氨基寡糖素與鎂鋅混配對(duì)煙草TMV的防控效果及生理分析

摘 要：通過三生煙草（SamSun N.N）枯斑試驗(yàn)和接種TMV病毒的K326品種煙株體內(nèi)生理指標(biāo)分析，研究了氨基寡糖素與中微肥混配對(duì)煙草花葉病毒（TMV）的體外鈍化、侵染抑制效果和綜合防病效果，以及由其引起的煙葉葉綠素、防御酶活性及病程相關(guān)蛋白等生理指標(biāo)變化。結(jié)果表明：三生煙草枯斑試驗(yàn)中，氨鎂鋅混配劑對(duì)TMV病毒有明顯的體外鈍化和侵染治療效果，病毒抑制率分別比單獨(dú)施用氨基寡糖素提高20.6和10.1個(gè)百分點(diǎn)；K326品種煙株接種TMV病毒施用相應(yīng)藥劑，接種后7、11和30 d時(shí)的病情指數(shù)均以氨鎂鋅混配劑處理<氨基寡糖素單劑

關(guān)鍵詞：煙草花葉病；氨基寡糖素；鎂；鋅；混配

中圖分類號(hào)：S432.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）05-0068-03

Control Effect of Amino Oligosaccharide Combined With Magnesium and Zinc on Tobacco TMV and Tobacco Physiological Analysis

ZHOU Lin-yuan1，LIN Yun-hong2，XIONG Qian2，WANG Li-yuan2，ZHAO Zheng-xiong1

（1. College of Tobacco， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， PRC； 2. Chuxiong Cigarette Factory of Hongta Group，

Chuxiong 661000， PRC）

Abstract：The lesion experiments of SamSun N.N were conducted and the physiological index of K326 was analyzed after inoculated tobacco Mosaic virus （TMV）. In vitro passivation， infection inhibition and comprehensive disease prevention of tobacco were studied， as well as the changes of physiological indexes of chlorophyll， defense enzyme activity and pathogenesis related proteins in tobacco leaf， which caused by amino sugars and micronutrient fertilizer mixed pairs in tobacco Mosaic virus （TMV）. The results showed that in the SamSun N.N lesion test， the ammonia， magnesium and zinc mixture had obvious effect on the in vitro passivation and infection treatment of TMV virus， and the inhibition rate of the virus increased by 20.6 and 10.1 percentage points， respectively， compared with the single application of amino oligosaccharin； K326 tobacco strains were inoculated with TMV virus and then applied the corresponding medicament， and the disease index of 7， 11 and 30 days after inoculation was， ammonia， magnesium and zinc mixture < amino oligosaccharin < CK； the contents of chlorophyll and SOD， POD and PAL activities in the above tobacco plants were the highest in the mixture of ammonia， magnesium and zinc； The relative expression levels of induced course related protein PR3 and PR5 treated by ammonia magnesium zinc mixture increased significantly， reaching 0.79 times and 1.51 times that of the control. This indicated that the mixture of amino oligosaccharide and magnesium and zinc can inhibit TMV infection and increase the resistance of tobacco plants better than the application of amino oligosaccharides alone.

Key words：tobacco mosaic virus； amino oligosaccharide； magnesium； zinc； mixing

煙草普通花葉病（tobacco mosaic virus，TMV）侵染煙株后會(huì)導(dǎo)致煙葉花葉、畸形[1-2]、品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。氨基寡糖素[4]（Amino Oligosaccharins）作為植物免疫激活因子，是從海洋生物中提取的殼聚糖經(jīng)過生物酶解產(chǎn)生的具有生物活性的寡聚糖片斷，用來處理寄主植物后能誘導(dǎo)植物抗性，抑制病毒的侵染增殖[5-6]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有良好的使用效果[7]。植物自身的抗性強(qiáng)弱是影響病害發(fā)生和病情嚴(yán)重程度的因素之一，在抑制病毒的同時(shí)，如能讓受病原侵染的寄主抗性恢復(fù)或增強(qiáng)，對(duì)抵御病原危害有重要的意義。研究表明，鎂對(duì)維持葉綠體結(jié)構(gòu)有重要作用[8]，進(jìn)而影響植物光合作用[9]；同時(shí)，它還是植物酶的重要組成部分以及多種酶的活化劑。鋅可以促進(jìn)植物的光合作用，是生長素吲哚乙酸合成的必需元素，是植物體內(nèi)核糖和蛋白體以及植物體內(nèi)多種酶的組成成分，能夠保持核糖和蛋白體的完整性[10]，并可以通過調(diào)控酶活性提高植物體內(nèi)活性氧的清除能力，同時(shí)還具有促進(jìn)植物蛋白質(zhì)代謝以及提高植物抗逆性等生理功能。基于病毒侵染后煙葉葉面出現(xiàn)黃綠相間癥狀以及光合能力受影響的實(shí)際情況，筆者將天然生物藥劑氨基寡糖素與鎂、鋅混配，進(jìn)行病毒枯斑試驗(yàn)和病毒系統(tǒng)侵染試驗(yàn)，研究藥劑與中微量元素混配對(duì)抑制TMV活性以及增強(qiáng)煙草TMV抗性的影響，并檢測(cè)混配劑處理后煙葉中的病毒抑制率及相關(guān)的生理指標(biāo)，以期為煙草栽培上TMV防治藥劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑：5%氨基寡糖素、稀施鎂、國光鋅，均由楚雄科豐公司提供。

