紫地榆不同提取物體內防齲研究

盧 燕，李秋艷，李茹芳，藍 海，2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.滇西應用技術大學公共基礎教學部，云南大理 671006）

齲齒又稱“蛀牙”，是一種常見的牙組織被慢性破壞的感染性疾病〔1〕。齲病由細菌、食物、個體等多種因素引起，影響牙齒的美觀、發音，更嚴重地影響了牙齒的功能〔2〕，齲病可直接損害牙釉質、牙本質和牙骨質，若不及時治療，一個很小的齲洞會不斷發展并最終損害整個牙體，造成嚴重后果。前期體外實驗發現紫地榆不同提取物有一定的防齲作用〔3-4〕。本實驗將研究紫地榆不同提取物在動物體內是否也有防齲作用。

1 材料

1.1 主要儀器Y135型中藥材粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；COOL SAFE95-15冷凍干燥機（Genen Company Limited）；XTL-3B體視顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.2 藥液配制將紫地榆根粉碎，稱取20 006.98 g，用95%工業乙醇浸泡48 h，旋蒸得到浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯和正丁醇部分（以下分別稱為乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物），冷凍干燥成粉末，均用蒸餾水將其配置成2 mg∕mL溶液。

1.3 細菌、培養基、動物、飼料變形鏈球菌（Streptococcus mutans，ATC25175）；TPY液體培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）；TPY固體培養基：每100 mL TPY液體培養基中加2 g瓊脂，高壓滅菌；SD大鼠，共40只，雌雄各半，體質量約200 g，購買于昆明楚商科技有限公司，合格證號：SYXK（滇）2011-0004；致齲飼料2000#〔5〕，購買于北京博泰宏達生物技術有限公司。

2 方法

2.1 內源性細菌的除去SD大鼠40只，用普通飼料喂養1周。在大鼠飲用水中加入氨芐西林2.4 mg∕mL、鏈霉素0.5 mg∕mL，除去大鼠口腔內的內源性細菌，連續3 d。第3天用棉簽取大鼠口腔唾液，接種在TPY固體培養基上，37℃厭氧培養48 h，觀察口腔內細菌生長情況。實驗大鼠從第3天開始至實驗結束都喂養致齲飼料2000#。

2.2 變形鏈球菌的培養本實驗選用變形鏈球菌作為口腔致齲菌〔6〕。用接種環將凍存的變形鏈球菌接種在TPY固體培養基上，放在厭氧培養袋中，加入產氣袋，放入恒溫培養箱中，37℃培養48 h。將復蘇的變形鏈球菌轉種至TPY液體培養基中，37℃厭氧培養24 h，離心，取下面的細菌。

2.3 接種細菌用生理鹽水將菌液配成5×107CFU∕mL，用移液槍量取0.8 mL于1 mL離心管中，用棉簽蘸取接種于大鼠口腔內，剩余的用灌胃針注入大鼠口腔，連續3 d。第3天蘸取大鼠口腔唾液，接種在TPY固體培養基中，37℃厭氧培養48 h，觀察變形鏈球菌生長情況。

2.4 給藥第5天將大鼠分成4組，每組10只，雌雄各半。分別用蒸餾水配制的2 mg∕mL紫地榆乙酸乙酯提取溶液、2 mg∕mL正丁醇提取溶液、0.1%NaF溶液、蒸餾水處理大鼠口腔。具體方法為左手抓住大鼠頸部成仰臥位，右手用棉簽分別蘸取上述溶液涂在大鼠口腔各個部位，包括前切牙、后磨牙、舌面、舌背，1 mL∕只，剩余的溶液用灌胃針注入大鼠口腔中，處理后3 h內禁食禁水，每天處理2次（上午9：00，下午8：00），連續5周，整個操作由同一人完成。每周稱量1次大鼠體質量。在最后1周用10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，取上下頜骨，去除肉組織，用4 mg∕mL紫脲酸銨染色液染色36 h，洗凈，用超薄金剛磨砂片沿牙遠近中心向矢狀半切，清洗干凈，干燥。

