HIV-1 Rev蛋白在病毒復制中的功能

王宇佳，米澤云，丁寄葳，岑山

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HIV-1 Rev蛋白在病毒復制中的功能

王宇佳，米澤云，丁寄葳，岑山

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所免疫生物學室

人獲得性免疫缺陷病毒 HIV-1 編碼的 Rev 蛋白由 116 個氨基酸組成，分子量為 19 kD，主要定位在細胞核中。Rev 具有三個不同的功能區：N 端的第 35 ~ 50 個氨基酸之間編碼了一個精氨酸富集區域（arginine-rich-motif，ARM）作為 Rev 的核定位信號（nuclear localization signal，NLS）。Rev 的 NLS 區域主要負責蛋白的核定位功能以及與 Rev 反應元件（Rev response element，RRE）的莖環 RNA 序列特異性相互作用，介導 Rev 單體間聚合[1]。Rev 的第 10 ~ 24 個氨基酸是核擴散抑制信號（nuclear diffusion inhibitory signal，NIS），主要維持 Rev 的功能以及 Rev 在細胞核的亞細胞定位。第三個活性區域位于第 73 ~ 84 個氨基酸之間，是異亮氨酸富集的區域，包含一個核輸出信號（nuclear export signal，NES）。該區域直接與細胞染色體維持蛋白 1（chromosomal region maintenance 1，CRM1）相互作用。研究表明在 HIV-1 的復制過程中，Rev 執行了多種生物學功能，其中包括病毒 RNA（vRNA）的核輸出、增強病毒蛋白的表達水平，促進 vRNA 基因組的核體化[2]，以及負調控 HIV-1 整合[3]。本文主要圍繞 Rev 在病毒復制早期和晚期的功能展開論述。

1 輔助 vRNA 從細胞核輸出到細胞質

在 HIV-1 復制過程中，早期的病毒 mRNA 轉錄本經完全剪接，形成各種編碼早期蛋白質（Tat、Rev 和 Nef）的 mRNA；然而晚期的轉錄本剪接不完全或者未剪接，直接被轉運到細胞漿中作為表達 Gag 等病毒蛋白的模板或作為基因組包裝入病毒顆粒。由于病毒不完全剪接或未剪接的轉錄本中含有內含子，其核輸出需要 HIV-1 Rev 蛋白和 RRE。RRE 為 HIV-1 基因組里的一段 250 bp 的序列，位于結構基因 Env 中。Rev 可以特異性地識別和結合 RRE。RRE 通過鏈內氫鍵折疊，可以形成由 5 個莖環組成的穩定 RNA 二級結構。其中莖環結構域 I 是一個構成不完美的雙螺旋，其主要功能是維持 RRE 功能結構，同時具有較低親和力的 Rev 結合位點[4]；結構域 IIB 中具有一個富含嘌呤核苷酸的不對稱凸起，它是 Rev 初始結合的強親和位點[5-6]；結構域 III ~ V 也可能有助于結構的穩定，但對 RRE 的活性影響較小。然而，關于 RRE 的精確二級結構一直存在爭議。研究表明，RRE 包含 4 個或 5 個莖環的替代結構，這兩種已發布的結構在 Rev 結合位點之外的區域中有所差異[7]。

Rev 蛋白利用其 NLS 和 NES 信號在細胞質和細胞核之間穿梭，通過結合不完全剪接或未剪接的轉錄本中的 RRE，可將 mRNA 轉運到細胞質中并進行翻譯。在這個過程中一些宿主蛋白起到了輔助性的作用，其中比較重要的兩個宿主因子是 CRM1 和輸入蛋白 β（importin-β，IMPβ）。另外，染色質鏈接鳥苷酸交換因子（regulator of chromosome condensation，RCC1），能夠水解 Ran-GTP，為 Rev 核質穿梭提供能量[8]。在細胞核中，單個 Rev 單體與 RRE 結構莖 IIB 中的高親和力位點結合并開始裝配，并將額外的 Rev單體通過蛋白質-RNA 和蛋白質-蛋白質相互作用招募 Rev 單體，共聚化形成四聚體（Rev/RRE/CRM1/Ran-GTP）[9]，隨后四聚體復合物和核孔相互作用，穿過核孔輸出到細胞質中。在四聚體復合物通過核孔的過程中需要招募一種細胞—— GTPase 激活蛋白（RanGAP），促進 Ran-GTP 釋放能量變成 Ran-GDP，從四聚體中釋放出來[10-11]，四聚體穿越核孔，隨后 RanBP1 的參與導致 CRM1 從四聚體中釋放，CRM1 通過核孔輸入到細胞核中發揮作用。此時 Ran-GDP 和細胞質中的 Rev 結合，防止 Rev 重新和 CRM1 結合。隨后 Rev 的 NLS 區域和細胞質中的 IMPβ 結合促進含有 RRE 的 mRNA 釋放到細胞質中進行翻譯。隨后三者復合物穿過核孔將 Rev 運輸到細胞核中發揮作用。在細胞核中，Ran-GTP 的鏈接導致 Ran 和 importin 復合物的解離，游離出單體 Rev，繼續在細胞核中結合含有 RRE 的 mRNA 發揮其功能[11-12]。

