外泌體與缺血性卒中的研究進展

展珊珊，王 銳，王毅飛綜述，付 錦審校

腦血管疾病是危害人類健康的重大疾病，全球每年約有1500萬人患有腦卒中，約有500萬人死亡，是造成死亡的第二大病因,也是長期致殘的主要原因[1]。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中占全部卒中的73%～86%[2]。對于缺血性卒中目前除了超早期靜脈溶栓或血管內治療外尚無有效治療方法。近年來，外泌體因其獨特的特點而受到廣泛關注如低免疫原性、低毒性和生物降解性、穿越血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的能力等，在缺血性腦卒中的診斷預后及治療中發揮重要作用。

1 外泌體特點及標志

外泌體是細胞外囊泡的一種，直徑約為30～100 nm。外泌體通常包裹在脂質雙層膜中，脂質雙層膜用于運輸和保護外泌體腔內物質免受細胞外環境的破壞[3]。2007年Valadi等人首次證實外泌體內存在RNA，包括mRNA及miRNA和其他非編碼RNA[4]。之后又發現外泌體還攜帶單鏈DNA、雙鏈DNA、擴增的致癌基因序列、轉座因子和線粒體DNA[5,6]。外泌體還可以攜帶蛋白質和多肽。在外泌體攜帶的蛋白中一些為常見蛋白質與細胞類型無關，目前認為CD9、Alix、CD63、TSG101和CD81都可以用來作為外泌體識別或區別其他細胞外囊泡的標志蛋白[4,7]。還有一些涉及外泌體生物發生的、表現出組織/細胞類型特異性的蛋白質[7]，目前研究表明，外泌體內含有多種參與腦修復功能的蛋白質，包括突觸傳遞和軸突生長等[8,9]。

人體幾乎所有的細胞中均可釋放出外泌體，并且廣泛存在于人體體液中，在特定條件下在體液中遠距離傳播[3]。最近發現，在卒中后炎癥的條件下[10]，外泌體通過被腦微血管內皮細胞內吞作用將其內化后穿越BBB進入中樞神經系統。

2 外泌體作為缺血性卒中的早期診斷及預后的標志物

缺血性腦卒中時外泌體可從腦神經細胞中合成釋放并可通過BBB在外周血中檢測到。此外，血液細胞和內皮細胞也可在腦卒中后作出應答并釋放外泌體到血液中。因此，外泌體可能是反映病理進展和促進卒中恢復的生物標志物。

Ji等人[11]納入65名急性缺血性卒中患者以及66名非卒中志愿者作為對照組。通過檢測腦源外泌體miR-9和miR-124表達水平。發現與對照組相比，急性缺血性卒中患者血清外泌體濃度以及血清腦源外泌體miR-9、miR-124中位數水平顯著升高。并且血清外泌體miR-9和外泌體miR-124水平與NIHSS評分、梗死體積呈正相關。因此，血清腦源外泌體miR-9和miR-124是診斷缺血性卒中和評估缺血性損傷程度的有前途的生物標志物。Chen等人[12]也發現血清外泌體miR-223可作為急性缺血性腦卒中發病72 h內血清標志物，其表達水平與發病時NIHSS評分呈正相關，并且血清外泌體miR-223表達水平高，患者短期預后差。

在溶栓時間窗內TIA與缺血性腦卒中的鑒別是困難的。應用最新的成像技術雖然可以在時間窗口內診斷TIA，但是其檢查時間延遲和價格昂貴。有研究[13]通過TUNEL檢測在不同缺血時間的腦組織凋亡情況，發現腦缺血5 min時凋亡發生與假手術組無統計學差異，而腦缺血10 min時與假手術組及腦缺血5 min組相比凋亡明顯增加。同步檢測血清及腦脊液外泌體miR-122-5p和miR-300-3p表達發現血漿外泌體miR-122-5p在假手術組及腦缺血5 min組表達無明顯差異而腦缺血10 min組表達升高，miR-300-3p在腦缺血5 min組與假手術組相比表達升高而在腦缺血10 min組表達又減少。提示外泌體miR-122-5p和外泌體miR-300-3p可能是TIA的生物標志物。

缺血性腦卒中依據發病時間可以分為不同階段，早期、準確的診斷可大大改善患者預后。缺血性腦卒中后有許多生物標志物，如蛋白質、核酸或代謝物，它們可能與缺血性腦卒中的特定生理和病理過程有關，然而它們的特異性和區分腦卒中不同階段特別是超急性期或類卒中的能力尚不確定[14]。Wang等人[15]研究血漿來源外泌體miR-21-5p和外泌體miR-30a-5p在缺血性腦梗死不同時期的表達情況。研究發現外泌體miR-21-5p和miR-30a-5p是診斷缺血性腦梗死和鑒別缺血性腦梗死超急性期(小于6 h)、亞急性期(8～14 d)和恢復期(大于14 d)的有價值的生物標志物，尤其是miR-30a-5p可用于缺血性腦梗死超急性期的診斷，進而對缺血性腦梗死的溶栓治療中的可能具有臨床價值。

值得注意的是，雖然循環miRNA和外泌體miRNA都是缺血性卒中的新的潛在血清標志物，循環miRNA包含外泌體miRNA，但二者不一定具有相關性。一項研究[16]在大鼠短暫性腦缺血模型及大鼠永久性缺血模型中定量測定血清外泌體miR-126總水平，同時測量梗死和神經預后。結果表明，無論在永久性還是暫時性缺血模型中，外泌體miR-126缺血后不同時間點變化相同。而血清miR-126在永久缺血模型與短暫缺血模型缺血相同時間段變化不同。這說明雖然循環miRNA和外泌體miRNA都可作為缺血性卒中的血清標志物，即使在同一疾病過程中的同一個循環miRNA或外泌體miRNA二者表達存在不同機制。

