諾麗果發酵液抑制肝癌細胞Bel7402增殖及促凋亡作用觀察

范海能，蘇定志，王謙，馮華諾，張叢，魯琰，吳英日*

(1.中國人民武裝警察部隊三亞療養院，海南 三亞 572000；2.海南省衛生學校，海南 海口 570311；3.海南醫學院，海南 海口 571199)

諾麗(Noni)，學名Morinda citrifolia，又稱海濱木巴戟、海巴戟天、諾尼，屬茜草科巴戟天屬植物，諾麗主要生長在南太平洋群島，在我國主要分布在臺灣、海南及西沙群島等地。

諾麗果在波利尼西亞地區已有兩千多年的歷史，目前在國外已是一種常見的食物。有研究發現[1-3]，諾麗果富含20多種氨基酸、維生素C、多糖、環烯醚萜、蒽醌類等多種有效成分，具有體外抗腫瘤、抗氧化、抑菌消炎等活性[4];諾麗葉含有黃酮、皂甙、多糖等活性成分，種子含有甾醇類、東莨菪亭[5-6]等活性成分。目前，諾麗果已被應用于許多領域。例如：抗癌、抗炎、抗氧化以及保護人體器官等[7-9]。

肝癌(HCC)是全球第五大癌癥，而其死亡率卻居全球第三。其中50%以上的肝癌患者分布在中國內地[10]。據統計，我國每年死于肝病的人數是30萬，其中約有11萬人死于肝癌[11]，肝癌已經成為我國嚴重的健康問題。所以尋找肝癌特效的治療藥物成為了亟待解決的問題。近年來，隨著世界范圍內“回歸自然”浪潮的涌起，人們開始將新藥研發的目光轉向天然抗腫瘤藥物上，特別是一些天然抗腫瘤藥物的發現，極大地鼓舞了科學家們從天然產物中創制抗腫瘤新藥的信心。

作為一種廣為流傳的藥用植物,諾麗果已經被應用于治療流感、糖尿病、高血壓、腫瘤等[12-16]。但是關于諾麗果對肝癌的影響等方面的研究目前尚未見報道，那么它對肝癌的增殖和凋亡是否有影響呢？以及其具體的分子機制又是如何呢？這引起了我們極大地興趣。所以本研究在體外用諾麗果發酵液處理肝癌Bel7402細胞，探討諾麗果發酵液對肝癌細胞的增殖和凋亡情況的影響。為下一步研究諾麗果發酵液組份對肝癌細胞凋亡的影響和機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

超凈工作臺(上海蘇凈實業有限公司);CO2恒溫培養箱(上海迅能電熱設備有限公司);發酵罐(溫州市億一機械有限公司);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);酶標儀(美國伯樂iMark);流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

胎牛血清(批號:13011-8611)購自杭州四季青生物公司;DMEM培養液(批號:12100)、MTT試劑盒(批號:M1020)購自索萊寶生物技術有限公司;二甲基亞砜(批號:A100231 )購自上海生工生物技術有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒(批號:C1062)、DAPI染色液(批號:C1005)購自上海碧云天生物技術有限公司;人肝癌細胞 Bel7402細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 諾麗果發酵液的制備

取5 kg新鮮成熟的諾麗果于發酵罐中，密封室溫自然發酵40 d取汁，過濾取清液，最后用0.22 μm的濾膜過濾后-20℃保存待用，參照文獻[2,17]，在臨用前用培養基稀釋發酵液。取7.5 mL發酵原液加入細胞培養基定容到10 mL即為75%的發酵液，取5 mL發酵原液加入細胞培養基定容到10 mL即為50%的發酵液。發酵液原液即為100%的發酵液。

1.3 細胞培養

肝癌細胞Bel7402培養于10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.4 MTT測細胞增殖抑制率

取對數生長期的人肝癌細胞Bel7402，胰酶消化后調整細胞濃度為 2×105/mL，制成單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養過夜待細胞貼壁。空白對照組加入20 μL DMEM培養基，實驗組每孔加入20 μL濃度分別為50%、75%、100%的諾麗果發酵液藥液，每組設5個平行復孔。藥物作用24 h、48 h后，每孔加入濃度為 5 g/L 的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，吸去培養上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩5 min，使結晶物充分溶解。酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度。按照公式

1.5 流式細胞儀分析細胞凋亡情況

取對數生長期的人肝癌細胞Bel7402，胰酶消化后調整細胞濃度為2×105/mL，制成單細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養過夜待細胞貼壁。然后將培養液加入400 μL不同濃度的諾麗果發酵液，藥物作用72 h后，收集全部細胞，PBS洗滌2次，先加入400 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再加入Annexin V-FITC和PI各10 μL，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測熒光強度，計算凋亡細胞的百分率。

1.6 DAPI染色檢測細胞凋亡情況

將Bel7402細胞按1×105個每孔的密度接種于預先放有蓋玻片的24孔板中，每孔1 mL培養基，分為2組，每組3個孔。培養24 h后，向孔中加入200 μL諾麗果發酵液原液。培養48 h，取出蓋玻片，PBS反復洗滌3次，再加入0.5 mL固定液固定2 h，PBS繼續洗滌2次。再加入0.5 mL DAPI染色液，染色15 min。倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞核形態并拍照記錄。

