MicroRNA-29在纖維化相關疾病中的調控作用*

桂 麗 宋啟琴 黃加權△

1.孝感市中醫醫院肝病科 (湖北 孝感， 432000) 2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院感染科 (湖北 武漢， 430030)

微小RNA(miRNA)是一類長度約19～24個核苷酸(nt)的內源性非編碼小分子單鏈RNA,廣泛存在于真核生物細胞中,通過堿基互補配對與靶基因mRNA3′UTR特異性結合,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯,從而廣泛地負調控靶基因的表達[1]。miRNA除在進化過程中具有高度保守性外，大量的研究還表明，miRNA的表達在組織功能特異性和個體發育時序性方面也具有重要調節作用，即不同生物體或同一個體不同組織中miRNA表達譜不盡相同，一個miRNA在同一種生物個體的不同發育階段也存在著表達差異。目前已有1181個前體和2588個成熟的人類miRNA在miRNAbase ver.21.0注冊，并且其數量還在呈指數增長，單個miRNA可有多個mRNA靶點，而單個mRNA也可受多個miRNA的調控[2]。多項研究發現miRNA與其所調控的靶基因之間存在復雜的調控網絡,如一個miRNA分子可能調控多個基因的表達,一個基因也可受多個miRNA分子的調控,而miRNA自身的表達也受多種機制的調控。在細胞內miRNA既可通過調控相關基因的表達從而調控細胞內的信號傳導,同時其自身的表達也受細胞內某些信號通路的調控從而形成一個封閉的細胞內信號調控環路。miRNA被發現在正常生理中發揮調節作用，包括發育、造血過程、器官形成、先天免疫、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，但在疾病中表現不明顯[3]。近年來，越來越多的研究已證實miRNA也參與多種疾病(如癌癥、心血管疾病、纖維化疾病，病毒感染)的發病及發展過程，而且其表達變化還與病變程度密切相關[4]。

纖維化是以細胞外基質成分過度沉積為特征的一種病理過程，它主要與細胞外基質成分合成及降解失衡有關[5,6]。它使器官組織結構發生改變，血液供應受到影響導致器官的功能逐漸減退甚至喪失。隨著對miRNA進一步的深入認識，我們發現miRNA在纖維化疾病中起到了極其重要的作用，不僅參與纖維化的發生過程，其表達水平的變化還與纖維化程度密切相關。miR-29是新近發現的與纖維化疾病密切相關的小分子RNA家族，參與多種器官纖維化發生發展過程，包括心、肝、腎、肺纖維化、系統性硬化癥等[7-13]。

1 microRNA29結構、表達及功能

miR-29家族包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。Lagos-Quintana等[14]于2001年在人HeLa細胞中首次利用miRNA基因直接克隆策略成功克隆獲得miR-29a，后來相繼獲得其類似物miR-29b和miR-29c。它們擁有相同的種子序列AGCACCA，僅為末尾極少數核苷酸不同：miR-29a和miR-29c均含22個核苷酸，二者僅為一個核苷酸差異，而miR-29b則含23個核苷酸。與miR29a/c不同的是，miR-29b 3′末端存在AGUGUU序列，此序列具有核定位的作用，因此miR-29b成熟序列主要位于細胞核內。由于miR-29b基因同時定位于miR-29a所在的7號和miR-29c所在的1號染色體上，故又將其分為miR-29bl和miR-29b2，多數情況下miR-29a 和miR-29bl在相同組織細胞中的表達調控與生物學功能相似；同樣miR-29b2與miR-29c也具有相似的生物學行為[15]。最近研究發現，miR-29在胚胎期組織中低表達甚至不表達，而在生物體成熟組織細胞(肝臟、腎臟、肺和心臟等)中高表達,在機體成長的不同階段miR-29表達也有不同意義[16]。Kamran等研究結果顯示，miR-29表達水平在組織發育與年齡之間呈正相關，成熟組織時達到最高水平[17]。進一步研究表明，miR-29表達的時間變化可以選擇性地影響對胚胎干細胞(ESC)分化至關重要的一系列基因，這表明miRNA-29是ESCs的直接調控因子[18]。如此看來，即使它們是由兩個主轉錄體共轉錄而成，在某些情況下這三個成熟miR-29家族成員也可能是由不同的機制調控。對人類鼻咽癌細胞的細胞核和細胞質組分中小RNA深度測序結果發現，大多數成熟的miRNA在一定程度上均轉導入核內。然而，同樣清楚的是，包括miR-29b在內的幾個miRNA在細胞核內表達豐富。分析結果為miR-29b在細胞核中含量是細胞質中的4.54倍。同時檢測miR-29c在細胞核中含量為胞質的2.84倍。胞質和胞核中miRNA可能與不同的蛋白質相互作用并發揮不同的生物學效應，此機制尚待進一步的闡明。最近，多項研究已表明miR-29是一個與纖維化疾病密切相關的小分子RNA家族，miR-29可直接與多種膠原蛋白及金屬蛋白的3′UTR結合而抑制其表達，參與多種器官組織纖維化的調控，包括肝、肺、腎、心肌纖維化及系統性硬化癥等。

