miRNA在腎臟缺血再灌注損傷中的作用研究進展

潘旭鳴 陳丹壘 馬紅珍

缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是指組織或器官在缺血的基礎上恢復血流后損傷反而加重，甚至出現損傷不可逆的現象。組織或器官缺血后缺氧，從而產生損害，但再灌注后卻可能因為活性氧在組織或器官中的再度富集而造成二次損傷。研究發現，腎臟IRI是導致急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的主要原因之一[1]。缺血所致的低氧過程，與再灌注誘導的免疫應答反應激活共同成為腎組織損傷的原因，而IRI不可避免的存在于腎臟移植、心臟外科手術等過程中。盡管臨床對腎臟IRI的研究頗多，但其確切機制尚未闡明，亦未發現良好的防治方法。

miRNA最早于1993年由Ambros研究小組在秀麗線蟲的研究中發現[2]，其后miRNA被證實在各類物種中均具有高度的保守性。miRNA在基因轉錄后調控中起關鍵作用，并且參與了幾乎所有細胞的生物學功能，包括細胞增殖、分化、代謝、凋亡等[3]，可與靶基因mRNA 3'端非編碼區完全或不完全結合，在轉錄后水平調控蛋白質合成[4]。迄今為止，人類基因組已發現超2 000個miRNA。在生物體內，miRNA的特異性不強，一個miRNA可以作用于多個靶基因，包括轉錄因子、細胞因子、受體等，占人類基因1%的miRNA可能調控30%以上其他基因的表達，多個miRNA也可以共同調控一個靶基因的表達，因此，miRNA與靶基因之間組成了一個復雜的調控網絡[4]。近年來，miRNA也被發現在疾病的診斷與治療中扮演關鍵的角色。本文就miRNA在腎臟IRI中的作用研究進展綜述如下。

1 腎臟IRI發生機制

腎臟IRI是造成患者發生AKI的主要原因，膿毒血癥、休克、腎動脈狹窄、冠狀動脈搭橋術或腎移植術等都可以通過腎臟IRI誘發AKI，其致死率與致殘率較高。從病理上看，腎臟IRI以腎小管間質病變為主要表現，尤其以近曲小管損傷多見，并伴有小管上皮細胞的凋亡壞死與修復過程[5]。腎臟IRI可導致腎小管間質炎癥、細胞凋亡與壞死、細胞修復能力減弱等，也可以通過激活免疫應答反應導致組織損傷[6-7]，其中炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡與細胞自噬在損傷發生過程中有著不可替代的作用。

1.1 炎癥反應介導腎臟IRI 炎癥反應在腎臟IRI過程中與各種類型細胞均有關，并且在病理生理機制中發揮關鍵作用。腎臟IRI會啟動腎臟組織及細胞內的炎癥級聯反應，并導致損傷，因此抑制炎癥反應是保護腎臟組織免受IRI的重要思路之一[8]。趨化因子是炎癥反應中重要的中介分子之一，在炎癥反應中起到調節并活化促炎因子，增強黏附分子表達的作用[9]。促炎因子如IL-6、TNF-α等在腎臟IRI致腎功能障礙過程中起到關鍵作用。研究顯示，抑制IL-6及TNF-α表達后，可以在細胞水平減輕IRI導致的腎臟損傷[10-11]。同時，炎癥介質、活性氧簇以及細胞黏附分子如細胞內黏附分子-1（ICM-1）、P-選擇素等，可以通過募集白細胞與中性粒細胞至發生缺血的組織處，增強白細胞與內皮細胞之間的相互作用，促進內皮細胞腫脹并進一步阻礙血液的運行[12-13]，加重腎臟損傷。

1.2 氧化應激反應介導腎臟IRI 在腎臟IRI過程中，損傷的組織可以產生大量的活性氧簇，導致氧化應激反應發生，線粒體發生氧化磷酸化障礙，ATP生成減少，激活磷脂酶，造成生物膜損傷，細胞內鈣內流而導致鈣超載[14]。當血液再灌注后，產生大量的氧自由基，導致膜脂質過氧化反應，進而產生自由基介導的組織損傷[15]。自由基形成所導致的組織損傷借助膜脂質過氧化反應與蛋白質、DNA的氧化損傷可以促進細胞凋亡的過程[16]。因此，抑制自由基及其相關產物可以有效保護IRI的腎組織，減少損傷。

