川芎嗪通過抗氧化及抗炎作用改善脊髓損傷

都芳濤，方繼峰，李興晶，喬培柳，李廣義

(山東泰山醫學院附屬聊城市第二人民醫院骨外科，山東 臨清 252600)

脊髓損傷可導致四肢及軀體受損部位功能障礙，導致嚴重并發癥，包括骨髓水腫與受損部位的細胞凋亡，甚至終生殘疾及死亡[1]，這種損傷包括急性損傷與二次損傷。急性脊髓損傷可導致脊髓部分或全部破裂[2-3]。原發性脊髓損傷可降解關鍵的細胞骨架及活性功能蛋白，導致病變部位及其周圍神經元與膠質細胞的遲發性死亡[4-5]。原發性損傷是機械損傷，是不可避免的[6]，而二次損傷可通過干預進行避免[7]。大量研究都致力于了解脊髓二次損傷的機理，以達到開發出可以改善甚至是逆轉脊髓損傷的治療方法。川芎嗪是中藥川芎中的生物堿，有擴張血管、抑制血小板聚集的作用[8]。研究發現川芎嗪可以減輕腦損傷、促進神經功能恢復[9]。另外，川芎嗪可以抑制淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤及促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)的表達，降低炎癥相關的信號分子和細胞核因子κB的活性，促進缺血神經元和巨噬細胞/小膠質細胞內核因子E2 、相關因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達，發揮抗炎和神經保護作用。然而，川芎嗪針對脊髓損傷的作用機理大部分處于未知狀態。本研究主要是通過對照研究川芎嗪對脊髓損傷的保護作用，結果發現川芎嗪可能通過提高Nrf2-GCLc/GCLm信號通路促進脊髓損傷的康復，從而改善氧化應激及炎癥反應，促進脊髓功能的恢復。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月—2018年5月在我院治療的90例脊髓損傷患者，46名男性和44名女性；年齡45～67歲，平均(55.56±9.54)歲。分為對照組、高劑量川芎嗪組和低劑量川芎嗪組，平均每組30人，兩組間性別、年齡無差異(P>0.05)。見表1。

表1 患者一般情況比較

1.2 分組與給藥

對照組患者在治療過程中靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液，連續靜滴14 d。高劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+240 mg川芎嗪，連續靜滴14 d。低劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+120 mg川芎嗪，連續靜滴14 d。

1.3 實時定量PCR

患者靜脈滴注療程結束后進行腰椎穿刺抽取腦脊液進行檢測，根據廠家說明書(天根生化科技北京有限公司)，采用Trizol法提取總RNA。并對cDNA進行逆轉錄，而后采用實時定量PCR進行樣品分析(BIORAD CFX96實時平臺，SYBR Premix Ex TaqTM II)。基因的表達歸一化到β-肌動蛋白水平，并采用2-△△Ct進行對比分析。

1.4 促炎性細胞因子的生化檢測

抽取患者腦脊液后根據廠家的說明書，采用酶聯免疫試劑盒測定其中的IL-1β、TNF-α、Nrf2及GCLc與GCLm的含量(BioVision公司)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 川芎嗪對炎癥反應的作用

炎癥反應與脊髓損傷的病情發展密切相關，研究顯示抗炎作用能改善脊髓損傷[10-12]。本次研究中，我們評估了川芎嗪對脊髓損傷患者體內炎癥的作用。如表2所示，與對照組患者相比，給予川芎嗪靜滴的脊髓損傷患者的腦脊液中的TNF-α與IL-1β的mRNA表達明顯降低。

表2 川芎嗪對TNF-α和IL-1β含量的影響

2.2 川芎嗪對氧化應激反應主要調節因子的作用

脊髓損傷患者體內Nrf2(一種重要的氧化還原控制因子)的mRNA表達顯著降低。攝入川芎嗪可以顯著抑制脊髓損傷患者體內Nrf2的表達降低。另外，GCLc與GCLm的mRNA表達在挫傷性脊髓損傷后顯著下調。川芎嗪可以顯著上調GCLc與GCLm的mRNA表達。見表3。

