AQP4、KCNJ10基因與癲癇的關聯性研究進展

張小冬， 張天麗， 史 靜綜述， 李偉榮審校

癲癇是神經系統第二大類疾病，其發作是由于中樞神經系統“興奮”和“抑制”兩者之間的不平衡而引起的神經元的異常活動。研究者們逐漸發現，腦內神經細胞的興奮與抑制的失衡，主要與離子通道功能障礙以及神經遞質的改變有關。近年來人們對其發病機制的認識已由器官、組織水平逐漸深入到細胞和分子水平。除神經元之外，星形膠質細胞和小膠質細胞也參與了癲癇的發生與發展。眾所周知腦內細胞膜上的離子通道是調節神經元興奮性的結構基礎，與癲癇灶起源和擴散關系尤為密切。編碼離子通道蛋白的基因一旦發生突變，即可能出現電解質轉運和分布的異常，通過影響其膜電位進而引起神經組織興奮性異常改變，導致癲癇的發生。其中離子通道與癲癇的相關性較為明確(如鈉、鉀、鈣等)[1]。近年來國內外研究表明，在生理狀態下星形膠質細胞中水通道蛋白4(AQP4)及內向整流鉀離子通道(Kir4.1)協同調節中樞神經系統的水、電解質的穩態。這兩種膜蛋白不僅結構上相似，且在功能也存在一定的共耦聯關系。已有實驗發現兩者在癲癇的發病機制以及在癲癇治療中的耐藥性方面發揮著重要的作用。然而也有研究認為鉀通道的異常可能是機體對癲癇發作的保護性反應，并非癲癇灶點燃的原因。本文回顧了近年來星形膠質細胞中水通道蛋白4及內向整流鉀離子通道在調節神經元興奮性及癲癇發病的文獻，總結AQP4基因、CNKJ10基因在癲癇發病機制中的潛在作用，為抗癲癇的治療提供新思路。

1 AQP4基因與癲癇

AQP4基因由4個外顯子和3個內含子構成，位于染色體18q11.2與18q12.1之間的連接處。AQP4蛋白四級結構是具有獨立活性的亞單位組成的同源四聚體表達于細胞膜上，其氨基端和羧基端位于胞內，每個亞基含有6個疏水性的跨膜α右手螺旋結構，以及各亞基間含有5個長度不一的連接環[包含AQP家族成員共同的特征性結構天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重復串聯序列]，6個跨膜區域和5個連接環在中線處交叉重疊形成狹窄的開放水分子孔道，即被證實的“沙漏”模型，決定了AQP4對水的高通透性并調節水分子的轉運[2]。目前研究發現，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)在哺乳動物中共發現13種亞型[3]，其中AQP4是腦內含量最多且分布最廣的類型，主要分布于神經組織的支持細胞，如星形膠質細胞、神經膠質界膜、室管膜等部位，與水分子在腦細胞內的轉運有關。其中毛細血管周圍的星形膠質細胞的細胞膜是其最主要的表達區域[4]，而在靠近神經氈的一側則分布較少，這種極性分布的特點有利于水分子在膠質細胞、血液和腦脊液之間進行轉運，對腦內水分子代謝平衡調節及腦脊液產生方面起著重要作用。此外，大量研究發現AQP4還參與了星形膠質細胞的諸多生理功能，包括：鈣信號傳導、神經遞質的調節、突觸可塑性、神經再生等。因此，AQP4被認為與中樞神經系統癲癇、腦水腫、腦卒中[5]、多發性硬化、視神經脊髓炎[6]、創傷后腦損傷、帕金森病等密切相關。