1.7 Western blotting檢測Survivin基因的表達

將Bel7402細胞按1×105個每孔的密度接種于24孔板中，每孔1 mL培養基，分為2組，每組3個孔。培養24 h后，向實驗組各孔中加入200 μL諾麗果發酵液原液。培養48 h后加入100 μL蛋白裂解液4℃裂解30 min，12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清進行蛋白定量。總蛋白加入上樣緩沖液后100℃變性10 min。取50 μg樣品總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、封閉后加入1∶1 000稀釋的Survivin單克隆抗體4℃孵育過夜。次日洗膜后再加入羊抗兔二抗，37℃孵育1 h后化學發光顯影。

1.8 統計學方法

2 結果與分析

2.1 諾麗果發酵液對Bel7402增殖的抑制作用

MTT結果顯示,濃度為50%、75%、100%的諾麗果發酵液藥液作用于肝癌細胞Bel7402后肝癌細胞的增殖均受到不同程度的抑制，且抑制效率呈明顯的劑量依賴關系(見表1)。這說明諾麗果發酵液在體外能夠抑制肝癌Bel7402細胞的增殖。

表1 諾麗果發酵液對Bel7402增殖的抑制率

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 流式細胞儀分析細胞凋亡情況

圖1a是流式細胞儀檢測的細胞凋亡情況，其中每張圖的左下象限代表正常細胞群，右下象限代表早期凋亡細胞群。圖1b是由細胞凋亡比例生成的數據直方圖，從圖中我們可以發現與對照組相比，實驗組凋亡率顯著升高，同時諾麗果發酵液作用Bel7402細胞后，細胞凋亡比例隨著發酵液濃度的升高細胞凋亡率也出現了明顯的上升趨勢。這說明諾麗果發酵液在體外能誘導肝癌Bel7402細胞凋亡，并且細胞凋亡率與發酵液濃度密切相關。

注：A.對照組肝癌細胞;B.經濃度為50%的發酵液處理過的肝癌細胞;C.經濃度為75%的發酵液處理過的肝癌細胞;D經濃度為100%的發酵液處理過的肝癌細胞;與空白對照組比較，*P<0.05圖1 諾麗果發酵液對Bel7402細胞凋亡情況的影響

2.3 DAPI染色法檢測細胞凋亡情況

細胞經DAPI染色后在顯微鏡下觀察發現，對照組細胞貼壁良好，呈多角形(圖2A)；而被諾麗果發酵原液(100%發酵液)處理48 h后，細胞貼壁數量較少，形態明顯變圓，出現細胞破碎等損傷現象(圖2B)。在熒光顯微鏡下，對照組細胞核形態正常，顯藍色熒光，核輪廓清晰，呈橢圓形(圖2C)；而給藥組細胞出現明顯的凋亡特征，細胞核碎裂，可見凋亡小體(圖2D)。

注：A-D分別代表白光下對照組細胞、發酵液處理組細胞、熒光下對照組細胞核情況以及發酵液處理組細胞核情況圖2 DAPI染色法檢測細胞凋亡情況

2.4 Western blotting檢測Survivin基因表達

Western blotting檢測結果顯示諾麗果發酵液原液(100%發酵液)處理肝癌細胞Bel7402 48 h后細胞的抗凋亡基因Survivin的表達量與對照組相比明顯降低(見圖3)。

注：A.對照組;B.發酵液處理組圖3 Western blotting分析諾麗果發酵液對Survivin基因表達結果

3 結論與討論

肝癌是世界上常見的五大惡性腫瘤之一，它的發生和發展不僅與肝癌細胞的異常增殖和分化有關，還與肝癌細胞凋亡的減少密切相關。因此，誘導腫瘤細胞凋亡是目前腫瘤藥物治療的主要策略[15]。

諾麗果作為一種廣為流傳的藥用植物已經被應用于治療流感、糖尿病、高血壓等。這些功能都被傳統醫學和現代科學研究所證實。有文獻報道[14]諾麗果提取物能夠抑制腫瘤細胞增殖。但是關于諾麗果發酵液對肝癌的影響等方面的研究目前尚未見報道。本文選擇抗菌抗炎癥反應效果最顯著的諾麗果發酵液[16-18]在體外處理肝癌Bel7402細胞，利用MTT法測定不同濃度諾麗果發酵液對Bel7402細胞增殖的影響，流式細胞分析以及DAPI染色法檢測諾麗果發酵液作用后的細胞凋亡情況。結果發現諾麗果發酵液能顯著抑制肝癌細胞Bel7402的增殖，流式細胞分析以及DAPI染色法檢測發現諾麗果發酵液作用Bel7402細胞后，細胞凋亡比例顯著增多且成濃度依賴性。這說明諾麗果發酵液在體外能抑制肝癌Bel7402細胞的增殖并誘導肝癌細胞凋亡。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一員，在癌組織中表達水平顯著升高。Survivin能夠調控細胞凋亡的進程，是非常強大的凋亡抑制因子[19]。本實驗利用Western blotting技術分析了諾麗果發酵液對肝癌細胞抗凋亡基因Survivin 表達的影響。結果發現諾麗果發酵液原液處理肝癌細胞Bel7402后，細胞的survivin基因表達量與對照組相比明顯降低，這說明諾麗果發酵液在體外誘導肝癌細胞凋亡的機制可能是抑制了Survivin基因的表達。這些實驗結果為下一步研究諾麗果發酵液組份對肝癌細胞凋亡的影響及機制等奠定良好的基礎。目前本研究只涉及體外諾麗果抗腫瘤作用的藥效學研究，對于其抗肝癌的分子機制和作用機理以及運用現代藥理學分析方法開展體內水平的研究將是我們下一步工作的方向。這些研究將逐步闡明諾麗果抗腫瘤的分子機制，將對這些天然抗腫瘤藥物從實驗室研究走向臨床應用起到積極的推動作用。