轉木糖還原酶基因XYL1釀酒酵母的構建及產木糖醇能力研究

王鳳梅，張邦建，岳泰新，馬利兵*

（1.包頭輕工職業技術學院 食品藥品學院，內蒙古 包頭 014035；2.內蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010）

木糖醇為五碳糖醇，是一種白色結晶類物質，可由木糖經氫化作用形成。其甜度與蔗糖相近，卻具有較低的熱值[1]。更為重要的是體內木糖醇的利用無需胰島素，因此，可作為糖尿病人飲食中的一種増甜劑。此外，其抗齲齒、牙菌斑及口腔生物膜形成的功能也被許多研究所證實[2-3]。

細菌、藻類及酵母均可被用于生產木糖醇。在發酵制備木糖醇方面，與細菌細胞相比，酵母細胞是更為理想的微生物，尤其是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），因其廣泛被用于葡萄酒釀制中，因此，在食品工業中被認為是總體安全（generallyrecognizedassafe，GRAS）的菌種。在酵母菌種中，多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、菅囊酵母（Pachysolen tannophilus）、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、假絲酵母屬的多個菌種（休哈塔假絲酵母（Candidashehatae）、博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）、季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondii）及熱帶假絲酵母（Candida tropicalis））具有發酵D-木糖制備木糖醇的能力[4-9]。這些酵母菌種之所以能夠以D-木糖為碳源制備木糖醇，其原因在于這些酵母菌種可編碼木糖還原酶（xylose reductase，xyl），該酶可以以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）為輔因子，將D-木糖還原為木糖醇[4-9]。然而，釀酒酵母中的xyl活性較低，因此，無法以木糖為碳源高效合成木糖醇。木糖還原酶基因XYL1的導入將賦予釀酒酵母發酵木糖的能力，同時，釀酒酵母自身的高乙醇耐受力又會賦予轉基因菌株高的發酵能力，此外，釀酒酵母GRAS認證又使發酵終產物木糖醇可被安全應用于食品工業中。

表達載體pYES2攜帶一個釀酒酵母來源的GAL1啟動子，該啟動子在半乳糖存在的條件下啟動外源基因的高效表達，而在葡萄糖存在的情況下，該啟動子受到抑制，外源基因無法表達[10]。此外，該載體攜帶一個URA3基因，在導入URA3基因缺陷型的釀酒酵母菌株（如INVSc1菌株）后，可采用營養缺陷型培養基篩選轉基因釀酒酵母。因此，本研究將人工合成的來源于樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）的XYL1基因插入釀酒酵母表達載體pYES2中。然后，重組質粒pYES2-XYL1導入感受態釀酒酵母INVSc1中，構建轉XYL1基因釀酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1，采用營養缺陷培養基對轉基因釀酒酵母菌株進行篩選和培養，對轉基因菌株發酵制備木糖醇的能力進行檢測。為采用基因工程釀酒酵母制備食用木糖醇提供了理論及技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1、釀酒酵母表達載體pYES2：美國英杰Invitrogen公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：本實驗室凍存菌種。

圖1 人工合成的XYL1基因Fig.1 Artificially synthesizedXYL1gene

人工合成的XYL1片段經HindIII及BamHI雙酶切后插入pUC57克隆載體的多克隆位點處。重組的pUC57-XYL1克隆載體導入E.coliDH5α感受態細胞中，得到E.coliDH5α/pUC57-XYL1。

1.1.2 培養基

LB固體培養基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl、1.5%瓊脂粉。121℃高壓滅菌20 min。液體LB培養基中不添加瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂粉，pH 5.0。121℃高壓滅菌20 min。液體YPD培養基中不添加瓊脂粉。

酵母尿嘧啶缺陷型合成瓊脂培養基（yeast synthetic drop-out agar medium without uracil，SC-URA）：6.8 g/L氮 源基礎、20 g/L葡萄糖、1.92 g/L不含尿嘧啶的酵母人工合成培養基添加物、20 g/L瓊脂粉。121℃高壓滅菌15 min。液體篩選培養基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 試劑

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S19）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，29個共有峰相對保留時間的RSD為0～0.62%（n＝6），相對峰面積的RSD為1.47%～4.97%（n＝6），表明本方法重復性良好。