供試植物材料：病毒枯斑寄主為三生煙（SamSun N.N），種子由玉溪煙科所提供，枯斑試驗(yàn)采用半葉枯斑法[19]，選用生長健康的5～6葉期的三生煙進(jìn)行試驗(yàn)。

病毒系統(tǒng)侵染寄主為普通煙（Nicotiana tabacum L）品種K326，選擇6～8葉期、長勢(shì)一致的健壯煙株進(jìn)行試驗(yàn)。

供試毒源：病毒源TMV由實(shí)驗(yàn)室分離，剪取新鮮的帶TMV病毒的煙葉，加入PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH值7.0），研磨成勻漿，用4層紗布過濾掉殘?jiān)牟《驹罕４嬗?℃?zhèn)溆谩２《疽簼舛炔捎眉羧⌒迈r煙葉的質(zhì)量與PBS緩沖液的體積（mL）比來定義，三生煙接種濃度為30 μg/mL，K326接種濃度為50 μg/mL[11]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑配制 （1）5%氨基寡糖素單劑：用150 mL無菌水配5%氨基寡糖素1.8 mL。（2）氨鎂鋅混配劑：150 mL無菌水配5%氨基寡糖素1.8 mL+稀施鎂0.04 g+國光鋅0.02 g。

1.2.2 藥劑抗TMV抑制活性測(cè)定 （1）氨鎂鋅混配劑對(duì)TMV侵染的鈍化作用：選取長勢(shì)一致的三生煙，用氨鎂鋅混配劑與病毒等體積混合鈍化30 min，摩擦接種于處理左半葉；氨基寡糖素單劑與病毒等體積混合鈍化30 min，摩擦接種于處理左半葉；清水與病毒等體積混合鈍化30 min，摩擦接種于處理右半葉，每個(gè)處理接種5個(gè)葉片，重復(fù)3次，3 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)目，并計(jì)算抑制率。（2）氨鎂鋅混配劑對(duì)TMV侵染治療作用：選取長勢(shì)一致的三生煙，先全葉摩擦接種病毒，接種24 h后左半葉涂施氨鎂鋅混配劑，右半葉涂施清水作對(duì)照；左半葉涂施基寡糖素單劑，右半葉涂施清水作對(duì)照；每個(gè)處理接種5個(gè)葉片，重復(fù)3次，3 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)目，并計(jì)算抑制率。

1.2.3 藥劑對(duì)煙草防御酶活性和病程相關(guān)蛋白表達(dá)影響測(cè)定 選取長勢(shì)一致的K326，心葉下第3、4片煙葉摩擦接種TMV，24 h后每天一次連續(xù)3 d葉面噴施氨鎂鋅混配劑；每天一次連續(xù)3 d葉面噴施基寡糖素單劑；每天一次連續(xù)3 d葉面噴施清水作為空白對(duì)照。每個(gè)處理5株煙，重復(fù)3次，接種TMV后4、7和11 d取煙葉樣進(jìn)行調(diào)查。

1.2.4 病情調(diào)查 記錄各處理接種TMV后7、11、18和25 d的發(fā)病株數(shù)及各級(jí)病株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。煙草花葉病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病癥；1級(jí)，心葉明脈，輕微花葉；3級(jí)，花葉明顯，心葉及中部葉片出現(xiàn)花葉；5級(jí)，重花葉，個(gè)別葉片皺縮，畸形，植株輕度矮化；7級(jí)，重花葉，多數(shù)葉片皺縮，畸形，葉脈輕度壞死，植株矮化；9級(jí)，重花葉，皺縮，畸形，葉脈壞死，植株停止生長或死亡。

