非小細胞肺癌患者ALK表達與臨床病理特征對比分析

王 弦 李曉燦 江冬瑞 葉飛飛 吳 強

近年來，隨著腫瘤學和分子生物學技術的快速發展及對肺癌的發生發展、轉移分子機制方面的深入研究，以分子靶向診療為核心的“精準醫療”概念被人們所提出并應用到臨床中，給肺癌的治療帶來了新的契機[1]?？诉蛱婺崾轻槍ML4-間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)新的治療靶點，全球每年新發肺癌ALK突變陽性患者約有6.8萬人，這些患者均可從靶向治療藥物克唑替尼中獲益[2-3]。因此，開展針對EML4-ALK融合基因的檢測具有重要的臨床意義?；诖?，為研究肺癌患者EML4-ALK融合基因的陽性率，提高肺癌診治水平，本研究選取100例NSCLC患者為研究對象，采用CSCO腫瘤生物標志物專家委員會專家組所推薦的全自動免疫組化的方法檢測ALK的表達，并與患者的臨床病理特征進行統計分析，以期為相關疾病的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 抗ALK兔單克隆抗體(D5F3)、陰性質控抗體、OptiView DAB免疫組化檢測系統和增強試劑盒[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；Ventana Bench Mark XT全自動免疫組化儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；正電荷黏附載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)。

1.2 研究對象 選取安徽醫科大學第二附屬醫院2016年1月至2017年10月收治的經病理診斷確診為非小細胞肺癌的100例患者作為研究對象，所有患者診斷標準均依照WHO(2015年)肺腫瘤分類?；颊吣挲g42～82歲，平均 (62.50±8.00)歲；男性59例，女性41例；48例有吸煙史，52例無吸煙史；腫瘤直徑≤5 cm的77例，腫瘤>5 cm的23例；左肺腫瘤42例，右肺腫瘤58例；腺癌84例，非腺癌16例；有淋巴結轉移42例，無淋巴結轉移58例。采集基本臨床特征資料：年齡、性別、吸煙史、腫塊直徑、發生部位、病理分型和淋巴結轉移等。所有數據采集均征得患者同意并簽署知情同意書。

1.3 方法 所有標本均采用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，制作石蠟標本后進行組織切片，切片厚度為4 μm，分成陰性質控片組和檢測片組。其中，在檢測片組撈取1個正常闌尾切片作為陽性對照組。按照羅氏公司ALK蛋白檢測說明流程上機檢測。

1.4 判讀標準 采用二元判讀法，根據是否存在二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)信號，每位患者均同時判讀ALK抗體檢測片和相應的陰性質控片。陰性質控片評估非特異的背景染色和已知會因特定組織成分而染色的背景染色強度；ALK(D5F3)抗體檢測片上正常闌尾的神經節細胞DAB顯色作為陽性對照，幫助判斷此張切片染色是否成功；待檢組織腫瘤細胞標準為：陽性為腫瘤細胞中存在很強的顆粒狀胞漿染色(任何百分比的陽性腫瘤細胞)；陰性為腫瘤細胞內不存在強顆粒狀胞漿染色。其中，診斷為陽性時需排除已知的染色元素，包括：肺泡巨噬細胞中較淡的胞漿點彩；神經來源的細胞(神經細胞和神經節細胞)；腺狀上皮染色，以及淋巴細胞性浸潤中的細胞。另外，NSCLC患者正常黏膜(包括黏蛋白)內以及壞死組織區域內可見一些背景染色也應從臨床評估中排除。

1.5 統計學方法 應用SPSS 21.0進行統計分析，計數資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALK在NSCLC患者中的表達 ALK陽性可見很強的顆粒狀棕黃色胞漿染色，主要表達定位于肺癌組織的細胞質；ALK陰性未見任何顆粒性棕黃色陽性信號；陽性對照組神經節細胞呈陽性，見圖1。100例NSCLC患者中，有6例ALK陽性，陽性表達率為6.00%。

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者ALK表達比較 不同年齡區間患者的ALK陽性表達率進行比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同腫塊直徑間患者的ALK陽性表達率進行比較，差異有統計學意義(P<0.05)；不同病理分型間患者的ALK陽性表達率進行比較，差異有統計學意義(P<0.05)。而不同性別、是否吸煙、發生部位以及是否淋巴結轉移間患者的ALK陽性表達率進行比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