2 microRNA29與纖維化疾病

2.1 microRNA29與肝纖維化 肝纖維化是許多慢性肝臟疾病(如慢性肝炎病毒感染、慢性血吸蟲病、酗酒、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝等)所致的肝內結締組織異常增生、肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的病理過程。它使肝臟結構發生改變，血液供應受影響，肝臟功能逐漸減退甚至喪失，最終發展為肝硬化。肝星狀細胞(HSC)的激活是肝纖維化形成的中心環節。在正常肝臟組織中，HSC處于靜止狀態，當肝臟損傷時，HSC受到各種致病因子的刺激，從靜息狀態轉化為具有增生性、纖維原性和可收縮性的肌成纖維細胞后表達a-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)并產生大量的ECM在肝臟沉積，最終導致肝纖維化的發生[19]。總之，肝星狀細胞的活化是肝纖維化發生的主要驅動因素，并伴隨有microRNA的變化[20]。

Yong He等發現在肝內多種細胞中，miR-29b在星狀細胞中表達最高，是其在肝細胞、庫弗氏細胞及內皮細胞中的100多倍[21]。且研究表明，在肝纖維化小鼠和進展性肝纖維化病人肝臟組織中miR29a/b/c的表達均明顯下降，且miR-29的表達隨肝纖維化進展呈進行性下降，這些都與HSC的活化和細胞外基質基因的上調相關。在人肝星狀細胞(LX-2)中，miR-29b可通過分別與Ⅰ型膠原蛋白3′UTR和SP1(specificity protein 1)3′UTR直接結合共同抑制I型膠原蛋白的表達。轉染pre-miR-29b后,可抑制TGF-β1引起的I型膠原蛋白和mRNA的升高，而過表達miR-29b可明顯抑制小鼠肝星狀細胞中膠原蛋白的表達。LX-2細胞中miRNA-29a的過表達導致熱休克蛋白和酪氨酸氧化酶(LOX)表達顯著抑制，這對ECM的成熟至關重要。因此，miRNA-29a被認為參與調控ECM和纖維形成后的轉錄過程[22]。研究者們還發現，與健康人相比肝病患者血清中miR-29a水平明顯下降，且其下降程度與肝硬化嚴重程度呈正相關，Child分級為B和C的肝硬化患者miR-29a水平比A級患者更低。Nicholas等[23]利用膽管結扎方法誘導的實驗性肝纖維化模型中，miR-29a/b1表達上調，然后使用反義寡核苷酸體內抑制其表達，證實了IGF1和Il1RAP為miR-29的潛在靶點。我們已經用序列分析技術，進一步驗證了IGF1和Il1RAP為miR-29的直接靶點。Matsumoto等[24]研究表明在原代HSCs中轉染miR-29b前體既明顯抑制膠原蛋白Ⅰα1和α2mRNA的表達，還可以降低與原代HSCs活化相關的蛋白如α-SMA,DDR2,FN1,ITGB1,及PDGFR-β mRNA的表達。在LX-2細胞轉染mir-29b后3天和5天測定細胞活力分別為89%和81%，這些研究結果表明miR-29b具有抑制HSC增殖及活性作用。Toyono等[25]發現在纖維化過程中表達下調的miR-29，不僅抑制膠原蛋白的合成，而且還干預促纖維化細胞因子PDGF-C和IGF-I的信號連接。

