帕金森病患者血清外泌體與腦白質結構改變和認知功能損害的關聯性研究

梁海云， 王 良， 杜秀蘭， 張 茂

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病，以震顫、僵硬和運動遲緩癥狀為特征性表現[1,2]，由于位于紋狀體的黑質和軸突投影中的多巴胺能神經元細胞體的減少所致。目前認為，精神障礙、認知障礙和睡眠障礙等非運動癥狀會導致患者生活質量下降或殘疾。既往研究證實，腦白質病變可導致與智能活動相關的神經環路阻斷，進而誘發阿爾茲海默病[3,4]，但腦白質病變與帕金森患者認知功能的關聯尚不明確。磁共振彌散張量成像(DTI)能定量測量腦白質微結構，在活體評估白質的完整性[5,6]，當腦白質損傷改變了軸突的方向同一性，腦白質的部分各向異性(FA)值將會降低。有研究指出，帕金森病癡呆患者腦白質結構變化比非癡呆患者更甚[7,8]，提示腦白質病變可能在帕金森病認知功能損害方面發揮了重要作用。外泌體(exosomes)是一種由細胞主動分泌到胞外的膜性囊泡小體，多項研究指出外泌體在神經系統神經元之間、神經元與神經膠質細胞間的通信作用，證實其在帕金森病等神經退行性疾病進展中起到重要作用。因此，本文探討不同認知功能損害帕金森病患者血清外泌體和腦白質結構改變與認知功能損害的關聯性，以期為臨床診治提供一定參考。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 帕金森病組 共納入2013年1月-2015年12月海口市第四人民醫院神經內科門診或住院的帕金森病患者60例，年齡(64.7±6.9)歲，男性32例，女性28例。A.入組標準：符合2013年歐洲神經病學聯盟帕金森病診斷指南的診斷標準。(1)運動遲緩；(2)至少具備下列癥狀中一項：靜止性震顫、肌強直、姿勢平衡障礙；(3)具備下列3項條件者：病情逐漸加重、左旋多巴治療有顯效、病程4 y或以上。B.排除標準：(1)帕金森綜合征(包括：腦血管病、神經系統炎癥、代謝性疾病、中毒、腦外傷、顱內腫瘤等原因所致)；(2)合并重要臟器疾病(心臟病、肝腎疾病等)；(3)既往曾接受過腦深部電極刺激、立體定向腦深部核團毀損等外科治療的原發性帕金森病患者；(4)合并嚴重精神疾病者；(5)無法進行核磁共振掃描者；(6)抑郁自評量表標準分≥50者。C.分組：依據帕金森患者的認知功能狀態分成3組。(1)帕金森病認知功能正常組(PD-N)；(2)帕金森病合并輕度認知功能障礙組(PD-M)；(3)帕金森病癡呆組(PDD)。

1.1.2 對照組 選擇同時期健康對照20例，性別、年齡及文化背景等資料與帕金森病組相匹配，按上述排除標準剔除不合標準對照組成員，對照組采用簡明精神狀態量表進行心理評估，評分不低于26分。

1.2 方法 本研究采用問卷調查與臨床檢查相結合的方式，全體患者及健康對照組人員均經知情同意告知，并簽字確認。

1.2.1 一般信息調查 主要包含受調查者的個人背景資料-即年齡、性別、民族、發病時間、治療經歷及效果等。

1.2.2 采用《統一帕金森病評分量表(UPDRS)》和《帕金森病Hoehn-Yahr(修正)分級量表》對全部帕金森患者病情進行評估。

1.2.3 采用中文版《簡易智力狀態檢查量表(MMSE)》評估帕金森病組和對照組的認知功能狀態[9,10]。該量表包括以下11項：時間定向力、注意力及計算力、語言理解力、即刻記憶、短程記憶、物體命名、言語復述、閱讀理解、語言表達及圖形描畫共11項，共30項題目，每項回答正確得1分，回答錯誤或答不知道評0分，量表總分范圍為0～30分。測驗成績與文化水平密切相關，正常界值劃分標準為：未受教育者<17分，受教育年限低于6 y者<20分，受教育年限6 y以上者<24分，提示受試者有認知功能受到損害。

