銀杏葉提取物EGB761對缺氧心肌細胞凋亡的保護作用及分子機制研究

李鵬盈，盧成志，周小波，王桂賢

1.天津市東麗區東麗醫院（天津300300）；2.天津市第一中心醫院心內科（天津300192）

缺血性心臟病（Ischemic heart disease，IHD）是威脅人類健康的常見病之一。IHD是因冠脈病變引起心肌缺血缺氧，導致心肌細胞凋亡、壞死損傷。這其中缺氧所導致的過度凋亡是該疾病的病因之一。既往研究表明，銀杏葉提取物761（Ginkgo biloba extract，EGB761）具有提高超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）活性及抗自由基作用［1］。而EGB761對心肌缺血及缺血再灌注損傷有預防和治療作用［1］，也可抑制由缺氧損傷引起的心肌細胞凋亡作用［2］，但目前為止其藥理作用機制尚不清楚。研究發現，過氧化物酶增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferater－activated receptor，PPAR－γ）在心肌細胞中發揮保護作用，可減輕心肌損傷，降低炎癥反應對心肌的損傷等［3］。本實驗就銀杏葉提取物EGB761對缺氧心肌細胞凋亡及其分子機制進行初步探討，以期明確上述具體機制，為缺血性心臟病的精準治療提供參考。

材料與方法

1 試驗藥物 EGB761是一種銀杏葉提取物，又稱金納多（Ginaton），購自德國 Wiumar Schwabe公司，批號為9840808，其成分穩定，專利受到永久保護，是當今改善腦及末梢血循環障礙的理想藥物［4］。EGB761的有效成分是24%的總黃酮和6%的萜類（銀杏內酯，銀杏苦內酯）。總黃酮的藥理作用主要表現在自由基清除方面，萜類主要表現為血小板活化因子（PAF）的拮抗作用和神經細胞的保護作用［5］。本研究用DMSO溶解并稀釋EGB761，用于后續實驗。

2 動 物 SF級雌性SD孕鼠40只（中國科學院動物中心），取出生1dSD乳鼠（雌雄不拘）為實驗動物。

3 試 劑 DMEM／F12培養基（美國Gibco公司，11320033，500ml），胎牛血清（美國 Gibco公司，10099141，500ml），EGB761（德國 Wiumar Schwabe公司，9840808），Trizol（美國invitrogen公司，15596018，100ml），PCR逆轉錄試劑盒（北京全式金公司，AT401－01，50rxns×20μl），sybgreen法實時定量 PCR試劑盒（北京全式金公司，AQ101－01，1ml），MTT（北京鼎國昌盛生物公司，298931，250mg），LDH、SOD檢測試劑盒（南京建成生物公司，A020－2，96T；A001－3，96T），Hoechst33342染色試劑盒（上海碧云天生物技術公司，C1026，50ml），引物（上海生工生物公司），Bax、Bcl－2、Caspase－3、NF－κB－p65、I－κB、PPAR－γ抗體（美國abcam公司），其余試劑為國產分析純，設計引物 PPAR－γ （141bp）： 上 游 TGCTGGTGATCAGAAGGCTG下游 TGTGTCAACCATGGTAATTTCAGT；NF－κB－p65（131bp）：上 游 TTCAACAT GGCAGACGACGA 下 游 AGGTATGGGCCATCTGTTGAC；I－κB （200bp）：上 游 AGATGAGTTGCCCTACGATGAC 下游 ATAGAATGCTCGGGG－CTAGG；Casp3 （169bp）：上 游GGAGCTTGGAACGCGAAGAA 下游 ACACAAGCCCATTTC AGGGT；Bax（110bp）：上游 TTGCTACAG－GGTTTCATCCAGG下游 CACT CGCTCAGCTTCTTGGT；Bcl－2（153bp）：上游 AGGATAACGGAGGCTGGGATG下游 CTCACTTGTGGCCCAGGTAT；β－actin（174bp）：上游 AGATCAAGATCAT TGCTCCTCCT 下游 ACGCAGCTCAGTAACAGTCC。

