糖酵解代謝旁路與樹突狀細胞誘導免疫耐受的相關性

劉會佳，武志坤，崔 萌，鄧曉紅綜述，宋秀娟，侯慧清，郭 力審校

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是人類目前已知的免疫系統功能最強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)，其功能為高效地識別、捕獲、呈遞抗原，從而激活抗原特異性T細胞，啟動免疫應答，因此在固有免疫應答(innate immune response)及適應性免疫應答(adaptive immune response)中均具有重要作用。

DC自1973年被加拿大科學家Steinman[1]發現以來，一直是自身免疫性疾病研究的重點。近來關于DC代謝的研究越來越多，研究發現不同類型的DC具有不同的代謝旁路，用以滿足其生物學代謝功能的需求；同時，不同的代謝旁路也決定了免疫細胞的表型及功能。

DC必須在激活或成熟后才能發揮誘導免疫應答的作用。因此，本文通過對促DC成熟的代謝通路進行綜述，以期為研究抑制DC成熟、誘導免疫耐受及自身免疫性疾病的臨床治療提供新的方向。

1 DC分類

DC據來源分為髓樣DC(myeloid dendritic cell,mDC)與漿樣DC(plasmacytoid dendritic cell,pDC)，在人類即為DC1與DC2。DC1與粒細胞、單核細胞有共同的前體細胞，能分化為巨噬細胞，分泌白細胞介素(interleukin,IL)-2、IL-12、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；DC2與T細胞、自然殺傷細胞有共同的前體細胞，能夠分化發育為淋巴細胞，通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)識別病毒和自身核酸結構，分泌干擾素α(interferon-α,IFN-α)[2]。二者均起源于骨髓中CD34+多能造血干細胞(CD34+Hematopoetic progenitor cell,CD34+HPC)，而后由骨髓遷移到外周血中，到達各個淋巴器官。

DC根據成熟程度分為成熟樹突狀細胞(mature dendritic cell,mDC)及未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell,imDC)，二者在表型及功能上均有所不同，DC具有根據其自身成熟狀態誘導或抑制免疫反應的能力。ImDC表達一系列的模式識別受體，包括TLRs以保證當炎癥刺激及微生物侵襲時能夠識別并快速應答，功能主要為識別、攝取、呈遞抗原。其常規存在于除腦以外身體的其他非淋巴組織，處于免疫耐受狀態；當受到炎癥信號如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激時，DC遷移至次級淋巴器官并誘導主要組織相容性復合體I/II(major histocompatibility complex I/II,MHC I/II)，基因編碼趨化因子受體、共刺激分子、細胞因子的表達，活化為mDC，攝取抗原能力下降，加工、提呈抗原能力增強，活化初始T細胞，誘導免疫應答[3]。

DC根據其分布部位大致可分為淋巴組織中DC：如濾泡樣DC(follicular DC,fDC)、并指狀DC(interdigitating cell,iDC)等；非淋巴組織中DC：如間質性DC、朗罕細胞(langerhans cell,LC)等；以及血液中DC。DC根據導致的免疫反應類型分為啟動免疫應答DC(immunogenic DC,iDC)和誘導免疫耐受DC(tolerogenic dendritic cell,tol-DC)。

2 DC誘導免疫應答的作用

當機體受到炎性刺激信號如病原體、TNF-α等刺激后，DC主要通過3類信號向初始T細胞傳遞信息，激活初始T細胞，起到誘導免疫應答的作用。第一信號：DC攝取抗原后，處理成抗原肽- MHC復合物表達于細胞表面，被T細胞表面的T細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識別；第二信號：DC表面表達共刺激分子80(costimulatory molecules 80,CD80)、CD86、CD40等，必須同第一信號共同刺激T細胞才能使其充分活化，誘導免疫應答反應，故又稱協同刺激信號；第3信號：DC通過分泌IL-6、IL-12、IL-10、轉化生長因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、TNF-γ等決定初始T細胞分化為效應T細胞還是輔助性T細胞，激活或抑制免疫反應。因此，DC是固有免疫和適應性免疫的橋梁。

3 DC的糖酵解代謝旁路(glycolysis pathway)

代謝在免疫細胞中的作用至關重要，第一，它是提供能量的一種方式，用于滿足細胞所需能量，維持其生存、增殖、細胞因子的分泌等功能。在大部分的細胞中，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)提供了其中大部分的能量[4]。第二，提供原料進行DNA修飾及蛋白質合成。與免疫相關的代謝途徑包括以下6種：糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環、磷酸戊糖途徑(Pentose Phosphate Pathway,PPP)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成、氨基酸代謝，可影響免疫細胞的功能[5]。DC通過發育、靜止、激活來發揮其不同階段的生物學功能。在DC發育成熟的過程中，不同階段的DC代謝旁路也不同，用以滿足其生物學功能的需求,這也使得我們通過調節DC代謝改變DC表型和功能，達到誘導免疫耐受的目的具有可能性。