1.2.4 采用《蒙特利爾認知評估量表(MoCA)》對患者認知功能損害進行評估[9,10]MoCA量表分別從交替連線測驗、視空間與執行功能(立方體、鐘表)、命名、記憶、注意、句子復述詞語流暢性、抽象、延遲回憶和定向這11項檢查內容對人的8個認知領域(包括注意與集中、執行功能、記憶、語言、視結構技能、抽象思維、計算和定向力)進行評估。如果受試者受教育年限不足12 y，則在測試結果上加1分用來校正受教育程度的偏倚，得分越高認知功能越好。評分低于26分時代表受試者已發生認知功能損害。全部測試由受試者自己獨立完成。

1.2.5 磁共振彌散張量成像(Diffusion tensor imaging,DTI) 采用GE 3.0 T核磁共振儀進行頭部檢查，對全部檢測對象進行頭部核磁共振常規序列和彌散張量成像序列掃描。DTI序列包含16個方向，共采集(44×16)層，軸位掃描層面平行于前、后聯合的連線(AC-PC線)。DTI數據在AW 4.4計算機工作站上運用Functool圖像分析軟件包進行數據處理，對不同感興趣腦區(region of interest,ROI)的腦白質神經纖維進行各向異性分數(fractional anisotropy,FA)值的測量，包括：額(頂、顳、枕)葉白質、胼胝體膝部、胼胝體壓部、前(后)扣帶束等腦區雙側對稱部位選取ROI。

1.2.6 60例帕金森病患者和20例健康對照組，于晨起后空腹狀態用EDTA及抗凝管經肘正中靜脈抽取外周靜脈血6毫升，血液標本采集30 min內經高速離心機1400轉/min，4 ℃離心15 min，取上清液存放于-80 ℃冰箱，以備酶聯免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測。應用ELISA測定血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量，檢測試劑盒由上海希美化學有限公司提供，所有操作均參照說明書。

2 結 果

2.1 不同認知功能狀態帕金森患者及對照組一般情況 PD-N組、PD-M組、PDD組及對照組在年齡和性別分布之間的差異無統計學意義(P>0.05)；PD-N組、PD-M組和PDD組帕金森患者在不同認知功能狀態分組間的病程年限的差異無統計學意義(P>0.05)；帕金森病組患者統一的帕金森病評定量表(UPDRS)評分分別為PD-N組(31.3±11.2)分、PD-M組(44.2±14.5)分、PDD 組(57.4±16.2)分，顯示患者UPDRS隨認知功能障礙加重病情呈逐漸加重趨勢(P<0.05)。Hoehn-Yahr分級分別為PD-N組(2.3±0.8)級、PD-M組(2.9±0.8)級、PDD 組(3.7±0.9)級，顯示患者Hoehn-Yahr分級隨認知功能障礙加重病情呈逐漸加重趨勢(P<0.05)(見表1)。

2.2 中晚期帕金森病與早期之間認知功能狀態分布情況 我們根據帕金森病患者Hoehn-Yahr分級，將60例帕金森患者分為兩組，即早期帕金森病組：Hoehn-Yahr分級1～2級，共30例(男性17例，女性13例)；中晚期帕金森組：Hoehn-Yahr分級3～5級，30例(男性15例，女性15例)。兩組性別比較差異有統計學意義(χ2=22.94，P<0.05)。對比兩組之間認知功能損害的差異，結果(見表2)。在早期帕金森病組中，50.0%患者認知功能正常，34.5%患者伴有輕度認知功能損害，11.3%患有帕金森癡呆；而中晚期帕金森病組中，16.7%患者認知功能正常，30.0%患者伴有輕度認知功能損害，51.3%患有帕金森癡呆。中晚期組帕金森癡呆者所占比例顯著高于早期組，兩組差異有統計學意義(P<0.05)；而中晚期組認知功能正常者所占比例顯著低于早期組，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 不同認知功能狀態帕金森患者和健康對照組MoCA總分和MMSE總分比較 帕金森病組《蒙特利爾認知評估量表(MoCA)》總分分別為：PD-N組(22.2±4.2)分、PD-M 組(19.2±5.1)分、PDD 組(15.9±5.2)分，顯示患者MoCA總分隨認知功能障礙加重病情呈逐漸下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。帕金森病組《簡易智力狀態檢查量表(MMSE)》總分分別為：PD-N組(25.3±2.8)分、PD-M 組(24.3±4.8)分、PDD 組(21.7±5.9)分，顯示患者MMSE總分隨認知功能障礙加重病情呈逐漸下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組MoCA和MMSE總分相比帕金森病組均呈顯著下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。以MMSE量表作為帕金森患者認知功能評估標準時，60例患者中24例異常，占帕金森患者總數的40.0%；以MoCA量表作為帕金森患者認知功能評估標準時，60例患者中45例異常，占帕金森患者總數的75.0%。在36例MMSE總分正常的帕金森患者中，有21例MoCA總分異常，占MMSE總分正常的帕金森患者58.3%。此結果提示在對帕金森患者認知功能損害進行評估時，MoCA量表篩查的敏感性要優于MMSE量表，而后者的特異性則可能更高(見表3)。

