雷洛昔芬通過抑制神經細胞凋亡保護腦缺血大鼠腦細胞的機制研究

管 萍， 劉文娟， 盧鵬超， 李志紅

腦血管病是一種常見的多發性疾病，死亡率和致殘率較高，近年來我國死亡原因中排名第二[1]。急性缺血性腦血管病占腦血管疾病的43%～65%，死亡率為15%～25%，嚴重危害人類健康[2]。雷洛昔芬是一種選擇性雌激素受體調節劑[3]。它是苯基唾液酚的合成非甾體衍生物，具有一定的組織特異性[4]。在生殖系統組織中，雷洛昔芬作為雌激素受體拮抗劑，可抑制乳腺和子宮腫瘤的生長，在生殖系統外的組織中起部分雌激素受體激動劑的作用，可以防止骨質鈣流失和降低血清膽固醇水平[5]。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取體重在(240±20)g的雄性Wistar大鼠為研究。分為空白對照組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組，每組10只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠大腦中動脈栓塞模型 腹腔注射3.5%水合氯醛(0.35 g/kg)，麻醉后分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈結扎。在頸總動脈近頸內外支切口處，通過切口將16 mm～17 mm長的尼龍繩插入頸總動脈內結扎。完全插入大腦中動脈。注射尼龍線后，動物的右眼瞼下垂。動物在醒來后向左移動了一個圈，說明模型是成功的。假手術組頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈分離結扎[6]。

1.2.2 分組及給藥 將手術組隨機分成3組即雷洛昔芬低劑量組(10 mg/kg bw)、雷洛昔芬中劑量組(50 mg/kg bw)、雷洛昔芬高劑量組(100 mg/kg bw)，每天灌胃不同劑量的雷洛昔芬溶液，正常對照組及假手術組每天灌胃等劑量的生理鹽水，自由進食，飼養30 d。

1.2.3 海馬組織分離及培養 處死大鼠前，用酒精棉球擦拭全身，初步消毒。再次浸泡在75%的酒精中，1 min后取出，打破頭部。將頭皮和頭骨切掉。打開大腦皮層，用眼鉗取雙側海馬，置于種植培養基培養皿中。顯微鏡下，用顯微眼科鉗切除腦膜，切除海馬以外的腦組織。用DISGH溶液沖洗3次，用微眼剪(約1 mm)切斷海馬，加入0.125%胰蛋白酶溶液，在37 ℃培養箱中消化約20 min，加入與組織懸液等量的20%小牛血清培養基10 min，終止胰蛋白酶作用，添加10%胎牛血清和10%小牛血清的培養基，形成細胞懸浮液，細胞計數后，用DMEM溶液調節細胞密度至5×106，將細胞接種到培養皿中，5% CO2,95%空氣，37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h后通過MTT實驗測定其生長情況。

1.2.4 神經元加鈣 取神經上皮組織，制成細胞懸液，用無鎂BSS漂洗3次，加入含3 μmol Fluo-3/AM的無鎂BSS 1 ml在CO2培養箱中培養20 min。然后用Fluo-3/AM游離無鎂BSS代替原液，在二氧化碳培養箱中培養20 min，確保AM組在Fluo-3/AM細胞質冷卻酶的作用下完全去除。

1.2.5 神經元內鈣含量測定 細胞內鈣濃度與Fluo-3熒光強度成正比，因此細胞內Fluo-3熒光強度代表細胞內鈣濃度。激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)可實時檢測細胞內Fluo-3熒光強度的變化。熒光-3熒光激發波長為488 nm，發射波長為530 nm，激光激發強度調節到最小。在此條件下，Fluo-3本身的熒光猝滅在檢測時間(900 s)內可以忽略不計。

1.2.6 神經元活性的測定 通過MTT實驗對神經元細胞的活性進行測定。取部分上述分離得到的細胞，利用RPMI-1640完全培養基調細胞濃度至1×107個/ml，加到96孔板中，每孔100 μl，以等體積的完全培養基為調零孔，每組設6個復孔，37 ℃，5% CO2培養箱中培養48 h，向各孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培養4 h，棄上清，向各孔中加入150 μl DMSO，水平振動儀中快速震蕩10 min，在酶標儀上測定570 nm處吸光度值。

