基于質譜技術的乳腺癌代謝組學研究進展

(1.南華大學，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬郴州醫院轉化醫學研究所，湖南 郴州 423000)

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤和癌癥死亡原因，是一個世界性的女性健康問題，占所有女性癌癥病例的1/4[1]。在我國，隨著環境改變以及工作壓力增加，乳腺癌患病率逐年上升且呈年輕化。乳腺癌的發生和發展是一個多因素過程，除遺傳因素外，年齡、生育與否、飲食和環境、外源性雌激素都能影響乳腺癌發生發展[2]。早期乳腺癌治愈率可達90%，然而大多數乳腺癌在發現之時已到中晚期，因此，建立早期診斷和有效篩查方法能改善乳腺癌患者生存率。目前推薦的乳腺導管原位癌(DCIS)檢查和分期方法包括病史和體格檢查，雙側乳腺X線檢查，病理學評估，腫瘤雌激素受體(ER)狀態的確定以及MRI表現[3]，現有檢測技術成熟、臨床應用廣泛，但其敏感性及特異性較差。鑒于乳腺癌的高發病率和高死亡率，迫切需要開發出方便、快速、高敏感性和特異性的新技術來尋找診斷、預后、分期、治療反應和治療靶點的生物標志物，以便有效提高乳腺癌的臨床治愈率。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后的系統生物學的一個新分支，它通過研究受刺激或受干擾的生物體(如基因突變或病理生理狀態)的代謝產物譜及其動態變化來揭示機體的代謝網絡[4]。代謝組學的研究過程包括生物樣本采集、代謝產物的檢測與鑒定、數據分析以及生物學信息的挖掘及闡釋。其研究對象為復雜的生物體系，常見的生物樣本包括生物體液(尿液、血液、唾液、膽汁等)、動物或人體組織(腫瘤、肝臟、脂肪組織等)以及細胞。代謝組學以其高靈敏度、高分辨率、高通量的技術特點以及無創、利于實施等優點在癌癥研究領域得到了廣泛應用，展現出了巨大的發展潛力。腫瘤生物標志物能夠反映腫瘤發生、發展、復發與預后的情況，對腫瘤的早期診斷、療效評價、預后監控等方面具有重要價值[5]。

腫瘤的發生和進展與代謝物的改變密切相關，在乳腺癌惡性轉化過程中，乳腺癌細胞的代謝組發生了一系列深刻的重組，這種代謝改變是由基因組計劃調控的，并受到腫瘤微環境的影響，代謝改變在腫瘤發生發展過程中起關鍵作用，表現出對特定代謝途徑的依賴，主要是在能量代謝和生物合成過程中發生的代謝網絡變化[6]，因此，代謝組學可以在乳腺癌的早期篩查、轉移與復發、療效評價等方面發揮重要作用，并且已取得一定的進展，有望為乳腺癌的診斷治療提供新的思路。

1 代謝組學與質譜技術

代謝組學是指由于遺傳信息的變化、生物的刺激或者病理生理的影響導致生物體系內的總體動態改變，成為了繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后系統生物學研究的又一重要領域。通常研究代謝組學有兩種方法[7]:(1)相對較慢的技術，產生結構信息，從而識別代謝產物，如核磁共振(NMR)；(2)相對快速識別診斷信號的方法，如質譜法(MS)。

質譜法(MS)又分為液相色譜-質譜(LC-MS)及氣相色譜-質譜(GC-MS)，其中LC-MS是最靈敏的生物分子檢測技術，而GC-MS技術提供了一個相對更全面的色譜技術和具有更高的分離效率以及可用的參考化合物文庫。GC-MS和LC-MS的相互結合應用可以更好地表達不同類別的化合物。