內皮細胞及血小板在動脈粥樣硬化腦梗死發生發展中發揮重要作用。Edward等人[17]在18例缺血性腦血管病患者及年齡和性別匹配的18例對照者中檢測內皮細胞來源外泌體和血小板來源外泌體中蛋白表達情況，發現在缺血性腦血管病患者中無論是血漿中的促動脈粥樣硬化蛋白還是內皮細胞或血小板來源的外泌體中促動脈粥樣硬化蛋白表達水平明顯高于對照組。此外，與對照組相比，內皮細胞來源外泌體中YAP蛋白水平較高，P(S127)-YAP蛋白表達水平較低，這與動脈粥樣硬化中機械力敏感系統活性增強是一致的。這表明檢測外泌體蛋白及其來源作為生物標志物具有潛在的臨床價值。

3 外泌體與缺血性卒中的治療

干細胞為治療缺血性腦卒中被證明可改善神經系統預后。近期研究表明干細胞治療缺血性腦卒中療效的主要機制不是通過細胞替代或移植細胞分化到腦細胞來介導的，而是通過干細胞分泌旁分泌因子促進缺血性腦卒中后神經系統癥狀改善[18]。因此，卒中后靜脈注射無細胞間充質干細胞外泌體治療為腦卒中提供了一種新的治療方法，具有替代細胞治療的潛力。

Xin等人[19]體外在間充質干細胞(MSCs)細胞中過表達miR-133b后提取外泌體(Ex-miR-133b+)給與MCAO大鼠治療，通過綠色熒光蛋白標記外泌體顯示，來自MSCs釋放的外泌體miR-133b向星形膠質細胞和神經元的轉移，調節基因表達，進而有利于腦卒中后神經突出重塑和功能恢復。進一步對Ex-miR-133b+改善了卒中后神經功能恢復機制研究發現[20]，與Ex-Naive治療相比Ex-miR-133b+顯著增加OGD后星形膠質細胞釋放的外泌體。與使用Ex-Con處置的OGD星形膠質細胞外泌體相比，使用Ex-miR-133b+處置的OGD星形膠質細胞獲得的外泌體治療能顯著增加培養的大鼠皮質胚胎神經元的神經突分支和伸長。這表明，Ex-miR-133b+外泌體能通過刺激星形細胞釋放神經外泌體，進一步增強治療效果。

Xin等人另一項研究[21]在大鼠大腦中動脈阻塞模型中(MCAo)尾靜脈注入從體外MSCs中提取的外泌體，發現從體外MSCs中提取的外泌體顯著增強神經突重塑、神經發生和血管生成，改善卒中大鼠的功能恢復。之后又后續報道[22]體外收集過表達miR-17-92簇的MSCs來源外泌體給與大鼠腦缺血模型后尾靜脈注射，發現體外過表達miR-17-92簇的MSC來源的外泌體與MSC來源的外泌體相比可顯著促進卒中后神經可塑性和功能恢復。由此可見，通過調控外泌體內分子可以增強療效。

Xiao等人[23]在骨髓來源間充質干細胞(BMSCs)外泌體與OLs共培養后進行OGD處理，發現標記的BMSCs來源的外泌體miR-134通過直接抑制caspase-8的表達和活性顯著抑制OLs細胞凋亡。

脂肪源性干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)已被證實可促進腦卒中后腦血管重構。Yang等人[24]通過體外模型證實ADSCs-Exos促進體外OGD后BMECs血管生成，并且外泌體來源的miR-181b-5p在體外通過直接靶向抑制TRPM7促進OGD后BMEC血管生成。

在腦卒中后的恢復期，軸突再生與功能恢復有關，但軸突再生受到星形膠質細胞瘢痕形成的抑制。Hira等人[25]研究發現在腦缺血動物模型中使用Sema3A抑制劑(Sema3A-I)可促進神經功能恢復及減少活化的星形膠質細胞。進一步研究表明Sema3A-I促進神經功能恢復機制是通過促進星形膠質細胞分泌的外泌體對神經軸突發揮的作用。

除卒中后靜脈注射無細胞間充質干細胞外泌體治療方式外，近期帶有靶向能力的裝載分子或藥物的外泌體治療是一種新的外泌體治療方式。

Yang等人[26]通過帶有神經元特異性靶向的Lamp2b-RVG修飾外泌體中轉染miR-124模擬物，之后對缺血小鼠模型進行靜脈注射治療，發現帶有miR-124的Lamp2b-RVG修飾外泌體可以明顯定位到受損腦區，并且促進大腦皮質的神經祖細胞轉化神經元表型,并通過強健的皮質神經發生保護缺血性損傷。

最近有研究者[27]通過一種簡單、快速和生物正交化學方法將c肽(RGDyK)與外泌體表面結合。構成cRGD-Exo。在MCAO小鼠模型中，cRGD-Exo在靜脈給藥后有效的靶向缺血性腦損傷區域。

因此，修飾后的外泌體可用于靶向腦組織并輸送基因藥物進行治療，具有很大的臨床應用潛力。

4 展 望

目前，缺血性腦卒中的康復期治療依然是腦卒中治療的難點。外泌體的發現推動治療方法的多樣化。在缺血性腦卒中的治療領域，干細胞外泌體給藥治療由于其靶向能力不足限制了其臨床應用。因此，需開發效率更高、靶向性更好的修飾后外泌體載體。