1.2.7 神經元細胞凋亡測定 吸取5 μl Annexin V-FITC凋亡試劑于細胞中，混勻，室溫下避光孵育15 min，加入1×binding buffer，重懸細胞，1200 rpm，離心5 min，棄上清，加200 μl×binding buffer，重懸細胞，進行流式細胞儀檢測。流式軟件Flowjo 7.5 進行數據分析。

1.2.8 細胞中凋亡相關蛋白表達量的測定 采用Western blot 方法對細胞凋亡相關蛋白即caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白及Apaf-1蛋白的表達情況進行測定，通過Image J軟件對條帶的灰度值進行測定，利用灰度值分析各蛋白的表達量。

1.2.9 細胞凋亡RNA表達量的測定 取大鼠血清，利用RT-PCR方法檢測血液中miRNA-21、miRNA-29因子的表達水平。利用總miRNA快速提取試劑盒提取總RNA，并使用miRNA特有的逆轉錄引物，將其與Super M-MLV逆轉錄酶進行反向轉錄，反轉錄體系：(1)5×PrimeScript Buffer 4 μl；(2)1×PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl；(3)Oligo dT Primer (50 μmol)1 μl (25 pmol)；(4)Random 6 mers (100 μmol) 1 μl (50 pmol)；(5)Total RNA 1 μl；RNase Free dH2O 12 μl 。RT-PCR在實時定量系統中上進行，擴增條件：(1)預變性：95 ℃時10 min；(2)變性：94 ℃時30 s、退火/延伸：60 ℃時1 min，兩個步驟40個循環；(3)融解曲線分析：95 ℃時15 s、60 ℃時1 min、94 ℃時15 s和60 ℃時15 s。引物設計(見表1)；反應體系(見表2)。

2 結 果

2.1 神經元形態完整性分析 神經元形態完整，胞體和突起清晰，胞體呈椎體或多角形，突起明顯。用大鼠特異性烯醇化酶(NSE)抗體鑒定培養細胞，表明神經元(NSE陽性細胞)純度達95%(見圖1)。

2.2 神經元鈣含量的測定 以3×104mol/L谷氨酸培養海馬神經元細胞1 min后，細胞內鈣濃度迅速升高。大約95%的細胞有反應。用無鎂BSS洗滌2.5 min后，雷洛昔芬組，再次給予谷氨酸，治療前后谷氨酸誘導細胞內鈣濃度升高。結果表明，不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導的細胞內鈣的增加。空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的熒光強度分別為(230.2±10.3)、(233.5±11.3)、(342.3±12.4)、(302.5±14.5)、(312.3±13.5)，5組比較差異有統計學意義(F=160.033，P<0.001)。與空白對照組的熒光強度相比，假手術組無顯著變化(P>0.05)，雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著增加(P<0.001)，但與雷洛昔芬低劑量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著降低(P<0.001)。

2.3 神經元細胞活性及凋亡率測定 通過MTT實驗對神經元細胞增殖能力進行測定，利用流式細胞儀對其凋亡率進行測定，實驗結果表明，空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的增殖率分別為(0.68±0.02)、(0.66±0.02)、(0.21±0.01)、(0.59±0.03)、(0.54±0.04)，5組比較差異有統計學意義(F=534.265，P<0.001)。假手術組細胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞增殖率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。細胞凋亡率結果表明，空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的凋亡率分別為(1.1±0.03)、(1.2±0.02)、(10.38±0.23)、(8.92±0.12)、(9.01±0.21)，5組比較差異有統計學意義(F=9288.651，P<0.001)。假手術組細胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞增殖率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 細胞凋亡相關蛋白分析 用2-△△Ct法計算細胞中凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1的相對表達量，5組比較差異有統計學意義(F1=38.328，F2=1151.204，P<0.001)，結果(見圖2、表3)。 細胞凋亡率凋亡相關蛋白表明，假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量有顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)(見圖2)。