發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）

相對(duì)防效（%）=（對(duì)照處理病情指數(shù)-藥劑處理病情指數(shù)）/對(duì)照處理病情指數(shù)×100

1.2.5 葉綠素含量、酶活性的測(cè)定 參照楊敏文[12]的方法，首先用丙酮-乙醇混合溶液提取葉綠素，再用分光光度計(jì)測(cè)定溶液對(duì)應(yīng)波長下的吸光度值，最后通過朗伯-比爾定律計(jì)算得出葉綠素的含量。按照文獻(xiàn)[13] 中的方法提取和檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的酶活性。

1.2.6 病程相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病程相關(guān)蛋白表達(dá)[14]，采用RNA試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行抽提，qRT-PCR 定量試驗(yàn)使用（Takara）寶生物工程有限公司（中國，大連）的試劑盒完成。第一鏈反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）第一鏈合成試劑盒（RR047A）；熒光定量檢測(cè)使用abm?EvaGreen qPCR MasterMix-ROX試劑盒。使用2-ΔΔCT 法[15-16]對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。PCR檢測(cè)的相關(guān)引物如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨鎂鋅混配劑對(duì)煙草TMV的抑制效果

由表2可知，氨鎂鋅混配劑對(duì)TMV體外鈍化作用和侵染治療作用的抑制率分別比基寡糖素單劑處理高20.6和10.1個(gè)百分點(diǎn)，說明氨鎂鋅混配劑對(duì)TMV侵染的防效優(yōu)于單劑。

2.2 氨鎂鋅混配劑對(duì)煙株TMV發(fā)病情況的影響

從表3可以看出，同時(shí)期發(fā)病率和病情指數(shù)均表現(xiàn)為CK>單劑>氨鎂鋅混配劑，氨鎂鋅混配劑的相對(duì)防效在34.3%～62.5%，基寡糖素單劑的相對(duì)防效在12.5%～31.6%，說明氨鎂鋅混配劑能延緩發(fā)病和病情發(fā)展，對(duì)TMV侵染表現(xiàn)出較高的防效。

2.3 氨鎂鋅混配劑對(duì)煙葉中總?cè)~綠素含量的影響

從表4可以看出，接種后4、7和11 d各處理的葉綠素總含量表現(xiàn)為氨鎂鋅混配劑>基寡糖素單劑>CK。3個(gè)調(diào)查時(shí)期氨鎂鋅混配劑處理的總?cè)~綠素含量分別比基寡糖素單劑處理的高18.4%、11.4%、5.7%，說明氨鎂鋅混配劑能保護(hù)葉片，降低TMV對(duì)葉綠素的不利影響。

表4 不同接種處理煙草葉片中總?cè)~綠素的含量 （mg/g）

處 理接 種4 d接 種7 d接 種11 d

氨鎂鋅混配劑1.8992.4352.538

氨基寡糖素單劑1.6042.1852.401

CK1.5392.1532.220

2.4 氨鎂鋅混配劑對(duì)煙草防御酶活性的影響

從表5可以看出，與CK相比，經(jīng)過氨鎂鋅混配劑處理，煙葉的SOD酶活性有極顯著性的提高（P<0.01），氨鎂鋅混配劑、基寡糖素單劑處理后煙葉的SOD酶活性分別比CK處理高出49.5%、45.0%；氨鎂鋅混配劑和基寡糖素單劑處理后，煙葉中POD酶活性極顯著得到提高（P<0.01），分別比CK高181.1%

和172.2%；而氨鎂鋅混配劑和基寡糖素單劑處理后，煙葉中PAL酶活性有顯著性的提高（P<0.05），分別比CK高出67.7%和60.2%。這說明氨鎂鋅混配劑提高煙草防御酶活的效果好于基寡糖素單劑。

