RNA干擾在破骨細胞分子調控應用的研究進展

張譽泓 戚孟春* 董偉 張明洋

1．華北理工大學博創口腔醫院，河北唐山063000

2．華北理工大學附屬醫學院，河北唐山063000

RNA干擾(RNA interference，RNAi)現象最早是在1990年Jorgensen研究加深矮牽牛花花色的實驗中發現的，該研究在大量引入同源編碼基因后出現了白色的花朵，這種現象被稱作共抑制現象［1］。隨后，Fire等在研究秀麗新小桿線蟲中發現，在給予線蟲注射雙鏈RNA后出現的基因沉默現象比注射單鏈正義或反義RNA更有效，并將此現象首次命名為RNAi［2］。破骨細胞介導的骨吸收是近些年的研究熱點，本文總結了在破骨細胞分子調控中采用RNAi技術的應用，以期為科研工作者采用RNAi技術對破骨細胞的研究提供一定的參考。

1 RNAi的作用機制及優缺點

作用機制:RNAi的過程包括起始階段、效應階段和擴增階段［3］;在RNA干擾過程中有兩種作用的分子，分別是小分子干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小 RNA(microRNA，miRNA)。①起始階段:雙鏈RNA(dsRNA)經由細胞內具有核糖核酸酶Ⅲ活性的Drosha蛋白和Dicer酶識別內源或/和外源性dsRNA，并將其切割成為21～25個核苷酸的 siRNA或 miRNA。②效應階段:siRNA/miRNA通過運載蛋白-5以及TRBP蛋白的作用下與具有裂解dsRNA活性的Argonaute2(AGO2)蛋白結合，組成RNA誘導沉默復合物，誘導基因沉默。具體是在解旋酶的作用下siRNA解螺旋，其反義鏈與靶基因mRNA通過堿基互補的方式結合，并活化RNA誘導沉默復合物，最終將靶基因mRNA剪切為碎片［4］。③擴增階段:siRNA作為引物，靶基因mRNA作為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下形成新的dsRNA，然后再重復經過起始階段及效應階段，如此循環往復產生級聯擴增效應，加強靶基因的沉默效應。

RNAi具備以下優點:高特異性、內在生物學反應［5］和高效性，因此可作為多種類型細胞信號研究的篩選與驗證工具。RNAi應用的主要問題是能否特異性地遞送到靶向組織中，并長時間有效。病毒和非病毒載體可用以解決細胞轉染效率低下的問題，非病毒傳遞在靶向、轉染和表達方面效率極低，但是病毒載體存在如安全問題、病毒毒性高、可能致癌、已證實的免疫原性和成本限制等問題［6-7］。

2 RNAi在破骨細胞的有效靶點

破骨細胞由核因子 B配體激活受體(RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)刺激分化產生。破骨細胞的分化吸收又受到相關基因的調節，RANKL-RANK-OPG是誘導破骨細胞分化的重要途徑，Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨細胞生成的重要信號通路，骨質的降解依賴于骨吸收微環境的酸化以及破骨細胞分泌的各種酶類。

2.1 RANKL/RANK/OPG系統

RANK作為RANKL/RANK/OPG系統和RANK信號通路的匯聚點，在破骨細胞分化中起著主要作用，RNAi沉默RANK可以明顯抑制小鼠骨髓來源的巨噬細胞向破骨細胞分化及活化［8］。體外選擇性敲除小鼠骨髓細胞RANK基因能顯著阻斷酒石酸耐酸性磷酸酶的形成［9］。這些增進了科研者對于開發靶向RANK藥物的熱情。

2.2 Ca2+/Calmodulin/NFATc1信號通路

近年來研究發現Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨細胞生成的重要信號通路，對OC分化及骨吸收發揮著極其重要的調控作用［10-12］。在 Calmodulin下游，CaMKs是calcineurin之外的另一類信號分子，在鈣信號傳遞中負責下游許多信號蛋白的活化(磷酸化)，對OC分化及許多特異基因的表達起關鍵調控作用。通過RNAi敲除CaMK抑制了破骨細胞的生成［13］，CaMKs 包括 CaMKI、CaMKII、CaMKIV 3 種亞型，對 OC分化起作用的主要是 CaMKII和CaMKIV［14］;CaMKIV基因敲除可使OC生成數目顯著下降［15］，國內學者對 CaMKIIγ、CaMKIIδ 進行RNA干擾可顯著抑制破骨細胞生成及骨吸收功能［16-17］;NFATC1是破骨細胞生成的主要調節因子，被認為在破骨細胞形成中起著重要作用。小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)中采用RNAi特異性敲除NFATc1導致成熟破骨細胞的形成減少，并且明顯降低破骨細胞特異性基因TRAP和組織蛋白酶K的表達［18］，這些研究結果表明RNAi對于破骨細胞的基因敲除發揮一定的作用。

2.3 骨吸收微環境的酸化

微環境發生酸化是啟動酶降解骨基質的前提，骨吸收陷凹內的低pH(4～6)環境是由V-ATP酶質子泵形成的，可以通過抑制V-ATP酶等方法來阻止褶皺緣外的微環境pH的降低來降低破骨細胞的溶骨能力。Ac45(Atp6ap1)是V-ATP酶復合物的組成成分，負責酸化和內吞作用。Ac45基因對于破骨細胞維持正常的骨吸收功能是必需的。體外和體內RNAi敲除Ac45基因后，明顯破壞了破骨細胞介導的細胞外酸化及骨吸收［19］。RNAi介導的Atp6i沉默阻止小鼠骨性根尖周炎的骨侵蝕與牙髓病炎癥反應［20］，靶向Atp6i防止炎癥和牙周炎引起的骨侵蝕并揭示其在骨免疫中的重要作用［21］，上述研究均揭示了使用RNAi技術靶向抑制AC45影響破骨細胞骨吸收的良好效果。

2.4 破骨細胞分泌的組織蛋白酶K及DC-STAMP蛋白

細胞分泌多種溶酶體酶，破骨細胞動員骨礦物質之后，幾種水解酶會降解有機骨組分。參與該過程的主要蛋白酶是組織蛋白酶K(Cathepsin K)，并且Cathepsin K是破骨細胞的主要標志物，RNAi靶向Cathepsin K破壞破骨細胞在體內發揮骨吸收功能，并且可以減少88%的細菌感染刺激的骨吸收［22］。可見RNAi的立桿見影的影響。

樹突狀細胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)是介導人類無骨吸收能力的單核破骨細胞前體融合為具有骨吸收能力的多核破骨細胞所必需的關鍵性蛋白質。慢病毒其所介導的RNA干擾技術成功抑制了DC-STAMP表達，抑制了破骨細胞的生成［23-24］。

總之，RNAi在破骨細胞分子調控的應用越來越受到重視，這有可能成為未來破骨細胞分子水平研究的主要科研工具。

3 展望與結論

RNAi作為一種新型的干預方法對于沉默異常基因具有相當大的潛力，特別是對于常規治療無法有效靶向的基因靶標，它已被廣泛用于功能基因組學研究［25］、醫學研究、生物技術、全基因組篩選等。RNAi在研究破骨細胞分子調控中的應用將會不斷出現，RNAi可作為今后研究人類破骨細胞相關基因功能的理想工具。