2.5 miRNA表達量的測定 通過RT-PCR實驗對神經元細胞凋亡相關miRNA表達量進行測定，實驗結果表明，空白組、假手術組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細胞的miRNA-21表達量分別為(0.14±0.01)、(0.16±0.01)、(0.32±0.02)、(0.21±0.01)、(0.22±0.01)，5組比較差異有統計學意義(F=306.250，P<0.001)。假手術組細胞miRNA-21表達量與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞miRNA-21顯著高于空白組與假手術組(P<0.05)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21表達量無顯著性差異(P>0.05)。各組miRNA-29表達量分別為(0.17±0.02)、(0.19±0.01)、(0.43±0.03)、(0.31±0.02)、(0.32±0.02)，5組比較差異有統計學意義(F=256.364，P<0.001)。假手術組細胞miRNA-29表達量與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞miRNA-29顯著高于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-29表達量均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-29表達量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 引物設計

表2 反應體系

表3 神經元細胞增殖能力、凋亡蛋白及相關miRNA表達量測定

A：空白組;B：假手術組;C:雷洛昔芬低劑量組;D:雷洛昔芬中劑量組;E:雷洛昔芬高劑量組,雷洛昔芬中、高劑量組熒光強度降低(P>0.05)

圖1 神經元形態和神經元鈣含量的測定

假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量無統計學差異(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白低于空白組與假手術組(P<0.001)，與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中、高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白增加(P<0.001)

圖2 細胞凋亡蛋白表達量的Western blot測定結果

3 討 論

雷洛昔芬在神經系統中的作用也引起了越來越多的關注[5]。現有的一些體內實驗結果表明，雷洛昔芬對氧化應激和β-淀粉樣蛋白所致的神經損傷具有保護作用[7]。也有證據表明雷洛昔芬對中樞神經系統多巴胺受體具有雌激素激動劑活性，提示雷洛昔芬可能作為雌激素激動劑在中樞神經系統發揮神經保護作用[8]。此外，雷洛昔芬神經保護作用的細胞和分子機制尚不清楚。

有研究表明[9]，雷洛昔芬能抑制過氧化應激所致的神經元死亡，這種作用不是由經典雌激素受體介導的。報道指出[10]，雷洛昔芬對雌激素受體α誘導的神經元凋亡有抑制作用，再生的作用還取決于經典雌激素受體介導的。有報道指出[11]，谷氨酸可直接激活細胞膜上配體激活的鈣通道，引起細胞膜膨脹Ca2+內流，同時引起細胞膜去極化，激活電壓依賴性鈣通道，進一步引起鈣內流和鈣超載[12]。本研究以3×104mol/L谷氨酸培養海馬神經元細胞，結果表明，不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導的細胞內鈣的增加。與空白對照組的熒光強度相比，假手術組無顯著變化(P>0.05),雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著增加(P<0.001)，但與雷洛昔芬低劑量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強度均顯著降低(P<0.001)。

在體內動物實驗的結果表明[13]，雷洛昔芬在腦缺氧缺血損傷的實驗模型中對神經元具有明顯的保護作用，同時體外細胞研究也證實[14,15]，雷洛昔芬在氧化應激、興奮毒性及β-淀粉樣蛋白引起的神經元損傷中增加了神經元的存活且對其具有保護作用。本研究表明，通過MTT實驗對神經元細胞增殖能力進行測定，利用流式細胞儀對其凋亡率進行測定，實驗結果表明，雷洛昔芬組細胞增殖率與凋亡率均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。

細胞中凋亡相關蛋白即caspase-3、Apaf-1的表達結果表明，假手術組細胞凋亡相關蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達量無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05)。與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21、miRNA-29表達量均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細胞miRNA-21、miRNA-29表達量無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述：雷洛昔芬通過抑制神經細胞凋亡蛋白caspase-3、Apaf-1及miRNA-21、miRNA-29的表達保護腦缺血大鼠腦細胞。