質粒小提試劑盒、T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶、質粒小提中量試劑盒、酵母細胞質粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；核酸內切酶SacI（10 U/mL）、HindIII（15 U/mL）、BamHI（15 U/mL）、EcoRI（15 U/mL）、凝膠回收試劑盒：日本TAKARA公司；山梨醇/木糖醇檢測試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（分析純）：蘇州亞科科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9272型電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；5430臺式高速離心機：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；NanoDrop 2000 Thermo核酸定量儀：美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 重組載體pYES2-XYL1的構建

工程菌E.coliDH5α/pUC57-XYL1的構建：參照《分子克隆實驗指南》[11]制備感受態細胞E.coliDH5α，將攜帶XYL1基因的pUC57克隆載體pUC57-XYL1導入其中。將轉化后的E.coliDH5α/pUC57-XYL1涂布于含2%X-gal、20%異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）及100 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB固體培養基上，于37℃條件下培養12～16 h。

重組質粒pUC57-XYL1的提取：挑取白色單菌落接種于LB液體培養基中，于37℃、150r/min條件下培養過夜。采用質粒小提試劑盒提取重組質粒pUC57-XYL1，采用核酸定量儀定量。

重組質粒pUC57-XYL1的酶切：重組質粒pUC57-XYL1經核酸內切酶SacI單酶切（或HindIII及BamHI雙酶切），酶切體系為1 μLSacI（或1 μLHindIII及1 μLBamHI）、2 μL 10×L Buffer（或2 μL 10×M Buffer）、5 μL質粒溶液、12 μL（或11 μL）超純水，于37℃水浴鍋中酶切1 h后，采用0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，采用凝膠回收試劑盒回收XYL1基因片段，置于4℃備用。

pYES2的酶切：pYES2經核酸內切酶HindIII及BamHI雙酶切，酶切體系為1 μLHindIII、1 μLBamHI、2 μL 10×M Buffer、2 μL質粒溶液、14 μL超純水，酶切條件同上。采用0.9%凝膠電泳、凝膠回收試劑盒檢測及回收載體片段。

連接、轉化：采用T4 DNA連接酶連接XYL1基因及pYES2載體酶切片段，連接體系為2μLXYL1基因片段、2μL pYES2載體酶切片段、1μLT4DNA連接酶、1μL10×Buffer、4μL超純水，16℃條件下連接過夜。取3μL連接液至100μL E.coliDH5α感受態細胞中，輕搖混勻，冰浴30 min后，42℃熱激90 s，加入400 μL LB液體培養基，37 ℃ 120 r/min振蕩培養45min，然后將細胞涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB固體培養基上，于37℃條件下培養12～16 h，隨機挑取10個單菌落，接種于含100 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB液體培養基中，于37℃、150 r/min條件下培養過夜，采用無內毒素質粒小提中量試劑盒提取重組質粒pYES2-XYL1。

工程菌E.coliDH5α/pYES2-XYL1的驗證：采用EcoRI單酶切（或HindIII及BamHI雙酶切）重組質粒pYES2-XYL1，酶切體系為1 μLEcoRI（或1 μLHindIII及1 μLBamHI）、2 μL 10×H Buffer（或2 μL 10×M Buffer）、5 μL質粒溶液及12 μL（或11 μL）超純水，于37 ℃水浴鍋中酶切1 h后，采用0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，確定含單拷貝XYL1基因的重組質粒pYES2-XYL1及正確的工程菌E.coli DH5α/pYES2-XYL1。大量提取單拷貝基因重組質粒pYES2-XYL1，經進一步酶切、電泳鑒定，采用核酸定量儀對重組質粒pYES2-XYL1的濃度及純度進行檢測，采用質粒提取試劑盒中的三羥甲基氨基甲烷-硼酸（Tris-boric acid，TB）洗脫緩沖液將重組質粒濃度調整到0.1 μg/μL，置于4℃備用。