2 質譜技術在乳腺癌代謝組學中的應用

2.1 乳腺癌的篩查

不同的代謝轉化對癌細胞維持高增殖率和抵抗細胞死亡信號至關重要。這種代謝轉化導致獨特的細胞代謝表型，通常由腫瘤中不同的代謝標記物以及循環血液反映。因此,對這些變化的代謝物進行分析和檢測,能夠有效地鑒別出與疾病狀態相關的生物標志物,有助于臨床疾病的篩查診斷。基于血清或血漿的代謝組學是一種很有潛力的乳腺癌診斷方法。在乳腺癌患者血液中存在代謝組學標記物，乳腺癌患者代謝譜中描述的變化可能以不同方式影響疾病生物學，可以通過改變腫瘤的分化狀態，誘導轉移表型或促使腫瘤在氧化應激條件下更有活力，從而促進腫瘤發生[8]。來自乳腺癌患者血液中的代謝組學研究對乳腺癌的篩查和診斷是具有一定的可行性的。代謝生物標志物被證明可以鑒別乳腺癌和正常樣本，并且具有極高的敏感性和特異性，這可能會成為新的篩查和診斷乳腺癌的方法。

Huang等[9]使用液相色譜/飛行時間質譜(LC-TOF-MS)和氣相色譜/飛行時間質譜(GC-TOF-MS)研究了乳腺癌診斷的關鍵代謝通路特征，開發了一種新的基于代謝途徑的疾病診斷代謝組學模型，所得的全期和早期診斷模型是高度準確的，平均AUC(曲線下面積，受試者操作特征曲線)為0.968和0.934，靈敏度為0.946和0.954，特異性為0.934和0.918。Wang等[10]基于DBS(Dried Blood Spot)的MS代謝組學分析了258例新確診的乳腺癌患者以及159例良性乳腺疾病患者(包括78名健康人)的血液代謝物來篩選具有乳腺癌診斷潛力的代謝標志物，建立了一個由Pip、Asn、Pro、C14:1/C16、Phe/Tyr和Gly/Ala六個血液參數組成的診斷模型，該模型區分乳腺癌和非乳腺癌的靈敏度和特異性分別為92.2%和84.4%。

Takayama等[11]通過超高壓液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定唾液中的多胺(包括它們的乙酰化形式)，發現有八種多胺(如SPM，CAD，Ac-SPM，N1-Ac-SPD，N8-Ac-SPD)與癌癥患者強相關。一個簡單的一階方程(Y=0.5XSPM-3XAc-SPM-0.15XSPD-3.5XN8-Ac-SPD+0.5XN1-Ac-SPD+0.04XCAD)被用來區分乳腺癌患者和健康人群，采用N8-Ac-SPD/(N1-Ac-SPD+N8-Ac-SPD)比值進行ROC分析，其敏感性和特異性均接近80%。Johnson等[12]通過MS對MCF-7乳腺癌異種移植小鼠模型尿液進行代謝組學分析，發現腸內酯葡萄糖醛酸、香豆酸硫酸酯、癸酸葡糖苷酸、牛磺酸差異表達顯著，揭示了腫瘤生長與脂肪酸合成和腸道微生物代謝產物的潛在抗增殖作用之間存在相關性。表明對于乳腺癌患者的非侵入性體液診斷是有用的，可能成為臨床檢查的支持方法之一。

2.2 乳腺癌的分型

根據基因改變可將乳腺癌分為五個分子亞型：Luminal A、Luminal B、Luminal B HER2陽性(人類表皮生長因子受體2)富集、HER2過表達和三陰性乳腺癌[13]。由于乳腺癌的高度異質性，對代謝途徑的理解仍然不夠充分。針對不同的乳腺癌亞型患者經常會采用不同的治療方案,然而,即使針對同一亞型的乳腺癌患者也常會出現預后效果存在較大差異的情況。同時，雖然致癌基因和抑癌基因的突變被認為是惡性增長的最終原因，但細胞代謝變化是其對遺傳變化與細胞生理學功能改變的應答，目前，臨床試驗正在研究靶向糖酵解，谷氨酸分解，脂肪酸合成，缺氧誘導因子(HIF)信號傳導和其他途徑的代謝藥物。因此，為了確定從代謝藥物中獲益最多的患者群體，分析乳腺癌不同亞型的代謝變化譜非常重要。