2.2 microRNA29與肺纖維化 許多間質性肺疾病與肺纖維化有關，從而導致在肺泡壁增厚和肺瘢痕形成。各種刺激包括持續性感染，自身免疫反應、過敏性反應、化學侵蝕、輻射及組織損傷等均被認為參與慢性炎癥反應的啟動環節。肺纖維化是以肺泡上皮細胞損傷、基底膜(BM)的完整性破壞、再上皮化消失導致上皮-間質轉化(EMT)、炎性細胞浸潤、纖維母細胞增生、細胞外基質沉積以及纖維疤痕形成為特征性表現。然而，miR-29在EMT過程中參與肺纖維化的作用機制尚不清楚。肌成纖維細胞和成纖維細胞通過分泌一系列纖維化相關細胞因子以及合成過多的膠原蛋白和其他基質蛋白在肺纖維化形成病理過程中發揮重要作用。在成年小鼠肺組織中，miR-29主要表達于易發生肺纖維化的肺泡壁和胸膜下細胞以及肺泡管入口處的纖維母細胞中。體外試驗也顯示似乎miR-29更傾向于在間充質來源的細胞系中表達。在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型中，miR-29表達顯著下降，其下降水平與纖維化嚴重程度和纖維化靶基因的表達水平呈負相關，如COL3α1，COL4α1。體外試驗也表明，miR-29在人胎肺成纖維細胞(IMR-90細胞)中明顯下調，肺纖維化中TGF-β/SMAD信號負性調控miR-29，有趣的是miR-29過表達反過來可以下調TGF-β和SMAD3信號分子。然而，miR-29可以調控與TGF-β無關的纖維相關因子，包括層黏連蛋白、整合素、基質金屬蛋白酶(MMP)、膜結合蛋白酶(ADAM)[17]。研究表明，miR-29在人肺成纖維細胞中可激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路和Wnt/β-catenin通路，從而在TGF-β1誘導的ECM合成中發揮了關鍵作用[26,27]。另一項研究發現，通過靜脈注射miR-29b，模擬博萊霉素誘導小鼠肺纖維化模型，可以緩解博萊霉素誘導的纖維化和炎癥反應，降低膠原蛋白的表達，從而阻斷和逆轉肺纖維化[26]。這些研究表明，miR-29在肺纖維化中具有良好的抗纖維化活性，這可能是一種潛在的治療方法。

2.3 microRNA29與腎纖維化 腎臟纖維化是在各種致病因素(如炎癥、損傷，高血壓、糖尿病等)作用下腎臟組織出現腎小管上皮細胞消失，代之以大量炎癥細胞浸潤、腎間質成纖維細胞活化、增殖及表型轉分化,促使過量ECM在腎間質積聚、正常腎臟結構改變為特征性表現的間質腎纖維化。腎小管間質纖維化各種慢性腎臟疾病進行性發展的共同通路,是導致終末期腎病的主要病理基礎。