1.3.2 轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1的構建

將釀酒酵母菌株INVSc1劃線接種于YPD固體培養基，于30℃條件下培養24～48 h。挑取少量酵母細胞接種于10 mL YPD液體培養基中，于30℃、72 r/min條件下培養24 h，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，細胞沉淀經1×三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉（Tris-EDTA，TE）緩沖溶液（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 7.5）洗滌1次后，細胞懸浮于2 mL 1×LiAc/0.5×TE緩沖溶液（100 mmol/L LiAc、5 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EDTA，pH 7.5）中。

取100 μL酵母細胞懸液，加入10 μL重組質粒pYES2-XYL1（0.1 μg/μL）、10 μL單鏈DNA（10 μg/μL）及700 μL 1×LiAc/1×TE/40%聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）-3350，混合均勻，于30℃水浴中孵育30 min。隨后，向上述轉化液中加入88 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），混合均勻，于42℃水浴中熱激7 min，6 000 r/min離心1 min，收集細胞，經1 mL 1×TE緩沖溶液洗滌1次后，細胞懸浮于50 μL 1×TE緩沖溶液中。

轉化后的細胞涂布于尿嘧啶缺陷篩選培養基表面，于30℃條件下培養2～3 d，挑取單克隆子分別接種于液體篩選培養基中，于30℃、72 r/min條件下培養24 h。采用酵母細胞質粒小提試劑盒提取重組質粒pYES2-XYL1，經EcoRI單酶切或HindIII及BamHI雙酶切后，凝膠電泳檢測酶切結果。采用T7 Forward primer（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）對目的基因進行測序，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.3 轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1產木糖醇能力檢測

轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1及未轉XYL1基因的釀酒酵母INVSc1分別接種于10 mL SC-URA液體培養基中，于30℃條件下靜置培養過夜。細胞計數板計數細胞密度，按106CFU/mL接種于50 mL含50 g/L木糖及10 g/L半乳糖（或10 g/L葡萄糖）的SC-URA液體培養基中，于30℃、200 r/min、厭氧條件下培養，每24 h取1 mL發酵液，連續取樣5 d，采用山梨醇/木糖醇檢測試劑盒檢測發酵液中的木糖醇含量。

1.3.4 數據處理

發酵實驗重復3次，發酵液中木糖醇含量取3次重復的平均數±標準差表示。采用SPASS 19.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pYES2-XYL1的構建

提取重組質粒pUC57-XYL1，經SacI單酶切或HindIII及BamHI雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。

H+B為HindIII及BamHI雙酶切產物；S為SacI單酶切產物圖2 重組質粒pUC57-XYL1的酶切產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of enzyme-digested products of recombinant plasmid pUC57-XYL1

由圖2可以看出，重組質粒pUC57-XYL1經單酶切后，堿基長度為3～4 kbp，與預期單酶切產物（3 667 bp）大小相符；經雙酶切后，目的基因條帶XYL1大小約1 kbp，克隆載體pUC57大小為2～3 kbp，與預期雙酶切產物大小相符。

將帶有粘性末端的目的基因XYL1與酵母表達載體pYES2連接，構建重組質粒pYES2-XYL1，結果見圖3。

圖3 重組質粒pYES2-XYL1Fig.3 Recombinant plasmid pYES2-XYL1

2.2 轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1的構建

將重組載體pYES2-XYL1導入釀酒酵母INVSc1感受態細胞中，通過營養缺陷互補型篩選成功獲得2株轉XYL1基因釀酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1，分別為INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02。提取轉XYL1基因釀酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2XYL1-02的重組質粒pYES2-XYL1-01、pYES2-XYL1-02進行酶切，酶切產物電泳結果見圖4。

由圖4可以看出，重組質粒pYES2-XYL1-01、pYES2-XYL-02經EcoRI單酶切后，兩重組質粒的堿基長度均約為7 kbp，與其預期大小（6 825 bp）相符。經HindIII及BamHI雙酶切后，目的基因XYL1堿基長度均約1 kbp，pYES2載體堿基長度均約6 kbp，與預期雙酶切產物大小相符。結果表明，已成功制備含單拷貝XYL1基因的釀酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1。

H+B為HindIII及BamHI雙酶切產物；E為EcoRI單酶切產物。圖4 重組質粒pYES2-XYL1的酶切產物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of enzyme-digested products of recombinant plasmid pYES2-XYL1