1.3 細胞凋亡與細胞自噬介導腎臟IRI 腎小管上皮細胞因急性缺血而出現細胞凋亡與細胞自噬反應是低血容量、低血壓、心力衰竭等的共同病理環節[17]。腎小管上皮細胞壞死會引起水、電解質、大分子物質在細胞間擴散失控，造成腎小管濾過時產生回漏，使腎小球濾過率降低。研究發現，眾多分子信號轉導通路與腎小管上皮細胞壞死、凋亡及自噬相關。如p53-sestrin2信號通路及HIF-1α-BCL2信號通路等，均可在缺血的刺激下啟動并激活，進一步改變腎小管上皮細胞的自噬及凋亡水平，具有潛在的保護作用[18]。低氧可以誘導mTOR及unc-51樣自噬激活激酶1（ULK1）解離，誘導自噬產生[19-20]。細胞研究發現，ULK1與AMPK、c-jun、beclin-1等信號分子存在交互作用，從而介導細胞凋亡與自噬過程[19-22]。

2 miRNA在腎臟IRI診斷中的應用

近年來，尋找新型的生物標志物成為腎臟IRI研究的主要熱點之一。miRNA的表達不僅可以逆轉腎臟IRI，保護腎臟功能，更可以作為腎臟IRI診斷與鑒別診斷的生物標志物。腎臟IRI過程中miRNA的動態變化、其組織特異性表達模式與分析方法，甚至其在尿液和血液中的不同分布，均使得miRNA成為腎臟疾病生物標志物的理想候選者[23-24]。有學者對大鼠發生腎臟IRI后不同時間點的血清及腎組織miR-192進行檢測，發現血清miR-192水平提高4倍但腎組織miR-192水平下降40%；該研究團隊又選取93例心臟手術后患者血清進行驗證后發現，心臟手術術后發生AKI的患者血清miR-192水平在進入ICU的同時開始升高，并在2h內維持穩定，24h后開始下降[25]，提示血清miR-192可以成為預測心臟手術后發生腎臟IRI的生物標志物之一。亦有研究指出，在小鼠IRI中，尿液miR-10a、miR-30d濃度與發生IRI后小鼠尿液中KIM-1及NGAL濃度呈正相關，反映了尿miR-10a與miR-30d濃度與小鼠IRI嚴重程度呈正相關[26]。在一項22例腎臟IRI患者的研究中發現，腎臟IRI患者尿miR-21水平是正常對照組的1.5倍，而尿miR-155水平則相較正常對照組顯著降低，提示尿miR-21與miR-155均可以有效鑒別患者是否發生腎臟IRI，并具有一定的診斷效能[27]。

3 miRNA在腎臟IRI發生機制中的作用

部分miRNA被臨床驗證可作為腎臟IRI所致AKI的診斷生物標志物外，亦有大量研究發現miRNA可以作為信號分子參與腎臟IRI發生機制與病理生理過程，反映了其作為潛在的治療靶點的生物學功能。

3.1 調節氧化應激反應 腎臟IRI過程中，由于細胞、組織缺血缺氧導致自由基、活性氧簇等大量激活，發生氧化應激反應，體內、外研究發現，部分miRNA可以阻斷這一過程，減輕缺血及再灌注階段對腎臟的損傷，降低腎功能受損程度。Muratsu-Ikeda等[28]采用低氧誘導HK-2細胞模型，模擬腎臟缺血缺氧環境后發現，低氧誘導后，細胞內miR-205水平明顯下調，敲除細胞內miR-205基因后，HK-2細胞表現出對低氧環境更高的敏感性，對氧化應激的敏感性也相對升高，相對未敲除組細胞損傷程度更嚴重，細胞活力更差，補充miR-205后細胞活力有所恢復。進一步研究后發現，miR-205可以與細胞內脯氨酸羥化酶1（PHD1）結合，從而降低HK-2細胞對低氧環境及氧化應激反應的敏感性，最終提高細胞對低氧環境的耐受性。另有動物實驗證實，在大鼠腎臟 IRI 后，miR-29a[29]、miR-34a[29]、miR-423-5p[30]、miR-320[31]在腎臟組織內的表達水平與腎臟組織氧化應激水平同步上調，在使用間充質干細胞治療后腎臟組織內氧化應激水平及miR-29a、miR-34a均有所下降[29]；抑制大鼠腎臟組織miR-423-5p表達后，大鼠腎組織氧化應激反應減輕，腎臟損傷較未抑制的大鼠明顯減小，miR-423-5p可能通過抑制谷胱甘肽轉移酶M1（GSTM1）誘導氧化應激反應，減弱組織細胞損傷修復，從而造成組織損傷[30]；而miR-320水平上調所致的腎臟組織氧化應激反應與腎臟損傷表現均可以被卡托普利逆轉[31]。