4 方 法

4.1 乳鼠心肌細胞的原代培養：取新生乳鼠，無菌狀態下開胸剪取心尖心肌組織，剪碎，酶解法37℃消化剪碎組織，終止消化后離心收集沉淀心肌細胞，以加入10%胎牛血清的DMEM／F12培養基孵育1h，棄去上清懸浮細胞，貼壁細胞即為原代心肌細胞，培養4 d后用于實驗。

4.2 實驗分組及心肌細胞缺氧損傷模型建立：將搏動狀態良好，生長密度無明顯差異的心肌細胞隨機分組：①對照組：正常培養；②缺氧組：培養的原代心肌細胞換無血清培養基后置于缺氧混合氣（95%N2－5%CO2）預充的單向氣流缺氧裝置中，檢測排氣口氧濃度低于1%，置于37℃培養箱內進行細胞缺氧［6］；③EGB7615μg／ml組：心肌細胞缺氧處理前加入5μg／ml EGB761；④EGB76110μg／ml組：心肌細胞缺氧處理前加入10μg／ml EGB761；⑤EGB76120μg／ml組：心肌細胞缺氧處理前加入20μg／ml。

4.3 心肌細胞缺氧時間的確定：將正常的原代心肌細胞接種于數塊96孔細胞培養板內，分為對照組和缺氧6、24、48h組，處理后使用MTT法檢測細胞活性，在波長490nm處測定各孔OD值，以選取缺氧處理時間。

4.4 LDH活性的測定：將正常的原代心肌細胞接種于數塊24孔細胞培養板內，按實驗分組方法分為5組，按以上實驗確定的缺氧時間處理細胞，缺氧完成后取細胞上清，LDH酶活性檢測試劑盒檢測LDH活性。

5 SOD活性測定 將正常的原代心肌細胞接種于24孔細胞培養板內，按以上分組及條件處理細胞，缺氧完成后超聲粉碎細胞，取樣，SOD酶活性檢測試劑盒檢測SOD活性。

6 Hoechst染色檢測細胞凋亡情況 將正常的原代心肌細胞接種于6孔細胞培養板內，按以上分組及條件處理細胞，培養完成后棄培養基，PBS液清洗3次，加入 Hoechst 33342染液（1mg／ml），避光室溫染色15min，棄染液，PBS液清洗3次，用熒光顯微鏡觀察，拍照。

7 實時定量 PCR 檢測 PPAR－γ，NF－κB－p65、I－κB、Bax、Bcl－2、Caspase－3基因表達 細胞接種于數塊6孔板內，按以上分組及條件處理細胞，Trizol法提取細胞總RNA，sybgreen法實時定量PCR檢測各組信號分 子 PPAR－γ、NF－κB－p65、I－Κb，凋 亡 相 關 基 因Bax、Bcl－2、Caspase－3表達情況。

8 Western－blot法檢測 PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB、Bax、Bcl－2、Caspase－3蛋白表達情況 細胞接種于數塊培養皿內，按以上分組及條件處理細胞，細胞裂解提取總蛋白，電泳轉印后ECL法顯影，灰度分析各條帶，與內參進行半定量分析各組蛋白表達量的變化。

9 統計學方法 所有數據均使用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學處理及制圖，結果均以均數±標準差表示。各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為統計學有統計學意義。各組蛋白表達水平以Image J 2.0軟件進行半定量灰度分析。

結 果

1 EGB761對缺氧原代心肌細胞存活率的影響MTT結果顯示：6h時缺氧組較對照組細胞存活率顯著下降，而加入10μg／ml EGB761和20μg／ml EGB761時，缺氧原代心肌細胞的存活率明顯升高，5μg／ml EGB761則沒有效果。12h及24h缺氧組較對照組細胞存活率下降明顯，但12h及24hEGB761各濃度組與缺氧組比均無差異（P＞0.05），見表1。

表1 不同濃度EGB761對缺氧原代心肌細胞存活率的影響

2 EGB761對缺氧原代心肌細胞上清液LDH含量變化及細胞內SOD活性影響 與對照組相比，缺氧組LDH 漏出量增加，10μg／ml、20μg／ml EGB761均可顯著減少缺氧心肌細胞LDH外漏，且20μg／ml EGB761作用效果更好，但5μg／ml EGB761作用效果不明顯，與對照組相比，缺氧組細胞內SOD活性降低，不同濃度的EGB761均可顯著升高缺氧心肌細胞內SOD活性，且濃度越高，效果越好，見表2。

