索拉菲尼對突變ataxin—3引起的細胞凋亡的影響

王子見 陳融

摘 要：脊髓小腦共濟失調Ⅲ型（spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）又稱馬查多-約瑟夫病（Machado-Joseph disease，MJD），是由于編碼谷氨酰胺的密碼子CAG的異常擴增而引起的1種常染色體顯性遺傳疾病。索拉菲尼是1種新型多靶向性的治療腫瘤FDA藥物，通過構建SCA3細胞模型，利用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）等技術手段，探索索拉菲尼對SCA3細胞模型中突變蛋白ataxin-3引起的細胞凋亡的影響。結果表明，不同濃度的索拉菲尼藥物處理2h后，對SCA3細胞凋亡沒有抑制作用，也沒有毒性作用，但在濃度為1μM時，有抑制細胞凋亡的趨勢；在加藥24h后，對細胞凋亡沒有抑制作用，而且在濃度為100μM和1000μM時，對SCA3細胞模型具有毒性作用。此研究豐富了舊藥新作用，為后續實驗也提供了作用濃度和時間的參考依據。

關鍵詞：脊髓小腦共濟失調Ⅲ型；索拉菲尼；MTT法

中圖分類號 R735.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）18-0015-03

The Effect of Sorafenib Tosylate on Apoptosis Induced by Pathogenic Protein Ataxin-3 in SCA3 Cell Model

Wang Zijian et al.

（College of Biological and Environmental Engineering，Xi'an University，Xi'an 710065，China）

Abstract：Spinal cerebellar ataxia type 3（SCA3），also known as Machado-Joseph disease（MJD），is an autosomal dominant genetic disease caused by abnormal amplification of codon CAG encoding glutamine. Sorafenib tosylate is an FDA drug to treat cancer by the various pathways. Based on the various targets of Sorafenib tosylate，this study proposes that whether it has an effect on SCA3 cells. The effect of sorafenib tosylate on apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 in SCA3 cell model was explored via MTT method and other methods. The results show thart. In this study，sorafenib tosylate did not inhibit the apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 and no toxic effect for 2 hours However，it showed the inhibited tendency at the concentration of 1μM after the treatment of 2 hours. It was also found that sorafenib tosylate showed toxic to cells at the concentration of 100μM and 1000μM after the treatment of 24 hours. This investigation offers new function of old drug and also provides a proof of concentration and treatment time of sorafenib tosylate for further studies.

Key words：Spinocerebellar ataxia type 3；Sorafenib tosylate；MTT method

隨著人口老齡化的加劇，神經退行性疾病的發病率逐年遞增。遺傳性脊髓小腦共濟失調是常見的中樞神經變性疾病，該病有諸多亞型，其中脊髓小腦性共濟失調Ⅲ型（SCA3）是最常見的1種亞型，其致病機制是SCA3中CAG的異常擴增序列導致編碼蛋白ataxin-3的羧基端出現，形成較長的多聚谷氨酰胺肽鏈[1]。該多聚谷氨酰胺肽鏈被認為是細胞形成包涵體的蛋白質基礎，從而產生細胞凋亡，但CAG重復長度與脊髓小腦共濟失調型小腦變性的發生率無關[2]。該病的臨床表現復雜多變，有小腦共濟性失調，眼珠運動障礙等癥狀，因此基因學檢測是診斷該病的最佳手段。目前針對SCA3，臨床上大多為對癥治療或延緩病情，如采用臍帶間充質干細胞治療，在一定程度上能夠改善脊髓小腦性共濟失調患者的臨床癥狀，且較為安全[3]。也有學者提出針對人ATXN3的反義寡核苷酸可能具有良好的耐受性，進行SCA3的預防性治療[4]。有研究發現，丙戊酸鈉對SCA3細胞模型具有神經保護作用[5]。而丙戊酸鈉的不良反應主要集中在10歲以下的兒童[6]，因此該藥針對兒童使用還需進一步探討。針對神經退行性疾病較多的病因，張文婷提出針對神經退行性疾病的多靶點藥物，設計出的PARP-1抑制劑（1-7）[7]具備多功能神經保護作用。