表3 川芎嗪對Nrf2、GCLc、GCLm含量的影響

3 討論

川芎嗪主要成分為2，3，5，6-四甲基吡嗪，是從川芎根莖中提取分離的生物堿單體，有促進神經功能恢復，減輕腦損傷的作用[10]，該物質可能存在保護神經及促進神經元再生的作用，但目前關于川芎嗪對脊髓損傷后神經元再生的作用機理的研究較少。此次研究中，我們抽取脊髓損傷患者腦脊液進行實時定量PCR測定和促炎性細胞因子的生化檢測，以此評估川芎嗪對脊髓損傷恢復作用過程中抗氧化及抗炎癥活性的作用。

炎癥反應與脊髓損傷的病情發展密切相關，降低炎癥反應可以改善脊髓損傷，促進脊髓的恢復[11-12]。有研究表明，脊髓損傷后IL-1β含量上升是慢性損傷的重要信號[13]。脊髓損傷的炎癥反應與TNF-α相關聯，其表達下調可以促進脊髓損傷的修復[14-15]。研究發現川芎嗪可抑制脊髓損傷過程中炎性反應，主要通過IL-1β與TNF-α的表達反映出來。先前研究表明川芎嗪可以抑制大鼠急性損傷后脊髓組織中巨噬細胞移動抑制因子、NF-Kβ及IL-1β的表達，阻止白細胞的浸潤，促進NF-Kβ抑制蛋白和抗炎細胞因子IL-10的表達，達到減輕急性脊髓損傷后炎癥反應的目的[11]。川芎嗪還能抑制脊髓損傷小鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA的表達，調節小膠質細胞的活化，抑制小膠質細胞活化和中性粒細胞浸潤，延遲脊髓繼發性損傷和保護脊髓[9]。川芎嗪無論劑量大小均可降低腦缺血組織中EDI、IL-1β和TNF-α的表達，抑制缺血區的炎癥反應，進而保護腦組織[16]。結合以上結果我們發現，川芎嗪的抗炎作用可能與脊髓損傷的恢復有關。在本研究中，通過利用在治療脊髓損傷患者過程中靜滴川芎嗪探討患者腦脊液中炎性因子的表達中發現，脊髓損傷患者在給予靜滴川芎嗪后TNF-α和IL-1β的表達明顯下降，川芎嗪對于減輕脊髓損傷具有重要作用。

氧化應激反應可以影響脊髓損傷的發病及發展[17]。川芎嗪通過抗氧化、抗凋亡等途徑對腦組織進行保護。實驗研究發現[18]，川芎嗪可通過提高核因子E2相關因子2(Nrf2)和谷氨酰半胱氨酸鏈接酶(GCLc)的蛋白表達，促進谷胱甘肽的合成，降低ROS水平，阻斷細胞凋亡，恢復線粒體功能，改善氯化鈷誘導的氧化應激和腦神經損傷，達到保護腦神經的作用。川芎嗪還可提高Nrf2和GCLc的表達抑制MPTP誘導的大鼠大腦黑質氧化應激損傷[19]。與既往研究不同，此次研究通過針對脊髓損傷患者治療過程中靜滴川芎嗪，抽取腦脊液測定相關因子的PCR表達，發現氧化應激相關因子，例如Nrf2、GCLc、GCLm的mRNA表達明顯增加，大劑量應用川芎嗪的脊髓損傷患者增加更為明顯，成正相關性，這說明川芎嗪對于脊髓損傷患者的氧化應激反應有重要作用，這對于以后在臨床上應用川芎嗪治療脊髓損傷患者提供了新的方向。

另外，臨床藥理實驗證明，川芎嗪具有抗血小板聚集作用，可改善微循環，抗氧化、抗纖維化和拮抗Ca2+內流，進而擴張血管、改善微循環，保護血管內皮細胞[20-23]。動物實驗研究表明，川芎嗪可降低缺血再灌注后大腦皮質腫瘤壞死因子-α含量和髓過氧化物酶活性，減輕炎癥反應，保護腦缺血大鼠的腦神經[24]。此次研究我們進一步驗證：川芎嗪可改善氧化應激反應及炎癥反應，降低脊髓損傷，促進脊髓損傷患者的恢復，這些結果為川芎嗪治療相關的脊髓損傷與神經退行性疾病提供了新的視角。