BCAR3、SCEL及LIFR mRNA在帕金森病患者血清胞外囊泡中異常表達

劉 郁，張靜靜，呂榮祥，王文盛

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種神經退行性疾病，主要表現為運動功能進行性減退，其發病機制與腦黑質或大腦基底神經節細胞死亡或功能異常有關[1]，且多數PD患者表現為神經元病理性蛋白質累積[2]。盡管如此，PD發生發展的分子機制仍未完全闡明，深入開展PD相關的分子標志物研究對于該病的早期診斷以及治療研究至關重要。越來越多的證據表明，血清來源的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等來調節受體細胞的生物學活性，因其穩定性好、不易降解、取材方便，可為疾病診斷、治療及基礎研究提供大量有價值的信息，已經成為多種疾病研究的熱點[3]，但其在PD中的研究卻十分有限。

本研究通過表達譜芯片分析了PD患者與健康個體血清EVs中mRNA表達差異，探索存在于PD患者血清EVs中新的異常表達基因，為PD相關的診斷和神經保護研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月～2017年11月于我院神經內科確診的PD患者22例，健康對照個體16例。PD患者納入標準：(1)符合2015年國際運動障礙協會的帕金森病診斷標準[4]；(2)無嚴重基礎性疾病和其他內科合并癥；(3)無精神類疾病，能夠配合研究。排除標準：(1)由于藥物、創傷或其他腦血管疾病等已知原因引起的繼發性PD；(2)近期接受過藥物治療的PD患者；(3)早發性帕金森患者(起病年齡≤50歲)。本研究經寧波市第六醫院倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 血清胞外囊泡提取、鑒定及RNA提取 收集受試者外周血5 ml，待血液凝固后3000 rpm離心10 min，小心將上清吸出備用。血清EVs及其RNA提取采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒(QIAGEN)，具體方法參照生產商說明書。為觀察血清EVs形態，將Buffer XE洗脫下來的外泌體滴加在載樣銅網上，待其干燥后用1%的乙酸雙氧鈾負染，負染后用透射電子顯微鏡觀察EVs結構。

1.3 mRNA表達譜芯片分析 PD患者及健康個體血清EVs來源的RNA經定量后，采用Affymetrix GeneChip?Human Genome U133 Plus 2.0芯片(Thermo Fisher Scientific)進行mRNA差異表達分析，每個RNA樣品上樣量為300 ng，具體操作方法參見生產商提供的說明書及早期報道[5]。R軟件對PD患者及健康個體血清EVs mRNA表達水平進行差異分析，log2Fold Change(FC)>2或<-2，且P<0.01時，認為差異基因具有統計學意義。

1.4 實時定量PCR反應 實時定量PCR反應(qRT-PCR)用于差異表達基因驗證。引物序列經Primer premier 5.0和Oligo 6.0軟件設計后，由Invitrogen公司(Thermo Fisher Scientific)合成。M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程公司)用于RNA反轉錄，產物cDNA作為RT-PCR模板用于基因表達分析。使用MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)試劑，以cDNA為模板，采用ABI 7500實時PCR檢測系統(Applied Biosystems)進行實時定量PCR，GAPDH作為內對照，以2-△△CT進行相對定量分析，所有實驗獨立重復3次，以確定EVs中mRNA相對水平。

2 結 果

2.1 受試者一般資料比較 健康對照個體中，男9例(56.3%)，女7例(43.8%)，平均年齡(58.26±3.23)歲；PD患者中，男10例(45.5%)，女12例(54.5%)，平均年齡(57.51±2.19)歲。兩組受試者性別(χ2=0.432，P=0.511)及年齡(t=0.5847，P=0.575)間無統計學差異(P>0.05)，兩組間具有可比性。