2.4 不同認知功能狀態帕金森患者和健康對照組腦白質FA值變化 與對照組比較，帕金森病癡呆組(PDD)和帕金森病合并輕度認知功能障礙組(PD-M)患者的左額葉白質、右顳葉白質及雙側前扣帶束白質的FA值下降；PD-M組的左顳葉白質和胼胝體膝部的FA值下降； PD-N組的左枕葉白質和左前扣帶束的FA值下降，差異有統計學意義(P<0.05)。 PDD組左扣帶前束和胼胝體壓部白質的FA值低于PD-M組、PD-N組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。通過比較發現PD-M組右顳葉、右后扣帶束及胼胝體膝部等腦區白質的FA值低于PD-N組相依區域的FA值，將這兩組有統計學差異的腦白質區域FA值、患者UPDRS評分和Hoehn-Yahr分級結果納入Logistic回歸方程，結果顯示胼胝體膝部腦白質FA值的下降仍然具有統計學意義(P<0.05)。通過比較發現PDD組左枕葉、左前扣帶束及胼胝體壓部等腦區白質的FA值低于PD-N組相依區域的FA值，將這兩組有統計學差異的腦白質區域FA值、患者UPDRS評分和Hoehn-Yahr分級結果納入Logistic回歸方程，結果顯示左側扣帶前束腦白質FA值的下降仍然具有統計學意義(P<0.05)。不同區域腦白質與帕金森認知功能狀態的Spearman相關性分析結果如下：左額葉(r=-0.343,P<0.05)、右顳葉(r=-0.393,P<0.05)、左枕葉(r=-0.231,P<0.05)、左扣帶前束(r=-0.396,P<0.05)、右扣帶前束(r=-0.241,P<0.05)、胼胝體壓部(r=-0.236,P<0.05)(見表4)。

2.5 不同認知功能狀態帕金森病患者和健康對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白對比 對60例帕金森病患者和20例正常對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量進行統計學比較。帕金森病各組(PD-N、PD-M、PDD)血清TNF-α及α-突觸核蛋白濃度水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)；PD-N、PD-M及PDD組組間兩兩比較均有統計學差異，隨患者認知功能損害逐漸加重呈遞增狀態。對60例帕金森病患者血清α-突觸核蛋白濃度與帕金森認知功能狀態分級進行Spearman等級相關分析，結果如下：帕金森認知功能正常(r=0.446,P<0.05)、帕金森病合并輕度認知功能障礙(r=0.492,P<0.05)、帕金森癡呆(r=0.432,P<0.05)。血清TNF-α濃度與帕金森認知功能狀態分級進行Spearman等級相關分析，結果如下：帕金森認知功能正常(r=0.382,P<0.05)、帕金森病合并輕度認知功能障礙(r=0.414,P<0.05)、帕金森癡呆(r=0.378,P<0.05)(見表5)。