2.5 Keyes法評價齲損目前體內牙齒評分均用Keyes評分法〔5〕，在體視顯微鏡下對大鼠磨牙光滑面齲、窩溝面齲進行分類計分，齲損程度分為E、Ds、Dm、Dx四級，依次代表釉質齲，牙本質淺層齲、中層齲、深層齲。

2.6 掃描電鏡觀察大鼠切牙將大鼠切牙沿牙遠近中心向矢狀半切，用掃描電鏡觀察致密度。

2.7 統計學分析數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠基本情況在實驗過程中，觀察大鼠的毛發、呼吸、飲食基本正常，行為靈活，體質量逐漸增加，統計分析紫地榆不同提取物組、NaF組、蒸餾水組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量變化（±s,n=10，g）

表1 各組大鼠體質量變化（±s,n=10，g）

注：組間比較P＞0.05，差異無統計學意義。

組別乙酸乙酯提取物組給藥前245.65±22.10給藥1周247.29±26.43給藥2周253.72±26.49給藥3周252.41±27.10給藥4周248.88±26.27給藥5周267.34±32.06正丁醇提取物組NaF組249.58±20.96 242.96±26.33 250.50±25.68 246.56±26.97 259.79±25.41 254.00±28.29 254.73±26.76 255.30±30.49 248.80±26.33 264.52±45.29 257.61±27.67 260.00±31.47 250.06±54.67空白組245.09±36.21257.33±39.16250.76±18.39256.91±49.64244.51±51.55

3.2 光滑面Keyes記分大鼠牙光滑面齲損只觀察到E級、Ds級，Dm、Dx級均未觀察到。E級齲損、Ds級齲損中紫地榆不同提取物組與蒸餾水組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但紫地榆不同提取物組與NaF組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；紫地榆不同提取物組間比較，差異均沒有統計學意義（P＞0.05）。且NaF組未觀察到Ds級齲損。見表2。

表2 光滑面Keyes記分（xˉ±s,n=10）

3.3 窩溝面Keyes記分E級齲損中，與蒸餾水組比較，各組差異均有統計學意義（P＜0.05），同時，紫地榆乙酸乙酯提取物組與NaF組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；但正丁醇提取物組與NaF組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Ds、Dm、Dx級齲損中，各組與蒸餾水組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），但與NaF組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；紫地榆不同提取物組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。NaF組中未檢測到Dm、Dx級齲損，乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組未檢測到Dx級齲損，只有蒸餾水組中檢測到E、Ds、Dm、Dx級齲損。見表3。

表3 窩溝齲Keyes記分（xˉ±s,n=10）

3.4 掃描電鏡觀察紫地榆乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組表面裂縫明顯比蒸餾水組、NaF組少，正丁醇組比乙酸乙酯提取物組更致密，因此有更好的再礦化作用。見圖1。

圖1 大鼠切牙掃描電鏡圖（×5 000）

4 討論

Keyes記分由P.H.Keyes在1958年提出，是目前應用最廣泛的評分方法。E級記分反應齲損的廣度，Ds、Dm、Dx級齲損反應齲損的深度，Ds級齲損為牙釉質和1∕4牙本質，Dm級齲損為1∕4～3∕4牙本質，Dx級齲損大于等于3∕4牙本質，Dx級齲損最嚴重。當相鄰的數值間有輕微重疊時，在不相鄰的數值間可以有忽略不計的重疊部分，因為生物差異的意義遠遠超過重疊部分。雖然都是人為評分，但實驗數據的意義遠遠超過人為的誤差。

在本實驗中，與蒸餾水組相比，紫地榆不同提取物組的齲損分數明顯更低，無論是光滑面還是窩溝各級評分都更低，差異有統計學意義（P＜0.05），但與NaF組相比，除了乙酸乙酯提取物組在窩溝E級齲損中差異有統計學意義（P＜0.05）外，其他各級差異均無統計學意義（P＞0.05）。且紫地榆乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組無最深的牙本質深層齲，牙本質中層齲分較低，因此，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物有防齲效果，評分比蒸餾水高，比NaF組低。掃描電鏡結果顯示，紫地榆乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物組比蒸餾水、NaF組表面更致密，裂縫更少，再礦化效果更好。

目前常用防齲的物質主要為氟化物，但存在一定的弊端，如出現氟斑牙等，且吞咽不利于兒童的發展〔7〕。天然藥物以其無毒副作用等優勢越來越受到大眾青睞，而研究發現，天然防齲藥物的成分雖然復雜，但主要成分為鞣質〔8-11〕。紫地榆的主要成分為鞣質類成分，因此猜測紫地榆中有防齲作用的為鞣質類成分，但需要進一步研究。