在生物供能的角度講，與氧化磷酸化相比，糖酵解產生ATP的能效低，但產生速度卻較快。在發生免疫應答時，糖酵解可以維持細胞的能量供給，并保護DC的生存能力。當感染、炎癥發生時，氧供給不足，此時糖酵解可以更好的發揮作用，快速提供ATP，進而促進合成、分泌DC成熟所需物質，如：致炎性細胞因子等。

廣義的糖酵解途徑是指在缺氧或無氧條件下于胞液中將葡萄糖分解代謝為丙酮酸并產生少量三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的過程。生成中間代謝產物：6磷酸果糖(glucose-6-phosphate,G6P)后的代謝主要有兩條分支，其中一條為PPP，可以生成核酸和脂肪酸合成所需的重要輔助因子-NADPH。另一條為丙酮酸途徑，生成的丙酮酸一部分進一步代謝轉變為乳酸、NAD+和ATP，反饋作用于糖酵解代謝旁路，另一部分進入線粒體內生成乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，參與到TCA循環中[6]。丙酮酸的代謝方向由PKM1和PKM2決定。PKM1能促進丙酮酸在線粒體的氧化；決定缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)可以通過上調乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)的表達促進丙酮酸轉化為乳酸，PKM2可以促進HIF1α的表達。目前，對于DC中PKM1和PKM2的功能還有待進一步研究。

3.1 P13K-AKT-mTOR通路 磷脂酰激酶3羥基酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)-AKT是一類廣泛存在于細胞質中的信號轉導途徑，主要參與細胞分化和抑制凋亡。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其活性主要與磷酸化水平相關。AKT作為PI3K下游的主要目標因子，刺激細胞膜表面的葡萄糖轉運體1的表達，從而促進細胞質內葡萄糖聚集，促進糖酵解快速發生[7]，增強細胞無氧糖酵解水平。AKT下游激酶雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)也是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種亞型mTOR C1和mTOR C2，在調節細胞代謝中具有重要作用。P13K-AKT信號通路激活后，活化mTOR促使AKT磷酸化，進一步解除增強內轉錄因子HIF-1α的穩定性，調節線粒體氧化磷酸化轉向糖酵解來提供能量[8]。除了通過HIF-1α直接在轉錄水平調節糖酵解，mTOR可以通過表達依賴一氧化氮合酶iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)：抑制OXPHOS，產生NO：下調線粒體的功能[9]，使細胞在缺乏線粒體呼吸作用的情況下轉化為糖酵解代謝，間接調節TLR誘導炎性DC的糖酵解作用[10]。正如Everts等人[9]研究發現LPS刺激infDC后24 h內，iNOS表達增加，內源性NO生成增多，NO抑制線粒體內電子傳遞鏈，并且5’腺苷一磷酸激活蛋白激酶(5’adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)途徑被抑制，從而抑制OXPHOS，糖酵解代謝增強。而為驗證該通路，該小組應用己糖激酶抑制劑：2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)抑制糖酵解后，發現iNOS infDC的數目明顯減少，而其他DC亞群無明顯變化。Wei等人[11]研究發現應用2-DG抑制DC糖酵解后促使了Th17細胞向調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)方向轉化。另有研究應用PI3K抑制劑LY294002后發現LPS誘導的糖酵解顯著降低[12]。生長因子受體如GM-CSF可以激活PI3K/Akt。當GM-CSF用于未成熟的靜息狀態的DC細胞中時，Akt被活化。

3.2 TBK1/IKKε-AKT途徑 然而，DC細胞成熟早期所須的糖酵解代謝旁路并非在缺氧或無氧條件下發生的。近期研究表明，早期TLR誘導糖酵解支持DC激活的合成代謝需求并不依賴mTOR 或HIF-1α信號通路，而是取決于AKT。Everts等人[13]采用光譜-色譜分析法追蹤1,2-13C葡萄糖，從而證明了與對照組相比，當脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BMDC 1 h后，葡萄糖更加迅速的將其碳源傳遞給了丙酮酸鹽和乳酸鹽，體外培養CD24+DC，以TLR刺激并觀察其細胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)快速增長，這代表乳酸生成增多，糖分解代謝增加。氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)和ECAR能夠分別用于評價線粒體呼吸作用和糖酵解[14]。研究揭示了以下代謝途徑：以LPS作用于DC后數分鐘內，TLR被激活，通過其下游TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)/核因子-κB激酶ε亞基(nuclear factor-κB kinase subunit-ε,IKKε)，致Akt發生磷酸化，從而促進糖酵解的限速酶之一：己糖激酶(hexokinase,HK)-Ⅱ與電壓依賴性陰離子通道結合，HK-Ⅱ易位至線粒體外膜，啟動糖酵解，而快速增加的糖酵解最終生成檸檬酸鹽，通過slc25a1轉運至細胞液內進行脂肪酸合成。易位后，HK-Ⅱ可直接獲得高濃度的ATP，從而進一步增強其酶活性。增加的糖酵解通過作為PPP和TCA循環的碳源支持來補充NADPH和檸檬酸，促進利用二者進行脂肪酸的從頭合成。脂肪酸合成增加是為了提供內質網和高爾基體擴張所需的膜結構，以滿足DC對早期激活標記物的翻譯、轉運和分泌以及分泌促炎細胞因子的需求。因此，TBK1/IKKε-AKT通路才是快速誘導有氧糖酵解的通路。與此一致的是：在透射電子顯微鏡下觀察發現在被激活的DC中糖酵解迅速增強，內質網和高爾基體以一種依賴脂肪酸從頭合成的方式在擴大。被激活后，DC保持糖酵解這個過程對于持續其存活是必不可少的，并且通過mTOR和HIF-1α被控制[6]。而無論在體外還是體內實驗中，抑制這一早期的代謝途徑改變將會抑制DC的激活、遷移、及T細胞激活[10]。這一過程可以被AMPK抑制，AMPK是脂肪酸β氧化的中樞調節器。