水分子和鉀離子滲透壓的改變可以顯著影響癲癇的易感性。首先，腦組織興奮性與細胞外間質(ECS)的滲透壓和容積密切相關。ECS容積縮小可導致神經元過度興奮并促進癇性放電。相反，ECS容積增加可抑制癇性放電。另外，研究表明，海馬組織中ECS內微量的鉀離子濃度的增加即易導致癇性放電。難治性癲癇患者中高鉀極易導致癲癇發作。目前關于AQP4在癲癇致病中的作用機制探討絕大多數仍來自于對AQP4基因敲除小鼠的研究。AQP4基因切除小鼠是在1997年通過AQP4靶向基因切除建立的。起初，研究者最早發現AQP4基因切除小鼠的聽力輕度損害，即腦干聽覺誘發電位的閾值增高，并未發現明顯的神經功能異常。后來，更多關于AQP4基因切除小鼠腦組織生物學特性的研究顯示，AQP4基因敲除的小鼠星形膠質細胞內水分子滲透性較普通小鼠下降了7倍。表明了AQP4在星形膠質細胞水分子轉運過程中起著重要作用。無論是國內還是國外學者，均通過腹腔注射鋰-匹羅卡因的方法建立SD大鼠癲癇持續狀態(SE)模型，動態研究了AQP4在大鼠癲癇持續狀態后的表達，一致發現AQP4在SE后腦水腫形成過程中起關鍵作用，其機制可能與AQP4表達上調，通過水分子的轉運改變了細胞內外水分子的分布，從而細胞內氯化物、谷氨酸鹽等陰離子發生了繼發性轉運，導致細胞外谷氨酸鹽濃度增高，激活富含神經元區域神經細胞活動從而誘導癲癇發作有關。然而，一些研究者得出了相反結果，認為SE后腦水腫的主要原因是AQP4表達下降，Tang等人[7]對癲癇持續狀態的小鼠在發病3 h～3 d小腦AQP4表達進行了觀察，發現AQP4表達水平下降，直至第7天才恢復正常水平。猜想研究結果的不一致可能與動物選擇、觀察時期不同等有關，需要我們進一步實驗證實。

顳葉癲癇中約50%～70%的患者伴有海馬硬化，海馬硬化被認為是顳葉癲癇的重要病理改變。研究發現，海馬硬化患者的顳葉在頭部MRI上表現為T2加權序列及彌散像上高信號的特點，提示海馬硬化組織有水分子增加的跡象。他們對手術治療過程中海馬硬化的腦組織標本進行病理學研究發現，海馬硬化區整體AQP4含量增高，可能與星形膠質細胞活躍增生有關。另外，美國耶魯大學Tih等學者對伴海馬硬化的顳葉癲癇患者的手術切除致癇灶的研究也同樣發現：在硬化海馬組織中，星形膠質細胞增生顯著，AQP4在U133A基因芯片及QRT-PCR技術中的表達均上調，提示AQP4可能與海馬硬化及癲癇發作有關[8]。

Samira等人對AQP4基因敲除小鼠體外培養過程的研究發現，與野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在細胞學形態、增殖及粘附運動方面并無明顯差異，但Transwell遷移率及創面自愈能力明顯低于野生型小鼠；而對野生型小鼠的星形膠質細胞AQP4 RNA進行抑制后，它們的遷移率和自愈能力也表現出明顯下降，提示AQP4可能參與了星形膠質細胞的活化遷移和膠質瘢痕的形成過程[9]。而星形膠質細胞膠質瘢痕的形成則會造成異常的神經環路形成，從而導致神經網絡興奮性增高誘發癲癇發作，這種異常的神經環路對對抗癲癇藥物(AEDs)也具有阻擋作用，這可能是導致癲癇耐藥的原因之一。

目前市面上的抗癲癇藥物(AEDs)種類繁多，根據其不同的作用機制，分為：(1)增強GABA受體興奮性藥物：如丙戊酸鈉；(2)減少神經遞質釋放藥物，主要是拮抗興奮性氨基酸，降低興奮性遞質的活性，如托吡酯；(3)膜穩定劑，主要是作用于電壓門控的鈉通道，如卡馬西平。對臨床中常用的抗癲癇藥物作用機制進行研究發現，包括卡馬西平、托吡酯等多種抗癲癇藥物均具有部分AQP4阻斷的作用，提示AQP4的阻斷可能起到一定的抗癲癇作用，可能與阻斷AQP4的水分子轉運，從而抑制了細胞內外離子的繼發性轉運有關，但仍需進一步研究來證實癲癇發作中AQP4的深層作用機制。

2 KCNJ10基因與癲癇

內向整流鉀離子通道(Kir4.1)是一種整合膜蛋白，亦主要由4個亞基構成，每個亞基具有6個跨膜區段，共同構成了K+孔道，對鉀離子的內流具有高通透性。Kir4.1存在于中樞神經系統膠質細胞內，可由內源性ATP激活，主要功能是將膠質細胞外的鉀離子轉運至細胞內，對細胞外間質中過量的K+濃度進行調節，維持其內環境的穩定。Kir4.1編碼基因為位于1q22-q23上的KCNJ10基因，該基因存在于大多數哺乳動物的細胞內。