3 EGB761對缺氧原代心肌細胞凋亡的影響Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，正常細胞的細胞核出現彌漫均勻的低強度熒光，而凋亡細胞的細胞核固縮，呈致密濃染或碎塊狀致密濃染或半月形凝聚。Hoechst33342染色檢測細胞的凋亡情況，結果發現，和對照組相比，缺氧組可明顯誘導原代心肌細胞凋亡，10μg／ml、20μg／ml EGB761均可明顯抑制缺氧心肌細胞凋亡，且20μg／ml EGB761抑制效果更明顯，而5μg／ml EGB761對缺氧心肌細胞的凋亡作用效果不明顯（圖1）。

表2 EGB761對缺氧原代心肌細胞上清液LDH含量變化及細胞內SOD活性影響

圖1 Hoechst33342染色檢測原代心肌細胞凋亡情況

4 EGB761對缺氧原代心肌細胞凋亡相關基因mRNA和蛋白表達的影響 為了進一步探討EGB761對缺氧原代心肌細胞凋亡的影響，我們采用Real time PCR和 Western blot方法，分別從凋亡基因mRNA和蛋白表達方面探討EGB761對缺氧原代心肌細胞的保護作用。結果顯示，與對照組比，缺氧組Bcl－2的mRNA和蛋白水平均明顯下調，Bax mRNA和蛋白水平均明顯上調，Bax／Bcl－2比率顯著升高，且 Caspase－3 mRNA和蛋白水平均明顯上調；10μg／ml、20μg／ml EGB761均可顯著升高缺氧心肌細胞Bcl－2的mRNA和蛋白表達水平，降低Bax、Caspase－3的mRNA和蛋白表達水平，且20μg／ml EGB761作用效果更明顯，但5 μg／ml EGB761對缺氧心肌細胞的凋亡基因作用效果不明顯（圖2－3）。

圖2 EGB761對缺氧原代心肌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響

圖3 EGB761對缺氧原代心肌細胞凋亡相關基因蛋白表達的影響

5 EGB761對缺氧原代心肌細胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB mRNA和蛋白表達的影響為了探究EGB761抑制缺氧心肌細胞凋亡的分子機制，我們采用Real time PCR 和 Western blot方法，分別從 mRNA和蛋白表達方面檢測凋亡相關信號通路中關鍵因子的表達。結果顯示，與對照組比，缺氧組PPAR－γ、I－κB的mRNA和蛋白表達均明顯降低，NF－κB－p65的mRNA和蛋白表達明顯上升，表明缺氧抑制原代心肌細胞PPAR－γ通路，并激活NF－κB－p65的活性；不同濃度的EGB761均可顯著上調缺氧心肌細胞PPAR－γmRNA和蛋白表達，且濃度越高，上調作用越明顯；10μg／ml、20μg／ml EGB761顯著下調 NF－κB－p65的 mRNA和蛋白表達，顯著上調I－κB的mRNA和蛋白表達，但5μg／ml EGB761對缺氧原代心肌細胞 NF－κB－p65和I－κB的表達沒有作用，表明EGB761可激活缺氧原代心肌細胞PPAR－γ通路，并抑制 NF－κB－p65的活性（圖4－5）。

圖4 EGB761對缺氧原代心肌細胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB mRNA表達的影響