3.2 參與炎癥反應 腎臟IRI過程中，在缺血缺氧階段，炎癥反應開始迅速啟動，并產生級聯放大效應而造成腎臟損傷。動物實驗與細胞實驗證實，腎臟IRI后，miR-21水平顯著升高，通過抑制PTEN蛋白水平[32]，激活PI3K/AKT通路，從而抑制腎臟IRI過程中炎癥因子的產生，減輕腎臟損傷[33]。同時，miR-21可以抑制絲裂原活化蛋白激酶3（MKK3）從而降低腎組織IL-6、TNF-α水平，減輕炎癥反應，保護腎臟，減輕IRI[34]。Lan等[35]在小鼠腎臟IRI過程中發現，小鼠腎臟組織miR-494水平在IRI后1h開始升高，進一步研究證實，miR-494可以直接抑制轉錄因子ATF3，誘導炎癥因子及黏附分子如 IL-6、P-選擇素、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）大量表達，加劇IRI后腎臟損傷。在利用脂肪間充質干細胞治療腎臟血管性疾病的研究中發現，miR-26a可以抑制腎血管內TNF-α表達，升高IL-10水平，產生一定的抗炎作用[36]。而慢病毒轉染miR-26a基因的小鼠在腎臟IRI后可以抑制IL-6表達并刺激調節性T細胞的生成，減輕腎臟炎癥反應，促進腎臟IRI后功能的恢復[37]。對miR-146a敲除小鼠進行腎臟IRI過程模擬后發現，miR-146a可以通過調節IL-1受體相關酶1，從而影響CXCL8/CXCL1信號通路，相較于野生型小鼠，miR-146a基因敲除小鼠在腎臟IRI后，表現出更輕的腎小管損傷，更低的NF-κB等炎癥因子水平[38]。

3.3 調節細胞凋亡與細胞自噬水平 在腎臟IRI過程中，缺血缺氧及再灌注后導致的自由基損傷、炎癥反應、氧化應激反應最終均可導致腎小管上皮細胞自噬及凋亡反應產生，產生腎臟損傷。在低氧誘導NRK-52E細胞模型中發現，miR-21可以抑制細胞自噬。小鼠腎臟IRI模型中發現，miR-21基因敲除后，小鼠腎臟程序性細胞凋亡蛋白4（PCDP4）明顯上調，加速細胞凋亡，加重腎臟IRI[39]。Cui等[40]對IRI小鼠腎臟組織進行miRNA芯片分析后發現，小鼠腎臟在IRI后miR-18a、miR-210表達明顯異常，PTEN基因是miR-18a的目標基因，與p53凋亡信號通路有關，miR-210的靶基因為bcl2，同樣可以調控細胞凋亡程度，影響腎臟IRI發生、發展。在腎臟IRI過程中，miR-687可以抑制PTEN蛋白，促進細胞周期與細胞凋亡[41]。Hao等[42]發現小鼠腎臟IRI后體內miR-17-5p水平明顯升高。進行低氧誘導的腎小管上皮細胞實驗發現，缺氧后細胞內miR-17-5p水平升高，依賴p53蛋白作用，直接抑制死亡受體6（DR6），減輕低氧導致的細胞凋亡，提示p53/miR-17-5p/DR6通路可能是小鼠IRI的重要發生機制之一。另有小鼠腎臟IRI實驗證實，miR-34a在小鼠IRI后表達上調，可以通過結合Atg4B基因的3′非編碼區，直接抑制腎小管上皮細胞的自噬活性，從而加重腎臟IRI[43]。Lorenzen等[44]發現，腎移植后發生急性排異反應的患者血miR-24水平明顯上調，后在離體細胞模型中證實，低氧誘導腎小管上皮細胞后可以觀察到miR-24在腎小管上皮細胞內特異性富集，并直接參與細胞凋亡過程，故推測抑制miR-24可能成為治療腎臟IR的靶點之一。