早期研究表明，癲癇發作時神經元異常放電與細胞內外鉀離子異常分布有關，胞外K+濃度升高導致細胞膜去極化，從而增高了神經元興奮性，誘發癲癇發作。當用毛果蕓香堿誘發癲癇模型發作時，觀察細胞內外鉀離子濃度變化，發現，細胞外鉀離子濃度的身高可促使神經元興奮性增高，增加癲癇活動的發生，此時膠質細胞中Kir4.1水平增高，導致鉀離子內流，緩沖細胞外過多的鉀負荷，抑制了癲癇的發作[10]。KCNJ10基因作為Kir4.1的編碼基因，是小鼠和人癲癇的易患基因，國外Biljana等人對Kir4.1基因敲除小鼠的研究發現，Kir4.1的缺失會引起星形膠質細胞細胞對興奮性遞質谷氨酸的攝入減少，神經網絡的興奮性增強，誘發癇性發作。此外，Kir4.1與膠質細胞的發育形成關系密切，敲除Kir4.1基因的小鼠可出現共濟失調、癲癇、甚至早期死亡等表現[8]。在伴有海馬硬化及先前有過高熱驚厥的顳葉癲癇患者的DNA中發現Kir4.1編碼基因單核苷酸突變，表明KCNJ10在癲癇易感性中發揮著重要作用。有趣的是，一些研究者發現癲癇與自閉癥譜系病(ASDs)有著強烈的關聯性。在52例KCNJ10發生突變的隱源性癲癇的患者中發現，2/3的患者伴有2個雜合突變(p.Arg18Gln 和 p.Val84Met)，且與家族癲癇無關。這就表明腦內異常的K+滲透壓可能會增加自閉癥-癲癇表型的易感性[11]。

中國一項對全面遺傳性癲癇(GGEs)患者KCNJ10基因突變與癲癇易感性和藥物抵抗關系的研究，分別對284例健康對照組及483例GGEs患者(包括279例抗癲癇藥物敏感，204例藥物抵抗的患者)KCNJ10基因的8個SNPs進行了分析發現，rs6690889 TC+TT在GGEs組中低表達[6.7% vs 9.5%，P=0.01，OR=0.50(0.29～0.86)]。rs1053074 G等位基因在兒童失神性發作(CAE)中表達頻率較健康對照組低[28.4% vs 36.2%，P=0.01，OR=0.70(0.53～0.93)]。rs12729701 G等位基因及AG+GG表型在CAE組中也較健康對照組表達頻率低[21.2% vs 28.4%，P=0.01，OR=0.74(0.59～0.94) and 36.3% vs 48.1%，P=0.01，OR=0.83(0.72～0.96)]。rs12402969 C等位基因和CC+CT表型在GGEs藥物敏感性患者中的表達頻率高于藥物抵抗組[9.3% vs 5.6%,OR=1.73(1.06～2.85)，P=0.026 and 36.3% vs 48.1%，P=0.01，OR=0.83(0.72～0.96)]。該研究表明KCNJ10基因SNPs與癲癇的易感性及抗癲癇藥物抵抗有關[12]。另外，Lenzen PK等人發現KCNJ10等位基因的突變也與全面遺傳性癲癇發作有關。然而，是否KCNJ10基因編碼的Kir.4異常是癲癇發作的根本病因或是主要原因仍須進一步研究。

目前大部分AEDs均作用于電壓門控鈉離子通道、鈣離子通道或參與GABA遞質調節，而作用于Kir4.1等鉀離子通道的AEDs少見。綜上所述，鉀離子通道(包括內向整流及電壓門控)對神經元動作電位、興奮性以及突觸可塑性均有一定影響，因此有學者提出：新型抗癲癇藥物的研究可以鉀離子通道作為藥物靶點，為癲癇治療提供新思路。