2.2 PD患者血清EVs中46個mRNA異常表達 EVs洗脫液經負染后，可在透射電子顯微鏡下觀察到直徑約30～100 nm的小囊泡，結果證實已從受試者血清中提取到EVs(見圖1)。經表達譜芯片分析發現，與健康對照個體(n=6)相比，PD患者(n=6)血清EVs中有46個mRNA表達水平存在顯著差異，其中26個mRNA顯著上調，20個mRNA顯著下調(2

2.3 PD患者血清EVs中8個mRNA持續異常表達 qRT-PCR進一步驗證上述差異mRNA在健康對照個體(n=16)和PD患者(n=22)血清EVs中的表達。結果發現，與健康對照個體相比，BCAR3(t=10.58，P=0.0005)、SCEL(t=7.517，P=0.0017)、KLHK12(t=3.988，P=0.0163)、GIPR(t=9.601，P=0.0007)、DZANK1(t=5.008，P=0.0074)在PD患者血清EVs中持續上調；而LIFR(t=4.514，P=0.0107)、ANKRD53(t=11.89，P=0.0003)和TMEM100(t=8.561，P=0.0010)在PD患者血清EVs中持續下調(見圖3A、B)。

2.4 BCAR3、SCEL及LIFR特異性存在于PD患者血清EVs中 為明確持續差異表達的8個mRNA是否特異存在于PD患者血清EVs中，qRT-PCR分別檢測了這些mRNA在PD患者血清EVs和去EVs血清中的相對水平。結果發現，與去EVs的血清相比，BCAR3和SCEL在PD患者血清EVs中表達水平顯著上調(t=3.614，P=0.0225；t=4.595,P=0.0101)，LIFR在PD患者血清EVs中表達水平顯著下調(t=24.34，P<0.0001)(見圖4)。ANKRD53、TMEM100、GIRP、DZANK1及KLHL12在PD患者血清EVs和去EVs的血清間表達水平無統計學差異(P>0.05)。以上結果證實，BCAR3、SCEL及LIFR特異性存在于PD患者血清EVs中。

表1 PD患者血清EVs中顯著差異表達的前20個基因

基因名變化倍數(log2FC)平均表達量t值P值DNAJC1PLAG1F10112ITM2CSDCCAG3GEMIN6LIFRANKRD53CADPSBCAR3TMEM100SCELLIN28ATAF7LKLHL12GIPRDZANK1NAG18ZNF135-2.0601923582.6293150593.130124828-2.026310693-2.2186852652.448153441-2.5354686642.121684895-2.2376487792.583387417-2.291713332.085607137-2.024172141-2.0037439472.2145528842.2811482122.3717337032.1880041642.0953708325.0851773.0699282.6108355.0974374.6403064.1965573.1601443.8547644.5678183.6105753.4621092.8638324.3621084.3032115.3507085.2638763.8532283.0692441.897475-9.086648.2640596.147836-5.90764-5.292725.175882-5.075074.759949-4.738454.68193-4.653554.535008-4.30904-4.287284.2441354.1740124.1245424.0281073.8648326.48E-071.84E-063.88E-055.69E-050.0001580.0001920.0002290.0003970.0004130.0004560.000480.0005940.0008940.0009310.0010070.0011460.0012550.00150.002034

圖1 典型的血清EVs電鏡圖

圖2 健康個體及PD患者血清EVs中差異基因熱圖

圖3 qRT-PCR驗證健康個體及PD患者血清EVs中差異mRNA的表達*P<0.05

圖4 持續差異mRNA在PD患者血清EVs及去EVs血清中的表達*P<0.05

3 討 論

本研究采用表達譜芯片對比分析了PD患者和健康個體血清EVs中差異表達的mRNA，實時定量PCR對差異表達基因進行驗證。結果發現，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達水平持續上調，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達水平持續下調。其中，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs和去EVs的血清中存在顯著差異。本研究結果首次證實，BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者血清EVs中表達水平異常改變，且特異存在于PD患者的EVs中。