索拉菲尼是1種具有較好抗腫瘤作用的新型靶向藥物，是首個獲準上市的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，該藥的優點包括具備多靶點機制，耐受性好，易于聯合用藥，且患者的依從性也更好。神經退行性疾病比如馬查多—約瑟夫病（Machado-Joseph disease，MJD）、阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）以及帕金森病（Parkinson's disease，PD）等均是由多種病因引起，造成神經細胞死亡的過程也十分復雜。而只是以單個靶點為基礎而設計的藥物在治療這類疾病上并沒有達到令人滿意的效果。現在，對于中樞神經系統紊亂疾病，隨著其致病因素和發病機制不斷被發現，具備多靶點治療作用的藥物也納入研究中，這為治療神經退行性疾病提供了新思路，也為其藥物研究開辟了1個嶄新的領域。目前，對于多靶點功能的索拉菲尼，還沒有在神經退行性疾病上治療的相關研究。本研究主要討論不同時間及濃度的索拉菲尼對SCA3細胞模型的作用，以此為神經退行性疾病的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293細胞由倫敦大學學院薛少安教授惠贈。peGFP-ataxin-3-77CAG質粒由德國圖賓根大學Thorsten Schimdt博士惠贈。索拉菲尼購自Santa Cruz Biotechnology公司（Cat.No.475207-59-1）。

1.2 方法

1.2.1 質粒轉化和提取 取出感受態細胞DH5α（大腸桿菌）于冰上融化，加入質粒，混勻，置于冰上30min；隨后42℃熱擊90s，迅速置冰上，加入不含抗生素的LB培養基混勻，37℃恒溫搖床（150rpm）搖45min。取出菌液，劃線涂板，37℃倒置過夜培養；選取菌落進行挑菌，PCR鑒定。將PCR鑒定成功的菌落挑出，加入培養基，37℃搖床（150rpm）搖菌過夜。次日，取出菌液，離心（2000rpm，10min），棄去上清液，按照GIAGEN plasmid mini kit試劑盒說明書提取質粒，使用Nanodrop2000檢測質粒濃度。

1.2.2 轉染與加藥 按照梭華sofast轉染試劑說明書，取2μg質粒，3μL梭華sofast，100μL培養液，室溫靜置30min，加入到六孔板內。24h后，轉移至96孔板，24h后加藥處理，DMSO為陰性對照組，只含細胞為未處理對照組，藥物時間分別為2h和24h。如圖1所示，濃度依次為“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”，“D”為DMSO陰性對照、“空”為未處理對照組。

1.2.3 MTT法檢測 取出96孔板，每孔加入10μL MTT，放入37℃，5%CO2的培養箱中，4h后取出，離心，小心吸去上層清液，再加入100μL的DMSO，放入恒溫培養震蕩器中孵育10min，保證甲臜能充分溶解，而后將96孔板放入在酶聯免疫檢測儀中，測定于490nm波長時各孔的紫外光吸收值（OD值），分析數據。

2 結果與分析

2.1 SCA3細胞模型的構建 將peGFP-ataxin-3-77CAG質粒轉染至HEK293細胞，48h后，突變ataxin-3蛋白過度表達，收集裂解細胞，Western blot檢測目的條帶。結果顯示，ataxin-3蛋白過表達，SCA3細胞模型構建成功。1H9抗體檢測ataxin-3蛋白，大小為75kD的目的蛋白條帶，β-actin抗體檢測為42kD的actin內參蛋白條帶。條帶1，2和3為3個蛋白樣品。

2.2 索拉菲尼對SCA3細胞模型處理2h的影響 SCA3細胞模型構建成功后，將細胞進行藥物處理，2h后，加入MTT，后加入DMSO溶解細胞形成中的甲臜，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處檢測吸光值（OD值）。統計學分析顯示，索拉菲尼在對SCA3細胞模型處理2h后，不同濃度的藥物處理組和DMSO陰性對照組相比均沒有統計學差異。這表明索拉菲尼對SCA3細胞模型中對突變ataxin-3引起的細胞凋亡沒有作用，同時，該藥物在不同濃度范圍內均對SCA3細胞模型沒有毒性。此外，在藥物濃度為1μM時，與DMSO對照組相比，雖然沒有顯著性，但OD值相對值有增高的趨勢，這表明在該濃度時，藥物可能有抑制細胞凋亡的作用。

