000檢測，OD260/OD280在1.68～1.74之間，接近于1.80，OD260/OD230均＞ 1.8，基本滿足后續microRNA測序及PCR要求。

2.2microRNA表達譜結果通過高通量測序成功構建高尿酸血癥組和正常對照組尿液外泌體源性microRNA表達譜，共篩選出表達差異的已知microRNA 10種（表1），其中1種上調，為hsa-miR-32，9種下調，分別為hsa-miR-1246、hsa-miR-3615、hsa-miR-1、hsa-miR-204、hsa-miR-126、hsa-miR-320d、hsa-miR-320c、hsa-miR-3158、hsa-miR-6510；并篩選出表達差異的新microRNA 2種（表2），均表達下調，分別為hsa-miR-novel-chr2_38600（AUCUGC）、hsa-miR-novel-chr18_21650（GGAAUG）。

表1 高尿酸血癥組較對照組差異表達的已知microRNATab.1 The differentially expressed known microRNA in hyperuricemia and control group

表2 高尿酸血癥組較對照組差異表達的新microRNATab.2 The differentially expressed new microRNA in hyperuricemia and control group

將表達差異的10種已知microRNA進行聚類分析，繪制分層聚類圖，其樣品聚類特征樹中高尿酸血癥組和正常對照組各聚為一類，說明同組樣本間的該組microRNA表達相似性較強，重復性良好，而組間各樣本該組microRNA表達差異較顯著（圖1），該組差異表達的microRNA可能參與了高尿酸血癥的發生發展，并可能成為診斷高尿酸血癥的新型無創生物標志物。

2.3實時熒光定量PCR結果采用實時熒光定量PCR技術檢測3個microRNA，其中hsa-miR-1和hsa-miR-205 的2-△△CT與 Fold chage相比總體上調、下調趨勢一致且差異倍數相近，但hsa-miR-32的實時熒光定量PCR結果與高通量測序結果相比上調、下調趨勢不符（表3）。因此microRNA高通量測序是一種快速有效篩選差異表達microRNA的方法，其結果可供參考，但仍需實時熒光定量PCR進一步驗證。

圖1 差異表達已知microRNA聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis diagram of differentially expressed known microRNA

表3 實時熒光定量PCR檢測結果與microRNA高通量測序結果比較Tab.3 Comparison of qPCR and high-throughput sequencing microRNA

3 討論

microRNA最早是由LEE等［3］在秀麗隱桿線蟲中發現的，是一類由內源基因編碼的長度約為21-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。尿液中的外泌體能選擇性的富集其來源細胞的多種蛋白質、mRNA、microRNA等，包含了豐富的生物標志物信息，其microRNA比尿液細胞中的更加穩定。

有研究表明，microRNA可以作為多種疾病的生物學標記檢測指標［4］。然而，目前為止國內外尚無針對尿液外泌體源性microRNA與高尿酸血癥的相關報道。本研究首次將高通量測序技術應用于高尿酸血癥患者尿液外泌體中microRNA的檢測，結果發現10種已知microRNA表達差異，其中1種上調，9種下調，另有2種新microRNA均表達下調。

有研究報道，表達上調的miRNA-32在肝癌等惡性腫瘤中表達顯著上調，并可通過PTFN/Akt通路以促進肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力［5］；表達下調的miRNA-1能特異性的表達于心肌細胞和骨骼肌細胞，直接參與心臟疾病的發生、發展及病理生理過程，特別是心肌肥大、心肌梗死等，同時還調控了心肌病理狀態下心律失常的發生發展。XIAO等研究證實，心肌細胞在缺血-再灌注情況下miRNA-204表達下降，而LC3-II表達升高，miRNA-204可能通過調控LC3-II來調節心肌細胞的自溶作用。ROEL等［6］研究認為過表達的miRNA-126與SDF-1/CXCR4依賴的血管內皮祖細胞的動員有關，可通過促進血管再生、調節血管內皮祖細胞動員而維持血管穩態，促進腎臟缺血再灌注損傷后腎功能的恢復。

雖然本研究發現的差異表達的尿液外泌體源性microRNA暫未證實與高尿酸血癥的直接相關性，部分還未有研究，但待今后大樣本、多中心的實時熒光定量PCR進一步論證后，通過生物信息學分析可揭示microRNA的功能及潛在的具體調控機制，為高尿酸血癥發病機制的研究提供依據，減少實驗盲目性。而且高尿酸血癥與痛風密不可分，并與心腦血管疾病、慢性腎臟病，以及2型糖尿病、肥胖等多種代謝性疾病密切相關［7-9］，microRNA在各種相關疾病中的研究可能為今后進一步研究高尿酸血癥與該疾病的相關性提供新的研究方向和依據。

聚類分析圖中差異表達的microRNA組在高尿酸血癥組和正常對照組中組間差異顯著，其差異表達的microRNA組有望成為診斷高尿酸血癥的新型無創生物標志物，并可作為今后治療與監測的靶點。另外，本次測序發現了較多表達差異的新microRNA，亦待今后更深入的研究。