2.5 氨鎂鋅混配劑對(duì)煙草病程相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由表6可知，經(jīng)過氨鎂鋅混配劑和氨基寡糖素單劑處理的煙葉中病程相關(guān)蛋白PR3和PR5表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），氨鎂鋅混配劑處理的PR3、PR5相對(duì)表達(dá)量分別達(dá)到CK的0.79倍和1.51倍，高于氨基寡糖素單劑處理的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，氨鎂鋅混配劑能明顯抑制TMV的毒性和侵染增殖能力，體外鈍化抑制率為42.2%，侵染治療的抑制率為22.9%，分別比基寡糖素單劑處理高20.6和10.1個(gè)百分點(diǎn)；在盆栽試驗(yàn)中接種TMV 7 d后氨鎂鋅混配劑處理煙株的發(fā)病率僅為33%，低于氨基寡糖素單劑處理的78%和對(duì)照處理的89%，病情指數(shù)也比同時(shí)期的其他2個(gè)處理低；氨鎂鋅混配劑處理后，煙葉中總?cè)~綠素含量在接種后4、7和11 d均明顯高于對(duì)照和氨基寡糖素單劑處理，且呈穩(wěn)定增長趨勢(shì)；防御酶SOD、POD、PAL的活性也明顯高于對(duì)照和氨基寡糖素單劑處理；氨鎂鋅混配劑對(duì)PR蛋白的誘導(dǎo)效果也高于氨基寡糖素單劑，PR3和PR5的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的0.79倍和1.51倍。

從以上試驗(yàn)指標(biāo)可以看出，施用氨鎂鋅混配劑后降低了TMV對(duì)煙葉葉綠素的危害，并且促進(jìn)了植株體內(nèi)的防御類酶活性增強(qiáng)，顯著誘導(dǎo)了病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)TMV有高于氨基寡糖素單劑的防效，由此延緩并減輕了煙株的發(fā)病程度。這說明，將具有抑制病毒功效的藥劑與能平衡維護(hù)植株機(jī)能的營養(yǎng)元素混配，能夠達(dá)到優(yōu)于單獨(dú)施用藥劑對(duì)病害的防控效果，可以在今后的大田生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 謝聯(lián)輝，林奇英. 植物病毒學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004. 3-25.

[2] 許志剛. 普通植物病理學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006. 178-217.

[3] 劉國順. 煙草栽培學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[4] Chen Y F，Zhan Y，Zhao X M， et al. Functions ofoligochitosan induced protein kinase in tobacco mosaic virusresistance and pathogenesis related proteins in tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2009，47（8）：724-731.

[5] 嚴(yán) 凱，宋寶安，楊 松，等. 0.5%氨基寡糖素AS對(duì)煙草TMV的抑制及作用機(jī)制的初步研究[J]. 農(nóng)藥，2007，（4）：280-282.

[6] 孫翠紅，徐翠蓮，丁麗芳，等. 殼寡糖納米銀溶液對(duì)煙草花葉病的防治效果及對(duì)其化學(xué)品質(zhì)的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，50（1）：50-55.

[7] 楊普云，李 萍，王戰(zhàn)鄂，等. 植物免疫誘抗劑氨基寡糖素的應(yīng)用效果與前景分析[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2013，（3）：20-21.

[8] 李 娟. 植物鉀、鈣、鎂素營養(yǎng)的研究進(jìn)展[J]. 福建稻麥科技，2007，25（1）：39-42，30.

[9] 尹永強(qiáng)，何明雄，韋崢宇，等. 煙草鎂素營養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（1）： 60-66.

[10] Cakmak I，Ozturk L，Eker S，et al. Concentration of zinc and activity of copper/zinc-superoxide dismutase in leaves of rye and wheat cultivars differing in sensitivity to zinc deficiency[J]. J PIant PhysioI，1997，（1）：91-95.

[11] 譚 翔. 實(shí)驗(yàn)條件對(duì)心葉煙接種TMV后枯斑產(chǎn)生時(shí)間及數(shù)目影

響[J]. 科技信息，2013，（17）：189-190.

[12] 楊敏文. 快速測(cè)定植物葉片葉綠素含量方法的探討[J]. 光譜試驗(yàn)室，2002，19（4）：478-481.

[13] 王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[14] Fraga D，Meulia T，F(xiàn)enster S. Real-time PCR[J]. Current protocols essential laboratory techniques，2014-02-11，et1003s08.

[15] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J]. methods，2001，25（4）：402-408.

[16] Adnan M，Morton G，Hadi S. Analysis of rpoS and bolA gene expression under various stress induced environments in planktonic and biofilm phase using 2-△△CT method[J]. Molecular and cellular biochemistry，2011，357（1-2）： 275-282.

（責(zé)任編輯：成 平）