加味溫膽湯對抑郁模型大鼠下丘腦神經元超微結構的影響

宋瑞雯，張麗萍，陳穎，徐磊

(天津中醫藥大學，天津 300193)

抑郁癥是一種以情緒持續低落為主要癥狀的身心疾病，因其病因和發病機制尚不明確、發病率逐年上升及高致殘致死率已成為國際精神醫學界亟待解決的難題。研究表明：慢性、低強度且長期的應激性生活事件不僅是誘發抑郁癥的重要原因[1]，還能導致一系列中樞神經系統可塑性的改變。已有研究表明，下丘腦與情緒反應的關系密切相關，但目前相關研究多集中在應激后大鼠額前皮質區和海馬CA1區、CA3區神經結構可塑性方面，尚未見對慢性應激后大鼠下丘腦神經元超微變化的研究[2-3]。課題組前期臨床療效觀察證實，加味溫膽湯對抑郁癥患者情緒低落、睡眠障礙、食欲不振等癥狀具有良好療效，且胃腸道不適等副作用顯著低于西藥氟西汀[4-5]；前期機制研究發現，本方可改善抑郁模型大鼠海馬CA3區超微神經元結構萎縮[3]。本研究在前期臨床療效、作用機制研究的基礎上，進一步分析加味溫膽湯對慢性應激抑郁模型大鼠下丘腦神經元超微結構變化的影響，以期進一步闡釋加味溫膽湯抗抑郁的病理形態學基礎。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體質量(200±20)g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心，生產合格證號 SCXK(軍)2014-4401。

1.2 藥物及試劑

加味溫膽湯由竹茹、半夏、枳實、陳皮、遠志、合歡花、茯苓和郁金等藥物組成，均購買于天津同仁堂藥店，經傳統水煎法制備濃縮浸膏；鹽酸氟西汀片(美國禮來公司，20 mg/粒) ，使用前雙蒸水配制成藥液。

1.3 儀器及試劑

自制曠場實驗箱，日本日立H-7500透射電子顯微鏡，徠卡UC-7超薄切片機，德國 EPPENDORF移液器。3%多聚甲醛、4℃預冷1%戊二醛，37℃預熱0.9%生理鹽水，10%水合氯醛、4%戊二醛、輸液器由賽東南試劑公司提供。1/15M磷酸緩沖液、1%四氧化鋨、丙酮、包埋液、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛由河北醫科大學電鏡實驗中心提供。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥

參照隨機數字表法將32只SD大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、氟西汀組(簡稱西藥組)和加味溫膽湯組(簡稱中藥組)。空白組每日正常進水、進食，每籠8只；其余3組1只/籠，連續造模3周后，模型組灌胃給予生理鹽水2 mL/(kg·d)，西藥組灌胃給予氟西汀溶液1.8 mg/(kg·d)，中藥組灌胃給予加味溫膽湯煎劑12 g/(kg·d)，每日早晨8：00開始，持續給藥4周。

2.2 動物模型制備

除正常組外，其余各組持續3周接受9種未預知的應激刺激，分別是：24 h禁食，24 h禁水，夾尾1 min，懸尾1 min，通宵照明，45℃烘箱熱烘5 min，4℃冷水游泳5 min，高速水平振蕩鼠箱3 min，100伏交流電電擊足底1 min。3周內逐日隨機給予1～2種刺激，期間每種刺激方式出現不少于2～3次，但同一種刺激不可持續出現，使動物不能預知每日即將給予的刺激方式。

2.3 觀察指標

2.3.1 體質量變化

造模前、造模3周及給藥4周后分別稱取大鼠體質量，計算各組大鼠的體質量增長數(△W)，比較各組大鼠體質量變化趨勢。

△W1=W(造模3周后體質量)-W(造模前體質量)

△W2=W(給藥4周后體質量)-W(造模3周后體質量)

2.3.2 曠場試驗

以大鼠四爪均進入方格內穿越曠場試驗箱底面格子數計為水平活動得分；以大鼠兩前爪騰空或攀爬于墻壁使全身直立記為垂直活動得分，兩者總和為曠場試驗得分。分別測定各組大鼠造模前、造模3周后及給藥4周后水平活動得分和垂直活動得分，計算各組大鼠曠場試驗總分，3 min/次，比較各組大鼠曠場試驗變化趨勢。

2.3.3 透射電鏡

糖水實驗、曠場試驗結束后每組隨機選取4只大鼠，腹腔麻醉大鼠，心臟灌注內固定液，取2～3塊大小為1 mm×1 mm×1 mm的下丘腦組織標本，4%戊二醛固定至少2 h，1%四氧化鋨后固定2 h，梯度丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，烤箱60℃固化48 h，超薄切片機將下丘腦樣品切成厚約50 nm的切片，醋酸雙氧鈾浸泡45 min，檸檬酸鉛浸泡30 min，進行電子染色。置于透射電鏡下觀察下丘腦神經元超微結構的變化，包括細胞核、線粒體、粗面內質網、高爾基體等情況。