為分析乳腺癌細胞系亞型之間的中心代謝差異，Willmann等[14]用氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜(GC-EI-MS)對乳腺癌與乳腺上皮細胞系進行代謝組學比較，發現在氨基酸代謝、三羧酸循環和糖酵解中存在顯著差異。所得數據可用于研究細胞系的PCA分類和乳腺癌與乳腺上皮細胞系的PLS-DA鑒別。Budczies等[15]用GC-TOF-MS研究了ER+和ER-乳腺癌患者組織的代謝組學。發現在ER+亞型中β-丙氨酸，2-羥基戊二酸，谷氨酸，黃嘌呤增加，谷氨酰胺減少。其中β-丙氨酸和谷氨酰胺變化最顯著，β-丙氨酸和4-氨基丁酸轉氨酶(ABAT)表達之間存在負相關關系。

Fan等[16]通過LC-MS和GC-MS測定乳腺癌患者和正常人的血漿代謝譜，鑒定了包括肉堿、溶血磷脂酰膽堿(20∶4)、脯氨酸、丙氨酸、溶血磷脂酰膽堿(16∶1)、糖原脫氧膽酸、纈氨酸和2-辛烯二酸等8種差異代謝物用于乳腺癌亞型的診斷。表明乳腺癌亞型的特征可能與其個體代謝特征相關，代謝物濃度的差異可能有助于乳腺癌的診斷以及乳腺癌亞型的確定。

2.3 乳腺癌的治療靶點研究

腫瘤細胞代謝重編程能平衡細胞能量需求和合成代謝，有助于疾病的進展。與非轉化細胞相比，快速增殖的惡性細胞的代謝需求差異表明靶向代謝可能是開發新型癌癥治療的潛在策略。癌細胞可以表現出對特定代謝途徑的依賴，以這些代謝途徑為靶點是一個很有前途的治療策略。開發利用代謝缺陷的新治療方法的關鍵步驟是識別與特定惡性腫瘤相關的代謝改變。代謝組學領域的進步使得測量廣譜細胞代謝物成為可能，并提供了一種鑒定與癌癥相關的特定代謝改變的方法。

Beatty等[17]應用GC-MS與LC-MS對三陰性乳腺癌(TNBC)和對照細胞進行了代謝組學研究。代謝圖譜揭示了兩種主要的TNBC代謝亞型，其中非基底細胞樣TNBC細胞系表現出對谷胱甘肽生物合成的相對較強的依賴性，以維持足夠的抗氧化能力從而支持腫瘤發生。表明谷胱甘肽生物合成途徑是TNBC的治療靶點，并以此為基礎確定了谷胱甘肽抑制劑(BSO)和柳氮磺胺吡啶(SASP)聯合治療的合理性——通過減少谷胱甘肽的合成，從而抑制腫瘤的生長。非靶向代謝組分析可以識別差異表達的代謝產物，這些代謝通路的依賴性可以指向新的治療策略。

大多數癌細胞對甲硫氨酸具有獨特的代謝需求，當甲硫氨酸被其代謝前體同型半胱氨酸替代時，癌細胞無法增殖。Borrego等[18]通過氣相色譜/飛行時間質譜法(GC-TOFMS)對同型半胱氨酸培養基中培養的三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-468及其甲硫氨酸不敏感衍生細胞系MDA-MB-468res-R8進行非靶向代謝組學研究其對甲硫氨酸應激的代謝反應。確定了兩種細胞系之間獨特的代謝反應，包括甲硫氨酸補救，嘌呤/嘧啶合成和三羧酸循環。MDAMB-468res-R8細胞比MDA-MB468細胞更早地響應這種細胞應激，更好地滿足代謝需求。揭示了與乳腺癌甲硫氨酸依賴性有關的代謝表型的動態變化，并進一步強調了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為腫瘤發生的主要調節因子的重要性可能成為治療干預的新靶點。