2.3 轉基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1發酵產木糖醇能力測定

將篩選到的2株轉XYL1基因釀酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01及INVSc1/pYES2-XYL1-02按1×106CFU/mL菌體濃度接種于含50 g/L木糖及10 g/L半乳糖（或10 g/L葡萄糖）的SC-URA液體培養基中，于30℃、200 r/min、厭氧條件下培養，每隔24 h檢測一次發酵液中木糖醇含量，結果見表1。

表1 釀酒酵母產木糖醇能力測定結果Table 1 Determination results of the xylitol production ability ofSaccharomyces cerevisiae

由表1可知，2株轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02以半乳糖及木糖為碳源時，發酵5 d后，木糖醇產量分別可達（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L，木糖醇產量差異不顯著（P＞0.05）。而非轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1的木糖醇產量為（1.08±0.37）g/L，顯著低于轉基因釀酒酵母組（P＜0.05）。結果表明，XYL1基因的導入顯著提高了釀酒酵母INVSc1菌株生產木糖醇的能力（P＜0.05）。當2株轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02以葡萄糖及木糖為碳源時，產木糖醇的能力顯著下降（P＜0.05），木糖醇產量雖略高于非轉XYL1基因釀酒酵母組，但無顯著差異（P＞0.05）。其可能原因在于，當pYES2-XYL1載體導入釀酒酵母INVSc1菌株中，啟動外源基因表達的GAL1啟動子在葡萄糖存在時受到抑制，導致XYL1基因無法正常表達；而當發酵液中存在半乳糖時，該啟動子去阻遏，使得XYL1基因被誘導表達。

當葡萄糖作為木糖的共底物時，轉XYL1基因釀酒酵母的木糖醇產量與非轉XYL1基因釀酒酵母無顯著差異（P＞0.05），說明葡萄糖對該啟動子的抑制作用很強。這一啟動子使制備的轉基因釀酒酵母可實現人為誘導表達，即在種子制備階段，采用含葡萄糖的培養基抑制XYL1基因表達，避免外源基因的過度表達對轉XYL1基因釀酒酵母的生理影響，而在發酵木糖階段，發酵液中添加一定濃度的半乳糖誘導GAL1啟動子啟動XYL1基因的表達。由于釀酒酵母的發酵過程必然伴隨著半乳糖的消耗，因此，發酵液中初始半乳糖的含量對整個發酵過程至關重要。有關發酵液中適宜的半乳糖初始濃度有待進一步研究。

木糖作為自然界中較為豐富的可再生碳源，使人們嘗試將高活性xyl酵母菌種中的XYL1基因導入釀酒酵母中，制備轉XYL1基因釀酒酵母并發酵木糖制備木糖醇[9，11-15]。目前，已在包括樹干畢赤酵母（P.stipitis）在內的多個酵母菌種中檢測到XYL1基因的高效表達[4-9]。通常采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術或反轉錄酶-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術從基因組DNA或轉錄組核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）中擴增目的基因的DNA序列或cDNA序列。在本研究中，在已知樹干畢赤酵母XYL1基因DNA序列（GenBank：X59465.1）的基礎上，采用人工合成的方法獲得該基因的編碼序列及部分3′端非編碼序列。轉XYL1基因釀酒酵母發酵木糖制備木糖醇的能力間接證明了合成基因的高效表達。在轉基因領域，由于某些生物材料特別稀少，甚至難以獲得，因此，無法采用常規PCR或RT-PCR技術獲得目的基因。本研究為類似的轉基因研究提供了理論及技術基礎。

3 結論

本研究成功構建轉XYL1基因釀酒酵母INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02，其以50g/L木糖及10g/L半乳糖為碳源發酵5 d后，木糖醇產量分別達到（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L，顯著高于非轉基因釀酒酵母INVSc1的木糖醇產量（1.08±0.37）g/L（P＜0.05）。結果表明，XYL1基因的導入顯著提高了釀酒酵母INVSc1菌株生產木糖醇的能力（P＜0.05）。為采用基因工程釀酒酵母制備食用木糖醇提供了理論及技術基礎。