3 AQP4基因及KCNJ10基因的關聯性

近年來的研究已證實，AQP4與Kir4.1在Maller細胞和星形膠質細胞血管周圍終突上呈現極性分布，兩者不僅在空間上共表達，而且在功能上也相耦聯[13]。AQP4介導水分子跨膜轉運的同時，伴隨Kir4.1對細胞外鉀離子的緩沖作用，共同參與調節細胞外間質中水、K+重新分布，維持腦組織內環境的穩態以及對中樞神經元興奮性有重要的調節作用。對海馬CA1區AQP4基因敲除小鼠研究顯示，AQP4消失后，K+清除時間延長，導致了神經元興奮性增高，誘發癲癇發作。Binder等人[14]對AQP4基因敲除小鼠顳葉給予致癇刺激后，運用鉀敏感的微電極對K+變化進行了測量，結果顯示K+變化曲線的基線及峰值較野生型小鼠基本一致，但由基線上升至峰值及由峰值下降到基線的時間明顯延長，出現該現象的可能原因考慮為：AQP4的缺失導致細胞內外水分子分布發生了相應的改變，從而引起Kir4.1對鉀離子通透性的改變，使細胞膜電位發生相應變化，破壞了細胞外鉀離子平衡狀態。然而，一些學者對AQP4與Kir4.1功能耦連理論提出質疑， Ruiz-Ederra[15]及Zhang[16]等急性分離了AQP4基因敲除小鼠中的視網膜Maller細胞和星形膠質細胞，發現Kir4.1的分布和功能特征沒有明顯改變，因此他們認為神經膠質細胞中Kir4.1與AQP4之間無相關性，由此看來二者之間的關聯性仍需我們進一步研究證實。

4 癲癇與AQP4基因、CKNJ10基因的多態性

顳葉癲癇(temporal lobe-epilepsy，TLE)是一種常見的中樞神經系統疾病，占成人局灶性癲癇發作的1/3。Kjell Heuser等對218例挪威TLE患者進行了研究，其納入患者中，伴海馬硬化者56例，高熱驚厥者102例，結果表明，AQP4及KCNJ10/KCNJ9基因多態性可能與TLE，特別是伴海馬硬化者有關[17]國內徐仟等人[18]通過光鏡及透射電鏡觀察組織學及超微結構，免疫熒光組織化學法觀察星形膠質細胞AQP4和Kir4.1的分布特點發現，不伴有顳葉內側癲癇的海馬組織中，在星形膠質細胞血管周圍AQP4和Kir4.1呈現極性分布；而在顳葉內側癲癇的海馬組織中,AQP4和Kir4.1的極性分布特點發生改變，且其分布特點的改變可能與顳葉內側癲癇發生相關。另一些研究表明：中樞星形膠質細胞AQP4分布的改變，可以導致細胞水腫，存在于星形膠質細胞內的氯化物、谷氨酸鹽及其它陰離子物質代償性的通過容積敏感性陰離子通道釋放至細胞外，最終導致細胞外谷氨酸鹽濃度增高，激活神經元網絡從而激發顳葉癲癇。然而，牛鳳鶴等[19]學者對中國漢族人群顳葉癲癇患者的研究發現KCNJ10和AQP4基因多態性在顳葉癲癇的發生和發展過程無重要作用。這二者研究結果的差異可能與不同人群之間存在異常異質性，并且TLE受諸多易感基因和復雜環境影響有關。一方面，癲癇的類型眾多，很大一部分癲癇患者與上述兩種基因多態性的關系不明確;另一方面，研究納入人群的年齡無特殊限制，先天遺傳因素及后天環境因素與上述兩種基因多態性的相關性尚不明了，因此，KCNJ10及AQP4基因是否相互協同影響癲癇發生仍需要進一步研究證實。

5 展 望

癲癇的形成過程復雜，是多因素共同發展所致。雖然多組證據已表明神經元活動過程中，膠質細胞中表達的AQP4蛋白以及內向整流鉀離子通道對水和K+滲透壓的改變起重要的作用。K+濃度與癲癇易感性密切相關，但AQP4及KCNJ10基因多態性在癲癇發生和發展中的具體作用機制仍需進一步研究。此外，癲癇發作類型多，存在多種綜合征，個體間臨床差異大，不同年齡致病因素不同，因此，對于不同類型、不同年齡的癲癇患者AQP4及KCNJ10基因多態性的相關性仍亟待進一步研究。