2.4 乳腺癌的治療反應監測

由于乳腺癌是一種臨床異質性疾病，在進行臨床治療時常導致不同的預后。識別對化療有反應者并因此提高病人長期生存率對治療方案有重要意義，而識別對化療無反應者則可及時改用其它可能的有效治療手段。乳腺癌代謝組學研究可以揭示乳腺癌代謝特征，鑒定乳腺癌新輔助化療反應的潛在生物標志物，為乳腺癌治療反應的監測提供重要依據。

牛磺酸是最豐富的游離氨基酸，參與人體許多重要的生物過程，并已被證明具有抗乳腺癌和其他腫瘤的活性。He等[19]用高通量氣相色譜-飛行時間質譜法(HT GC-TOFMS)研究牛磺酸在乳腺癌中的作用機制，鑒定出23種差異代謝物，分別參與能量、葡萄糖、氨基酸和核酸代謝，表明牛磺酸的抗腫瘤活性是通過對乳腺癌細胞代謝的改變調節的。這些差異代謝物可能是監測癌癥治療和臨床預后的潛在生物標志物，為進一步研究牛磺酸的抗腫瘤機制及開發治療乳腺癌的新策略提供了科學依據。

內源性雌酮水平與絕經后乳腺癌的發病率顯著相關。Kim等[20]應用高靈敏度的質量輔助激光解吸/電離質譜(MALDI-MS)定量平臺檢測內源性雌激素，成功地監測了由芳香酶抑制劑處理導致的MCF-7細胞中雌酮的代謝表達水平的變化。結果表明MALDI-MS定量方法可能是含酮代謝物的靶向代謝組學的一般方法，可以反映臨床條件和致病機理，用于臨床上疾病的治療反應監測。

3 結語與展望

綜前所述,基于質譜技術的代謝組學在乳腺癌的早期篩查、臨床分型、潛在治療靶點研究、療效評價及預后監測等相關的代謝性生物標志物研究方面已經取得了不錯的成果,但也面臨著不少挑戰,例如(1)應與基因組學、蛋白質組學整合,建立從基因水平、蛋白功能水平到終端代謝產物水平的系統模型,從系統生物學角度對乳腺癌有更深入全面的認識,篩選特異性的生物標志物;(2)與臨床轉化緊密結合，乳腺癌的候選特異代謝性生物標志物報道已有不少,但真正運用到臨床診治上還有待進一步探索和開發，并且代謝組學對許多內外因素非常敏感，微小的差異可能影響代謝譜，迫切需要規范實驗方法和數據分析技術;(3)代謝物的濃度動態變化跨度大，代謝物的組成非常復雜,且容易受到干擾,目前靠單一分析方法無法準確測量整個代謝組群，因此檢測技術仍需不斷突破;(4)代謝組學分析產生大量的數據，利用現有的代謝物數據庫對所有變化的代謝物進行全面識別是困難的，已鑒定的代謝物的變化機制也難以解釋；(5)乳腺癌并非一個孤立的腫瘤,其代謝過程還受所處內環境的影響,目前研究中所利用的組織樣本一般都獨立于腫瘤微環境體系,因此這也是進一步研究中值得探索的問題。

由于高發病率和高死亡率，乳腺癌成為全球女性死亡的第二大原因。為了更好的了解乳腺癌發生發展過程，通過結合不同的代謝分析技術，可以將人類乳腺癌組織的代謝組覆蓋最大化。腫瘤的病理生理過程涉及非常復雜的機制，其在不同發生階段會產生不同代謝產物，并且這些產物可能存在時空特異性，通過結合目前比較先進的質譜學分析技術，能夠更好地展示腫瘤不同發生過程的代謝產物。質譜學的代謝組學目前已經發展比較成熟，已經可以通過高通量的方式分析數百個生物樣本，并可以此為基礎建立相關數據庫，通過對數據的分析、挖掘與闡釋，能夠更好地認識腫瘤發生發展機制。代謝組學產生了許多新的生物學上的見解，可用于在腫瘤生物學基礎上對乳腺癌進行篩查與分型，以確定新的預后和預測標記，并發現未來治療干預的新靶點，隨著精準醫療時代的到來，其進步的范圍將繼續擴大，為許多等待更有效治療方案的癌癥患者帶來新的希望。