2.4 統計方法

3 結果

3.1 體質量變化情況

造模3周后：與空白組比較，模型組、西藥組和中藥組體質量增長數有明顯統計學差異(P<0.01)；模型、西藥、中藥組之間對照，體質量增長數無明顯統計學差異(P>0.05)。

給藥4周后：與空白組比較，模型組體質量增長數減少有顯著統計學差異(P<0.01)；與模型組對照，西藥組和中藥組體質量增長數有統計學差異(P<0.05)；西藥組和中藥組組間相對比，體質量增長數無明顯統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量增長數結果比較

注：與空白組比較，△P<0.01；模型組比較，▲P<0.01，▲▲P<0.05

3.2 曠場試驗

造模3周后：與空白組相比，模型組、西藥組和中藥組中藥組曠場試驗得分有顯著統計學差異(P<0.01)；模型組、中藥組和西藥組3組之間曠場試驗得分無明顯統計學差異(P>0.05)。

給藥4周后：模型組與空白組相比，曠場試驗得分有明顯統計學差異(P<0.01)；中、西藥組之間對比，曠場試驗得分無明顯統計學差異(P>0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組曠場試驗得分有明顯統計學差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠曠場試驗運動得分比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

3.3 電鏡觀察結果

正常組大鼠神經元線粒體結構基本完整，嵴排列規則，基質密度正常，粗面內質網排列整齊，膜表面分布大量核糖體。模型組：電鏡下超微形態變異較明顯，細胞體腫脹變性，線粒體存在不同水平的腫脹、線粒體膜、嵴產生溶解和斷裂現象，線粒基質分布不勻、電子密度下降，嚴重者呈現融合消散征象；粗面內質網的數量減少，并出現不規則擴張、折疊、斷裂、盤曲、細胞空化，膜結構明顯破損。中藥組和西藥組下丘腦神經元結構接近正常狀態，細胞核內異染色質增加程度較輕，核邊緣光滑，核周間隙較為正常；較少數線粒體形態輕度腫脹，基質分布較均勻，電子密度略增加；粗面內質網和高爾基體正常，與模型組比，神經元受損程度明顯減輕。如圖1。

圖1 電鏡下各組大鼠神經元結構

4 討論

目前，已有較多的國內外文獻報道神經系統可塑性變化與應激反應關系密切，且以往文獻對應激后中樞神經可塑性變化的研究大多集中在大鼠海馬與額前皮質兩部位，電鏡下觀察可見：大鼠接受應激刺激后，額前皮質區突觸前膜的突觸囊泡密度和突觸后膜的致密物厚度均會降低，出現異常的突觸超微形態結構[2]；慢性應激性抑郁可導致大鼠海馬CA1區神經元突觸可塑性發生改變[3-4]，證實了慢性應激的確可以造成中樞神經系統產生可塑性變化。下丘腦作為中樞神經系統中調節內臟活動的高級中樞，下丘腦可塑性與應激的關系也已得到了的證明：光鏡下，與對照組比較，慢性應激大鼠下丘腦神經細胞間隙減少，空泡減少，排列略紊亂，細胞質染色加深，核增大、色深[6]。可見，慢性應激使大鼠下丘腦一般結構發生了變化，但其超微結構變化相關研究尚未見報道，嚴重制約了深入研究下丘腦神經可塑性在抑郁癥發生發展過程中的作用機制。

鑒于此，本實驗在前期工作基礎上，進一步探討中藥復方加味溫膽湯對慢性應激模型大鼠下丘腦神經元超微結構的影響。行為學表明：造模3周后，與正常組對照，體質量增長數和曠場試驗得分上，模型、西藥和中藥組具有顯著統計學差異(P<0.01)，而模型、西藥和中藥組之間得分無統計學差異(P>0.05)，說明抑郁模型制備成功；給藥4周后，與正常組比較，模型組大鼠的體質量增長數、曠場實驗得分顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠體質量增長數、曠場實驗得分顯著增加(P<0.01)。透射電鏡結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠電鏡下下丘腦神經元嚴重受損，超微形態結構發生顯著改變；與模型組比較，中藥組和西藥組的線粒體、粗面內質網雖然受損，但下丘腦神經元受損程度總體比模型組顯著減輕，說明慢性應激可以導致大鼠下丘腦組織線粒體、內質網、糖原顆粒的損傷，使部分細胞出現凋亡改變，這從形態學上證明了慢性應激可誘導大鼠出現下丘腦神經元超微結構改變，加味溫膽湯可能是通過減輕抑郁模型大鼠下丘腦神經元超微結構損害而改善抑郁樣行為。