我們發現，在UUO(單側輸尿管梗阻)誘導的腎間質纖維化小鼠模型中miR-29的表達水平顯著下降，且纖維化嚴重程度與miR-29表達水平密切相關。TGF-β刺激腎小管上皮細胞及足細胞后miR-29表達下降且各種膠原蛋白形成，而miR-29過表達可抑制TGF-β引起的上皮間充質(EMC)交聯沉積,這些結果證實miR-29可能與腎臟纖維化密切相關[28]。Fang等[29]發現TGF-β1可通過刺激SMAD3與miR-29啟動子結合，下調miR-29的表達。miR-29以細胞外基質為靶基因且為TGF-β/Smad3信號通路介導的纖維化下游抑制劑。Liu等[30]發現SMAD7的去除促進了腎纖維化和炎癥，這是由Ang-II介導的并可能與Sp1-TGF-β/SMAD3-NF-(B信號增強和miR-29表達降低有關。因此，Smad3-miR-29軸很有可能為治療纖維化的一個重要通路。我們發現與新生小鼠相比，在成年小鼠腎臟中miR-29的表達顯著上調，其他器官中也觀察到了類似的表達方式。給予3天以上高鹽飲食建立Dahl鹽敏感性(Dahl/SS)大鼠高血壓及腎損傷模型后發現，miR-29b在SS.13BN大鼠腎髓質中表達量顯著高于SS大鼠。通過靜脈給予反義寡核苷酸敲除SS.13BN大鼠體內miR29以及大量體外實驗結果均表明miR-29b的靶基因為多個細胞外基質基因(COL1α1，COL3α1，COL4α1，Col5a1，Col5a2，Col5a3，COL7A1 COL8A1，MMP2和Itgb1)，因此可以抑制SS.13BN大鼠腎間質纖維化的進展。

2.4 microRNA29與心臟纖維化 心肌纖維化是各種原發與繼發性心臟疾病如高血壓、心肌梗死及心肌病等引起的膠原蛋白等細胞外基質蛋白分泌增加和異常沉積，心肌間質網絡異常重構、結構發生紊亂，是導致心律失常及心功能衰竭等嚴重并發癥的主要原因之一。心臟成纖維細胞是心肌細胞外基質的主要來源，在各種病理狀態下，心臟成纖維細胞可被TGF-β等細胞生長因子激活，發生異常增殖并分泌細胞外基質。多項研究已表明各種原因導致的心肌纖維化都伴隨著一系列特定miRNAs表達變化。

Van Rooij等[31]于2008年發現miR-29a/b/c在小鼠心梗模型和心梗病人心肌梗死區及近梗死區表達明顯降低，并且miR29a/b/c在心臟成纖維細胞中的表達量比心肌細胞明顯降低。利用miR-29b反義寡核苷酸體內沉默miR-29b后，I型、Ⅲ型膠原蛋白、原纖蛋白及彈性蛋白及mRNA水平顯著升高，促進心肌纖維化。體外轉染miR-29b類似物后則明顯抑制心臟纖維母細胞中膠原蛋白及其mRNA表達，從而抑制心肌纖維化。因此，這些都提示miR-29參與了心肌纖維化過程，可能是治療心梗后心肌纖維化的靶點之一。miR-29家族的相應靶點是編碼與纖維化相關的細胞外基質蛋白mRNA，包括I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、纖維蛋白-1型(FBN-1)和彈性蛋白[32]。

研究還表明，通過抑制激活T細胞c4(NFATc4)轉錄因子核因子的表達，miR-29在心肌肥厚和心衰模型中的表達下降[33]。TGF-β是促進心肌纖維化的主要分子，可下調miR-29在心肌成纖維細胞中的表達。另一項研究發現，在充血性心力衰竭(CHF)相關的心房顫動(AF)犬模型中，心房miR-29表達下降。在犬心房纖維母細胞中，miR-29的降解可以顯著增加I型膠原-1(COL1A1)、III型膠原(COL3A1)和FBN的膠原表達。在本研究中，Dawson等[34]也觀察到CHF患者的miR-29表達降低。研究還發現，miR-29在心房纖維重塑中起著至關重要的作用，可以作為潛在的生物標志物或治療靶點。所有這些研究表明，miR-29表達下調至少是病理模型中心肌纖維化的最重要原因之一，miR-29表達對心肌纖維化有拮抗作用[22]。Melo和Yang等[35,36]發現游泳和丹參酮可以通過在成纖維細胞中上調miR-29來減少纖維化。miR-29具有雙重功能:不僅能抑制膠原蛋白的表達防止心肌纖維化，還能誘導誘發心衰的心肌細胞凋亡。這些發現突出了miR-29家族的復雜功能，以及進一步探究miR-29在心肌纖維化中作用的必要性。