2 增強 HIV vRNA 的翻譯

Rev 不僅在含有 RRE 的 RNA 的細胞核輸出中起到了重要的作用，同時還能增強 mRNA 的翻譯水平[13]。早期的研究發現，某些突變的 Rev 并不改變 vRNA 在細胞核和細胞質中的比例，但是嚴重影響蛋白表達[14]。過表達 Rev 可以提高 Env-RRE mRNA 在細胞質中的水平約兩倍，但 Env-RRE 蛋白表達水平可提高 50 倍之多[15]。與之類似，在 HeLa 細胞中，Rev 分別增強 Gag 的 RNA 和蛋白水平 4.4 和 845 倍。這些研究結果提示，Rev 除了可以輔助病毒未剪切的 RNA 輸出到細胞質中，還可以增強 vRNA 的表達[16]。

mRNA 的有效翻譯需要結合多聚核糖體。研究發現表達野生型或者功能缺陷的Rev 對于多聚核糖體中的完全剪接的病毒 RNA 水平沒有影響，但非剪接形式的病毒RNA 在突變型 Rev 存在的情況下明顯減少。這些結果提示 Rev 可能在 RNA 核輸出完成后與含有 RRE 的 RNA 在細胞質中繼續結合，并進而促進其進入多聚核糖體。Rev-RNA 結合實驗發現在細胞質中不完全剪接或未剪接的 Gag/pol、Vif 和 Vpr mRNA 都和 Rev 具有很強的結合，但是完全剪接的 Tat 和Rev RNA 并沒有類似的情況；當 RRE 缺失時，Rev 和 RNA 的結合基本上消失[2]，這進一步驗證了 Rev 通過 RRE 介導結合 RNA 的設想。同樣的，只有當 Rev 存在的情況下，才能在多聚核糖體組分中檢測到 Gag mRNA。盡管不同檢測系統和細胞類型可能會對結果產生不同的影響，但多數證據都表明 Rev 對于不完全剪接的 HIV-1 RNA 的翻譯有促進作用[2]。

之前已經發現有很多宿主因子參與到 Rev 介導的 vRNA 的核輸出過程中，同樣，對于 Rev 的翻譯調控，現在也確定一些候選宿主因子在此過程中起到了一定的促進作用。真核細胞翻譯起始因子 5A（eukaryotic initiation factor，eIF5A）是一個可以和 Rev 具有相互作用的細胞蛋白，可以引發病毒 mRNA 的翻譯[17-18]。多聚腺嘌呤結合蛋白 1（poly(A)-binding protein1，PABP1）可能與 Rev 協同增強 vRNA 的穩定性[19]，參與 polyA 尾招募核糖體，進而增強依賴于 Rev 的 HIV-1 RNA 翻譯。除此之外，在 Rev 存在的情況下，RNA 解旋酶（RNA helicase A，RHA）可以和 RRE 結合，促進含有 RRE 的 mRNA 的翻譯。Pura 蛋白可以在細胞質中和 Rev、RRE 共定位，促進含有 RRE 的基因表達[20]。