以不同濃度藥物處理組和DMSO陰性對照組，分別與空白組的光吸收值的比值為縱坐標，以不同處理組為橫坐標，取3次獨立實驗的平均值，每次獨立實驗重復孔為5個，統計學分析方法為獨立樣本T檢驗。

2.3 索拉菲尼對SCA3細胞模型處理24h的影響 以上實驗表明，2h的作用時間效果可能不明顯，因此下一步將SCA3細胞模型進行藥物處理24h，加入MTT，后加入DMSO溶解細胞形成中的甲臜，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處檢測吸光值。結果顯示，索拉菲尼在對SCA3細胞模型處理24h后，進行統計學分析，對突變ataxin-3引起的細胞凋亡沒有作用，但是，在藥物濃度為100μM和1000μM時，與DMSO對照組相比，具有顯著差異，這表明這2個藥物濃度對SCA3細胞模型有毒性作用。

以相對OD值（不同濃度藥物處理組和DMSO陰性對照組，分別與空白組的光吸收值的比值）為縱坐標，以不同的處理組為橫坐標，取3次獨立實驗的平均值，每次實驗重復孔為5個，進行獨立樣本T檢驗分析。**P<0.01。

3 結論與討論

研究結果表明，索拉菲尼處理2h后的結果進行統計學分析并沒有顯著差異，說明此藥對突變ataxin-3引起的細胞凋亡沒有作用，對SCA3細胞模型也沒有毒性作用，但從圖3可以看出在藥物濃度為1μM時，有抑制突變ataxin-3引起的細胞凋亡的趨勢，可作為后來研究者的參考濃度。而在索拉菲尼處理24h后，濃度為100μM和1000μM時，獨立樣本T檢驗分析，和DMSO對照組比對，具有顯著差異，這說明在24h的藥物處理中，這2個藥物濃度對SCA3細胞模型具有顯著毒性作用。因此，在后續的相關實驗中，應當盡量避免使用這2個濃度。而在其它濃度中均無顯著差異，說明索拉菲尼對SCA3細胞模型沒有毒性作用，因此可以作為后續實驗的參考濃度。綜上所述，在本實驗中，2h時的藥物處理后，在單一濃度1μM時，索拉菲尼有抑制突變ataxin-3引起的細胞凋亡的趨勢；而在加藥處理24h，索拉菲尼毒性加大，不僅沒有抑制細胞凋亡的作用，在濃度為100μM和1000μM，產生細胞毒性作用。本實驗中得到的數據可供后續實驗參考，以及今后研究中，可進一步優化藥物作用時間，在2h和24h之間取不同時間繼續探討索拉菲尼的作用效果。

脊髓小腦共濟失調Ⅲ型（SCA3）是1種遺傳性的神經退行性疾病，該病致病機制復雜，主要是因為編碼谷氨酰胺的密碼子CAG的數量在ATXN3基因中的異常擴增，形成突變的ataxin-3蛋白并匯聚形成包涵體，進而會對細胞產生毒害作用。這個過程已知發生在患者易感腦區的神經元胞核內，但是該過程中的包涵體聚集和致病機制至今不明，也沒有有效的治療藥物，給患者和患者家屬造成了嚴重的身體、經濟和社會負擔。索拉菲尼是1種新型多靶點抗腫瘤藥物，具有雙重的抗腫瘤作用：一方面通過抑制由RAF/MEK/ERK介導的細胞信號傳導通路而直接抑制腫瘤細胞的增殖，另一方面通過抑制血管內皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子（PDGF）受體而阻斷腫瘤血管的形成，間接地抑制腫瘤細胞的增殖和轉移[8]。為了尋找有效藥物來預防及治療該疾病，根據索拉菲尼多功能靶點功效，本研究通過構建脊髓小腦共濟失調Ⅲ型（SCA3）細胞模型，以發病的病理現象（致病蛋白ataxin-3引起的細胞凋亡）作為出發點，利用MTT，Western blot等技術手段，探索索拉菲尼對SCA3細胞模型中致病蛋白ataxin-3引起的細胞凋亡的影響，驗證索拉菲尼是否對SCA3細胞模型具有保護作用，從而為該病的治療提供1種新的思路。

參考文獻

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（責編：王慧晴）