表1 不同認知功能狀態帕金森患者及對照組一般資料對比

注：PD-N代表帕金森病認知功能正常組;PD-M代表帕金森病輕度認知功能障礙組;PDD代表帕金森癡呆組

表2 中晚期帕金森病與早期之間認知功能狀態分布情況的比較

注：PD-N代表帕金森病認知功能正常組;PD-M代表帕金森病輕度認知功能障礙組;PDD代表帕金森癡呆組。中晚期帕金森病與早期之間的差異有統計學意義*P<0.05

表3 不同認知功能狀態帕金森患者和健康對照組MoCA總分和MMSE總分對比

表4 不同認知功能狀態帕金森患者和健康對照組腦白質FA值對比

表5 不同認知功能狀態帕金森患者和健康對照組血清TNF-α及α-突觸核蛋白對比

3 討 論

帕金森病是臨床常見的中樞神經系統退行性疾病，多發生于中老年人，隨著老齡化社會的來臨，我國帕金森病的發病情況呈逐年遞增的趨勢。帕金森病多隨病程逐漸進展，不僅表現運動癥狀的進展，部分患者可伴發認知功能損害、睡眠障礙等非運動性癥狀的進展，造成家庭和社會負擔日益加深[11,12]。近年來關于帕金森病認知功能損害機制的研究日益深入，但仍未取得突破性進展，如何對帕金森病患者的認知功能狀態做出更為準確的評估，對容易發生認知功能損害的患者進行篩查和鑒別，早期進行干預治療，減少或推遲認知功能損害的發生成為研究的熱點和前沿。研究顯示富亮氨酸重復激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因突變能夠導致帕金森病的發生，越來越多的證據表明，LRRK2可參與核內體形成過程，包括與Ras癌基因家族的Rab5b結合后調控MVB與細胞質膜的融合及外泌體分泌，該基因相關位點突變可導致細胞內的多泡體的異常聚集，并能夠誘導生成大量包含有毒性α-突觸核蛋白的外泌體[13]。通過外泌體的轉運后毒性α-突觸核蛋白進入正常神經元細胞，導致神經元內毒性α-突觸核蛋白積聚以及小膠質細胞活化。活化的小膠質細胞又可產生富含腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的外泌體，加劇神經毒性，促進帕金森病進展[14,15]。神經影像學的發展同樣有了很大進展，通過磁共振彌散張量成像能夠較準確的對腦白質的神經纖維完整性作出判斷，為認知功能障礙的診斷提供了參考依據[16,17]。

本研究中利用磁共振彌散張量成像技術對腦白質結構改變同帕金森病認知功能的損害的關系進行了探討，結果顯示帕金森患者并發癡呆之后其左額葉、右顳葉及雙側前扣帶束白質的FA值下降，經Logistic回歸分析胼胝體膝部腦白質可能具有特異性；并發輕度認知損害時左顳葉和胼胝體膝部的FA值下降，經過Logistic回歸分析左側扣帶前束白質可能具有特異性；不同區域腦白質與帕金森認知功能狀態的Spearman相關性分析結果提示其間存在負相關，上述結果提示帕金森患者認知功能損害越嚴重，上述相應部位腦白質的FA值降低越明顯。

本研究還對不同認知功能狀態帕金森病患者血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量進行了比較，結果顯示帕金森病各組血清TNF-α及α-突觸核蛋白濃度水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)，并且隨患者認知功能障礙的加重程度呈遞增狀態。如表5所示。對帕金森病患者血清α-突觸核蛋白濃度與帕金森認知功能狀態分級進行Spearman等級相關分析結果顯示帕金森患者認知功能損害越嚴重，血清TNF-α及α-突觸核蛋白含量升高越顯著。兩者之間成正相關。此結果中α-突觸核蛋白在外周血內含量升高能夠反映出外泌體對帕金森病進展的影響。

綜上所述，通過本研究我們發現認知功能損害在帕金森患者中發生率較高，通過MoCA量表檢測能夠對認知功能損害的帕金森患者進行篩查，敏感度較高；磁共振彌散張量成像技術提示胼胝體膝部及左側扣帶前束白質損害在帕金森病認知功能障礙發生的診斷具有一定價值，血清外泌體內含有較高的α-突觸核蛋白，與帕金森病認知功能障礙發生具有一定關系。