圖5 EGB761對缺氧原代心肌細胞PPAR－γ、NF－κB－p65、I－κB蛋白表達的影響

討 論

心肌活動消耗的能源主要來自于有氧代謝，所以心肌對缺氧非常敏感。在缺氧環境下，線粒體功能出現障礙，從而啟動線粒體凋亡途徑，導致心肌細胞凋亡發生。而心肌細胞凋亡，又是決定心肌梗死面積得主要決定因素之一。銀杏葉提取物EGB761是從銀杏科植物葉子中提取的一種含有多種有效成分的混合物，主要有效成分是24%的總黃酮和6%的萜類（銀杏內酯和銀杏苦內酯）［4］，可以逆轉心肌細胞的損傷發生，促進心肌細胞的存活［2］。然而其具體的作用機制尚不明確，本研究以原代培養的乳鼠心肌細胞為研究對象，采用低氧培養系統建立體外心肌細胞缺氧模型，研究發現缺氧顯著降低心肌細胞的存活率，而銀杏葉提取物EGB761可逆轉這一現象（表1），與文獻報道一致［8－9］。表明銀杏葉提取物EGB761對缺氧狀態下的心肌細胞具有保護作用。而這種保護作用可能是通過調控心肌細胞線粒體凋亡途徑，從而抑制心肌細胞凋亡來實現的［10］。

心肌細胞損傷導致細胞漿內的酶釋放外泄到培養液里，其中包括活性穩定的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）。因此細胞培養液中LDH的活性可反映心肌細胞的損傷情況。在我們的實驗中與對照組相比，缺氧損傷模型組LDH活性升高；而加入不同濃度的EGB761后，LDH活性隨著EGB761濃度的升高逐漸降低（表2），表明EGB761抑制心肌細胞凋亡，在一定程度上維持了心肌細胞膜的完整性。

在缺氧狀態下，心肌細胞線粒體功能障礙，而線粒體是活性氧的主要產生場所和影響目標。過多的活性氧會破壞線粒體正常功能、破壞細胞膜的正常結構，引起細胞凋亡［11－13］。超氧化物歧化 酶 （Superoxide dismutase，SOD）是生物體內天然的氧自由基清除劑，可抑制由氧化應激引起的細胞凋亡［14］，也可以改善心腦血管疾病［15］。有文獻報道，銀杏葉提取物也可提高SOD的活性而起到清除氧自由基的作用，抑制由缺氧誘導的心肌細胞凋亡［16］。本研究也發現，缺氧可導致SOD活性下降、心肌細胞凋亡增加；而加入EGB761后，細胞內的SOD活性升高，同時心肌細胞凋亡減少，且20μg／ml濃度組效果優于10μg／ml濃度組（表2）。而在線粒體凋亡途徑中，Bcl－2／Bax－Caspase－3信號通路基因、蛋白的表達量變化可以直接反應細胞凋亡情況。閔寧斌等研究發現，EGB通過抑制Bax的表達及提高Bcl－2的表達水平來逆轉心肌細胞的損傷發生［2］。Qiao ZY等在缺氧再灌大鼠模型中發現，EGB761對大鼠心肌細胞的保護作用與下調Bax、細胞色素C和Caspase－3的表達有關；Bcl－2的高表達通過抑制線粒體釋放細胞色素C和阻滯Caspase－3的激活來防止缺氧再灌引起的細胞凋亡［18］。本研究也得到了與之一致的結果（圖2－3），分子水平上說明EGB761通過線粒體凋亡途徑抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferater－activated receptor，PPAR－γ）是對機體代謝過程起重要調控作用的一種核激素受體，不僅在脂質代謝、糖代謝中發揮作用，同時還作用于細胞增殖分化、凋亡和炎癥調控等過程［3，19－20］。Zeng等研究發現，MirRNA－128通過激活PPAR－γ抑制缺氧所致的心肌細胞凋亡［21］。Suzuki T等研究發現，心房肽通過激活PPAR－γ實現心肌保護作用［22］。Han J等的研究發現，迷迭酸通過激活PPAR－γ下調NF－κB通路抑制缺氧再灌大鼠的心肌細胞凋亡［23］。進而有研究報道PPAR－γ對細胞的抗凋亡作用是通過下調NF－κB通路來實現的［24－25］。本研究發現，缺氧誘導心肌細胞發生凋亡，并抑制PPAR－γ和I－κB的表達，促進 NF－κB的表達，NF－κB通路被激活；而加入EGB761后，心肌細胞凋亡減少，PPAR－γ表達上調的同時，I－κB表達上調，NF－κB表達下調，NF－κB通路被抑制。

這些結果表明EGB761通過線粒體途徑抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。而EGB761對心肌細胞的保護作用與PPAR－γ、NF－κB信號通路激活有關，但其具體分子機制還是接下來的繼續研究方向。