隨著精準醫學的快速發展，探索與PD發生發展相關的分子靶標可以增強我們對疾病的認識[6]。近年來，研究發現血清EVs可以遞送大量的生物活性物質到受體細胞，參與多種疾病的發生發展。這些生物活性物質包括miRNA、lncRNA、mRNA、DNA、蛋白質及脂質等，其中以miRNA含量最多，研究最為廣泛[7]。越來越多的與PD發生發展相關的EVs內容物逐漸被發現[8]。例如，PD患者尿液EVs中Ser(P)-1292 LRRK2水平升高，并與患者的意識障礙程度和自理能力密切相關[9]。Cao等人研究發現PD患者血清EVs中miR-19b表達水平下調，miR-195和miR-24表達水平上調，它們在血清中的表達水平可能有助于PD診斷[10]。此外，研究還發現PD患者腦脊液EVs中含有高水平的α-突觸核蛋白，被受體細胞吸收后可引起細胞毒性[11,12]。然而，有關PD患者血清EVs中mRNA差異表達的研究則十分有限。本研究首次通過表達譜芯片分析了PD患者血清EVs中差異表達的mRNA，經PCR驗證后發現，BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達水平上調，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達水平下調。

體液EVs RNA已經成為多種疾病診斷及預后研究的熱點，特別是血清EVs中的RNA因其具有較好的穩定性且取材方便，已具備較好的臨床應用前景[13]。然而，以往報道的血清標志物主要以游離于血清中的分子為主，本研究則重點關注了PD和正常對照個體血清EVs中差異表達的mRNA。為了進一步證實這些差異表達的mRNA是否特異地存在于血清EVs中，我們分別檢測了這些差異基因在PD患者血清EVs以及去除EVs后血清中的表達。結果發現，乳腺癌抗雌激素藥物耐藥性基因3(Breast cancer anti-estrogen resistance gene 3，BCAR3)和Sciellin蛋白(SCEL)在PD患者血清EVs中的表達水平顯著高于去除EVs的血清，而白血病抑制因子受體(LIF receptor alpha，LIFR)在PD患者血清EVs中的表達水平則顯著低于去EVs的血清。由此證實，BCAR3、SCEL及LIFR是特異性地存在于PD患者血清EVs中的差異表達基因。

由于PD的發生發展與大腦神經元損傷密切相關[14]，而血清EVs又非常容易穿過血腦屏障將分子特異性地遞送到中樞神經系統[15]，因此EVs中異常表達的分子很可能通過不同的信號轉導途徑參與PD進展。然而，目前有關BCAR3、SCEL及LIFR在PD發生發展中作用機制的研究十分有限。LIFR主要參與細胞分化、增殖和存活，其信號轉導途徑在神經系統發育中起關鍵作用，并在PD患者海馬和扣帶回部位表達水平顯著上調[16]，但其影響PD進展的可能機制尚未報道。本研究發現，LIFR表達水平在PD患者血清EVs中顯著下調，但其功能仍有待于進一步研究。BCAR3可導致乳腺癌細胞雌激素非依賴性增殖，與乳腺癌發生發展密切相關[17,18]。同樣，有研究發現SCEL低表達與結直腸癌的遷移及侵襲能力增強有關[19]。然而，BCAR3和SCEL與PD發生發展間的關系目前尚未被報道。

總之，本研究首次發現BCAR3、SCEL、KLHK12、GIPR、DZANK1在PD患者血清EVs中表達水平上調，LIFR、ANKRD53和TMEM 100表達水平下調。其中，BCAR3、SCEL及LIFR是特異存在于PD患者血清EVs中的差異表達基因。本研究也存在一定的局限性，例如缺少機制研究，尚不能進一步明確上述差異表達的mRNA在PD發生發展中的具體作用，今后仍需在臨床水平、動物水平及細胞分子水平進一步探討其可能的機制。然而，目前的結果可以明確血清EVs中BCAR3、SCEL及LIFR在PD患者中異常表達，可能與PD發生發展密切相關，本研究結果將為EVs相關PD早期診斷以及神經保護研究提供了初步的理論依據。