2.5 microRNA29與系統性硬化癥 系統性硬化癥(SSc)是一種臨床上以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征,同時可累及心、肺、腎和消化道等多個內臟器官的彌漫性結締組織病。Maurer等[37]發現miR-29a在系統性硬化癥病人皮膚活檢組織、人纖維母細胞及博來霉素誘導的皮膚硬化癥動物模型中表達均明顯下降，而抑制miR-29a或過表達miR-29a可升高或降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和mRNA水平，提示miR-29可能是治療系統性硬化癥的一個靶點。作為下游介質，miR-29a可以被TGF-β、PDGF-B和白細胞介素(IL)-4抑制，而PDGF-B和TGF-β的下調可以在體內和體內恢復miR-29a水平。進一步的功能研究表明，miR-29a靶向TGF-β-激活激酶1結合蛋白1(TAB1)，這是一種觸發組織抑制金屬蛋白酶1(TIMP-1)產生的關鍵細胞因子。miR-29a還可通過TAB1抑制作用降低TIMP-1分泌，并增加功能MMP-1的產生，導致膠原降解。miR-29a的過表達可通過下調膠原蛋白和TIMP-1來逆轉SSc成纖維細胞的原纖維化表型，進一步表明miR-29a可能是SSc的治療靶點[36]。此外，miR-29a通過增加SSc患者的真皮成纖維細胞中Bcl-2相關的蛋白9(Bax)與中Bcl-2比值而誘導凋亡[38]。

2.6 microRNA29與其他疾病 最近的研究顯示miR-29可以正反饋調節Wnt/β-catenin信號通路參與機體的骨骼發育及重塑。在成骨細胞分化過程中miR29a/c表達上調，同時伴有Wnt/β-catenin信號通路的活化。加入其信號通路抑制劑Dickkopf-1(Dkk-1)后顯著抑制了miR-29a/c表達；進一步研究還發現：增強miR-29a表達后能有效下調Wnt信號通路的抑制劑[如Dkk1，含kringgle跨膜蛋白2(Kremen2)和分泌型卷曲相關蛋白2(sFRP2)]的表達，從而加強了Wnt信號通路，促進干細胞成骨分化[25]。上皮細胞-間充質轉分化(EMT)是纖維化的起始和可逆環節，最近還發現miR-29與EMT過程有著緊密聯系。在子宮內膜癌肉瘤EMT改變中，除miR-200家族外，miR-29c的表達也是下調的，提示miR-29可能在EMT過程中起著負性調控的作用，通過過表達miR-29可能會抑制EMT而阻止纖維化的發生。最近研究發現在小梁網細胞中TGF-β2能抑制miR-29a/b/c的表達，過表達miR-29b可抑制TGF-β2引起的細胞外基質上調，且miR-29b能同時在啟動子、mRNA和蛋白三個水平抑制TGF-β1表達[27]。在瘢痕組織中，miR-29家族表達低于正常皮膚組織。與健康對照相比，miR-29家族，尤其是miR29a，在成纖維細胞中也明顯減少。miR-29可以通過調節I型膠原和III型膠原的表達來影響瘢痕形成的發病機制。通過TGF-β1進行預處理成纖維細胞后miR29a顯著下調，證明miR-29a/TGF-β1/SMAD信號通路可能在瘢痕的發生中發揮重要作用[39]。循環中miRNA是否影響終末期器官中基因的表達及其診斷或預后價值仍需進一步研究。

3 小結與展望

綜上所述，越來越多的證據表明miR-29可通過直接抑制多種細胞外基質成分(主要是膠原蛋白)的表達及參與多條與纖維化相關信號通路的調控在器官纖維化過程中發揮著重要的作用。miR-29在心肌纖維化和肺纖維化患者血清中已被證實是穩定和可檢測的。因為miR-29參與了這一過程的調控，并與纖維化程度相關，因此它似乎比其他miRNA更有價值，miR-29可能是一個極具潛力的纖維化診斷及預后評估的新靶點，同時也是尋找纖維化新的治療靶點的新視角和方向[40-42]。

進一步研究miR-29在纖維化相關疾病中的作用機制將有利于闡明miR-29與疾病發生發展之間的因果關系并為miR-29在疾病預防和治療中提供應用價值，為miR-29的臨床應用提供可靠的理論依據。