3 討論

肺癌是當今世界危害人類健康最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發病率近年呈逐年升高的態勢，其病死率已躍居首位，且5年生存率較低[4-5]。我國是肺癌的高發國家之一，發病率及病死率都高于世界平均水平。NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞癌和類癌等。傳統的一線化療藥物鉑類在肺癌的治療中一直處于主導地位，但由于傳統的化療藥物缺乏組織特異性，且長期用藥對患者身體帶來非常大的副作用，是肺癌治療方面多年來所面臨的難題之一[6-7]。

ALK是一種由人類ALK基因編碼的酶，又被稱為酪氨酸激酶受體或CD246，是胰島素受體超家族成員之一[8]。ALK在大腦的發育過程中扮演著重要的角色，由于其編碼的酪氨酸激酶只在一定的神經元細胞中表達，因此只對神經系統中的特定神經元產生影響。作為一種新的受體酪氨酸激酶，ALK基因在細胞生理活動中發揮重要的調控作用，其異常表達時常通過擴增、突變和形成融合基因等方式產生強致癌驅動基因，從而導致肺癌、淋巴瘤、神經母細胞瘤等腫瘤的產生[9]。1994年，Morris等[8]發現ALK以NPM-ALK融合蛋白的形式存在于間變性大細胞淋巴瘤；2007年，Soda等[10]發現EML4與ALK基因在約6.7%的NSCLC患者中發生融合突變。EML4-ALK融合基因由第2號染色體插入形成，其編碼的蛋白產物可導致ALK酪氨酸激酶持續高表達，從而激活下游的PI3K-AKT、MAPK及JAK-STAT等信號傳導通路，導致腫瘤的發生和轉移，在NSCLC中發揮重要的驅動作用，被認為是NSCLC新興的生物標記物和治療靶標，對肺癌的臨床診療具有十分重要的生物學意義。

克唑替尼作為ALK融合基因的小分子靶向藥物，在臨床治療中顯示出強大的抗腫瘤活性。因此，準確地檢測ALK并研究總結其臨床病理特征顯得尤為重要。Wang等[11]研究發現，4981例NSCLC患者中有405例ALK表達陽性，其預后明顯好于ALK陰性患者，且患者的吸煙狀況也影響ALK基因相關的NSCLC患者的預后。Inamura等[12]發現EML4-ALK融合基因主要存在于輕度吸煙者(每年少于10包)或不吸煙的的腺癌患者中，并且與表皮生長因子受體或鼠類肉瘤病毒癌基因突變無關。Dai等[13]研究表明對ALK陽性的NSCLC患者使用ALK抑制劑可能會增加放療的局部控制效果，針對晚期的NSCLC患者在放療之前進行ALK檢測，繼而通過聯合ALK抑制劑和放療，從而為臨床提供一種毒性較低的治療方案。

本研究采用全自動免疫組化法檢測了100例NSCLC患者的ALK蛋白的表達情況，結果顯示ALK主要表達定位于肺癌的細胞質中，且NSCLC患者的ALK陽性表達率為6.00%，與黃曉琳等[14]研究(3%～8%)數據一致。分析發現，ALK陽性患者41～60歲人群的占比較高；女性和不吸煙者占優勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。ALK陽性患者組織學類型以腺癌為主，且腫瘤直徑以≤5 cm居多，但腫瘤的發病部位沒有顯著特征；另外，淋巴結轉移率高于ALK陰性患者，但差異無統計學意義。根據國內相關研究[14-16]，ALK陽性患者以年輕、女性、不吸煙及腺癌為主要特征，本研究顯示出同樣的結果。然而本研究將不同性別、吸煙史、發生部位以及是否淋巴結轉移間患者ALK陽性表達率進行相比，差異無統計學意義(P>0.05)，這可能由于本研究的病例數較少，從而導致陽性樣本偏少引起的偏差。另外，本研究發現腫瘤直徑可能成為ALK陽性患者的潛在特征，下一步研究中將擴大樣本量進一步證實，有望為NSCLC的臨床診療提供新的理論依據和參考。