4 miRNA介導腎臟IRI恢復

在腎臟IRI動物模型研究中發現，部分miRNA具有促進腎臟IRI恢復的作用。Zheng等[45]建立大鼠腎臟IRI模型后發現，miR-381在腎小管上皮細胞中可特異性結合CXCR4基因，抑制CXCR4基因及其相關蛋白質表達如SDF1、VEGF、HIF-1α等，從而增強腎小管上皮細胞增殖，減輕上皮細胞凋亡，促進大鼠腎臟IRI恢復。Song等[46]建立了特異性敲除小管上皮細胞miR-17-92小鼠模型，并對其造成腎臟IRI，結果發現，敲除miR-17-92的小鼠腎臟缺血再灌注后損傷程度較正常小鼠更為強烈，在外源性補充miR-17-92后可以部分逆轉缺血再灌注造成的腎臟損傷，提示miR-17-92具有潛在治療腎臟IRI的作用。

5 miRNA與低氧誘導因子（HIF）在腎臟IRI中的作用

HIF活化在IRI缺血或者低氧階段起重要的作用[47]。HIF的轉錄活性受HIF-α特定殘基的翻譯后羥化作用調節。HIF的靶點包括負責血管舒縮調節基因（如腎上腺髓質素、eNOS、血紅素加氧酶）、能量代謝（如GLUT-1、碳酸酐酶-9）、血管生成的信號（如血管內皮生長因子、血管內皮生長因子受體-1）和細胞保護作用（如腎上腺髓質素、促紅細胞生成素、血管內皮生長因子、HSP70）。因此，適當激活HIF可以改善缺血細胞存活狀態，并促進有益的適應性變化。抑制HIF-1α羥化酶從而穩定甚至激活HIF已成為許多疾病如心肌缺血、缺血性腦卒中和急、慢性腎損傷的治療策略與研究熱點之一[48-49]。研究發現，miRNA可受HIF-1α調控從而影響腎臟IRI過程。Aguado-Fraile等[50]發現，在大鼠腎臟IRI模型中，大鼠miR-127明顯上調，進一步的細胞學實驗顯示，miR-127上游受HIF-1α調控，下游調控驅動蛋白家族3B（KIF3B），參與細胞黏附、細胞內骨架穩定及細胞內信號分子傳導等生理活動。Wang等[51]通過低氧誘導HK-2細胞模擬腎臟IRI過程發現，低氧損傷后HK-2細胞內miR-20a-5p水平顯著減少，并發現miR-20a-5p受HIF-1α調控，并可以與自噬相關16樣蛋白1（ATG16L1）的mRNA的3′端相結合，從而影響腎臟IRI過程中細胞自噬水平。Wei等[52]研究表明，腎臟IRI過程中HIF-1α可以通過減少miR-489的生成，增加細胞凋亡水平從而加重腎臟IRI損傷。Bhatt等[41]亦觀察到miR-687在小鼠腎臟IRI過程中受HIF-1誘導，并通過HIF-1/miR-687/PTEN信號通路在小鼠腎臟IRI過程中調控細胞凋亡。

6 小結與展望

腎臟組織不同類型的細胞可能在不同的腎臟疾病中受到影響。為了解miRNA發揮的具體病理生理作用，有必要確定在具體腎臟疾病的情況下表達此miRNA的細胞類型。具有條件性過度表達或基因敲除的轉基因動物模型可能是研究miRNA在腎臟疾病中的作用和調控的最佳模型。在一定條件下識別miRNA調控及其靶基因變化的意義是目前臨床難點，因為單個蛋白質可以由多個miRNA調控，單個miRNA可以調節多個蛋白質。雖然miRNA對腎臟IRI的調節是一個令人興奮的新興研究領域，但更重要的是需要建構腎臟IRI過程中miRNA表達譜的變化，并完善miRNA-mRNA在腎臟IRI過程中的網狀對應作用。最終，通過信號通路分析等明確每一個miRNA在腎臟IRI過程中的具體靶點、作用機制及病理生理影響。值得注意的是，目前鑒定出的大多數miRNA都是差異表達的，并可以通過調節細胞凋亡、增殖、自噬等來抑制損傷反應，這可能為臨床指明了靶向調節腎臟IRI的新思路；同時也應該注意到HIF與miRNA之間的相互作用等新的IRI機制成為研究熱點的可能性；其次，在腎臟IRI的研究中，使用生物信息學技術對miRNA進行芯片檢測及通路分析的研究尚不豐富，芯片數據的檢測以及生物數據的挖掘將來可能成為腎臟病研究的熱點之一，也符合目前提倡的精準醫學理念，期待在今后的腎臟IRI研究中看到更多相關研究。