3 增強 HIV 病毒基因組 vRNA 的核體化

除了上述 Rev 的功能之外，Rev 還可以促進 HIV-1 基因組的包裝。在病毒的組裝過程中，病毒的 vRNA 通過位于 5'UTR 的包裝信號和前體蛋白 Gag 中的核衣殼（NC）區域相互作用，將病毒基因組帶入至病毒顆粒中。最初確定的 HIV-1 包裝信號位點是 5'UTR 中的 stem-loop 3，其缺失導致包裝效率降低約 20 倍[21]。然而，僅僅依靠這個區域的存在并不能引發基因組的包裝，這就提示還有其他的序列或者結構參與該過程[2]。研究發現在 Rev 缺失的時候，HIV-1 病毒載體的包裝效率和滴度下降到 3%，然而細胞質 RNA 水平僅僅降低到 44%。相反，當使用缺乏 5'UTR 和 RRE 的密碼子優化 HIV-1 表達系統時，Rev 存在與否并不影響包裝效率和滴度[22]。此外，過表達 Rev 蛋白可以提高 Rev 缺失 HIV-1 未剪接 RNA 的細胞質水平 5 倍左右，然而包裝的 HIV-1 RNA 拷貝數提高 4500 倍。上述研究結果表明，Rev 對于 vRNA 的包裝具有促進作用。目前關于 Rev 促進 HIV-1 基因組包裝的機制還未完全闡明，推測 Rev 可能通過 loopA 將 RNA 轉運到特殊的位點，在該位點可以使病毒基因組 RNA 有效地包裝到子代病毒顆粒中[2]。

Blissenbach 等[23]為了確定 Rev 對原病毒 RNA 包裝效率的影響，進行了定量 RT-PCR 分析。在存在或不存在Rev 質粒表達的情況下，用 HIVRev-/4xMS2、Tat 表達質粒和 Hgpsyn 共轉染 293T 細胞，用靶向 gag 的引物進行定量 RT-PCR 測量細胞質和病毒顆粒中全長 HIV-1 RNA 的量。轉染后，Rev 增加了 HIV-1 未剪接 RNA 的細胞質水平，提取的 RNA 從 8.9 × 107增加到 4.9 × 108拷貝/μg。與此相比，Rev 增強 HIV-1 RNA 包裝的拷貝數約為4500 倍。因此推斷 Rev 可以一定程度增強基因組 HIV-1 RNA 的包裝。

4 干擾 HIV cDNA 整合到宿主細胞

早期的工作發現，以較高的 MOI 的 HIV-1 感染易感細胞時，雖然可以產生大量的病毒 cDNA，但是只有一個或者幾個能夠整合到宿主細胞的基因組里，提示病毒的整合過程有負調控機制[3]。Levin 等[3]發現在靶細胞中病毒 cDNA 的整合頻率是受 Rev 調控的。在這個實驗中，靶細胞感染野生型的 HIV 和 Rev 缺陷的 HIV 顆粒，盡管產生拷貝數相同的病毒 cDNA，但是感染缺失 Rev 的 HIV 病毒顆粒發生整合的頻率比感染野生型效率高 5 倍。同時，當在細胞穩定表達 Rev 的時候，這兩種病毒的整合效率都明顯下降，初步證明病毒 cDNA 的整合頻率是受 Rev 調控的。目前通過體外鏈接實驗，雙分子熒光互補實驗以及免疫共沉淀實驗均已證明 Rev 和整合酶（IN）具有相互作用。Rosenbluh 等[24]研究發現，IN 和 Rev 在酵母細胞中可以相互作用并形成穩定的 Rev-IN 復合物，其相互作用可抑制 IN 酶活性從而限制了整合作用[25]，這項工作描述了一種限制 HIV-1 整合的新穎的調節機制。隨后實驗發現，除了 IN 之外，Rev 也可以和參與病毒整合的宿主蛋白 p75 相互作用，進而抑制其輔助整合的功能[26]。原則上講，HIV-1 的輔助蛋白往往對 HIV-1 的復制起到促進作用，然而 Rev 抑制病毒整合對于 HIV-1 感染是否有利呢？目前已證實 HIV-1 的 Env、Nef 和 Vpu 蛋白能夠下調細胞中 CD4 受體，從而阻止超級感染的發生。因此，HIV-1 可能利用 Rev 抑制病毒 cDNA 整合，阻止基因毒性和超級感染的發生，進而促進病毒的復制[18]。

5 展望

目前臨床使用的抗 HIV 藥物多為蛋白酶抑制劑、逆轉錄酶抑制劑和整合酶抑制劑，這些靶向病毒的藥物容易產生耐藥性，因此尋找抑制 HIV 的新方法是一項持續而重要的工作。綜上所述，Rev 在 HIV-1 的生活周期中執行著十分重要的作用，通過對 Rev 生物學功能及作用機制的不斷深入研究，Rev 有可能成為新的抗 HIV 藥物治療的靶點。

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岑山，Email：shancen@hotmail.com

2018-12-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.013