IKKε和TBK1是非經典IKB激酶家族(IKB kinases,IKKs)的成員，二者結構相似，N端為激酶區域，C端為NEMO結合域，此外，還包括羧基端的亮氨酸拉鏈結構和螺旋-環螺旋結構。在經典的核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路中，IKKε與TBK1形成異源二聚體，磷酸化并激活NF-κB和IFN調節因子(IRF)，導致促炎性細胞因子、趨化因子和Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon,IFN Ⅰ)產生增加，促進免疫應答及炎性疾病的發生，因此又稱為NF-κB的額外活化激酶[15]。IKKε/TBK1的活化依賴自身磷酸化和經典IKK復合物介導途徑兩種方式激活，其中作用最強的炎性刺激因子為TLR3、TLR4、RIG-Ⅰ[16]。

4 調節DC代謝與免疫性疾病的治療

操縱細胞代謝以達到治療目的已經不是一個新興的觀點了。在腫瘤領域，人們傾向于應用藥理學方法抑制合成代謝或糖酵解來抑制腫瘤的生長[17,18]。近年來，對于誘導離體DC產生免疫刺激性自體DC疫苗的研究成為了重點，其中一些疫苗已經應用于腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、變態反應性疾病等領域的臨床研究或疾病治療中。如：已有一項Ⅰ期臨床試驗開始應用tol-DC治療Ⅰ型糖尿病[19]；應用地塞米松、維生素D3加載上滑液及自體DC治療類風濕性關節炎[20]；聯合維生素D3通過增強CD4+CD25+抑制性T細胞治療牛皮癬[21]等。而其中前列腺癌DC疫苗作為第一個針對癌癥的DC疫苗，已經被美國FDA批準上市[22]。多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是T細胞介導的，以白質脫髓鞘、軸索損傷為主要病理特點的中樞神經系統慢性炎性疾病。在MS患者腦脊液循環中可檢測到分泌促炎因子的DC，此DC水平已經成為了MS患者的一項臨床檢測指標。除了通過對Th1/Th2細胞平衡的調節治療疾病，已有研究應用tol-DC誘導復發緩解型多發性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS)患者體內產生抗原特異性低反應性T細胞[23]。目前，已有兩項Ⅰ期臨床試驗在臨床試驗上登記，評估負載MS患者NCT02618902和NCT02903537髓鞘肽段的tol-DC的可行性與安全性[24]。

此外，地塞米松、維生素D3、雷帕霉素等多種藥物可以通過調節代謝途徑誘導DC向耐受性DC轉變[25]。白藜蘆醇通過激活組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase Sirtuin 1)，抑制HIF-1α功能，同時增強過氧化物酶增值活化受體協同刺激分子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)的活性而增強分解代謝，促進氧化磷酸化代謝，誘導耐受性DC[26]。羅格列酮可促進線粒體生物合成、上調脂肪酸氧化、干擾TLR介導的DC活化[27]、誘導免疫耐受。實驗證明，雷帕霉素作為絲/蘇氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制mTOR，誘導tol-DC，減輕器官移植術后的排異反應[28]。研究表明在TLR誘導激活的DC中直接抑制糖酵解可以下調Th1細胞表達，上調Foxp3+的輔助T淋巴細胞生成，從而促進免疫耐受[13]。

5 前景展望

研究表明轉變代謝途徑在誘導DC表型和功能的改變中具有舉足輕重的作用，目前已有一些研究應用DC疫苗、tol-DC治療自身免疫性疾病、改善移植后免疫排斥反應等，但通過調節DC代謝途徑誘導免疫耐受還需要進行大量的實驗及臨床研究，但隨著研究不斷深入，必將推動自身免疫性疾病的治療不斷發展。