海洋環境中細菌耐藥性研究進展

趙小慧 蘇潔 樊景鳳,4 馬悅欣

(1 大連海洋大學，水產與生命學院，大連 116023；2 國家海洋環境監測中心，大連 116023；3 國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室，大連 116023；4 國家海洋局第四海洋研究所，北海 536000)

目前致病菌耐藥性的增加和擴散已經成為全球公共安全問題。近年來，由于抗生素的濫用加速了細菌耐藥性在自然環境中的傳播擴散。這些耐藥微生物可通過直接或者間接接觸(如食物鏈)等途徑進入人體，進而危及公共健康。根據歐洲疾病預防與控制中心以及歐洲藥監局的統計數據，每年大約有25000歐洲人(5.1/100000居民)死于耐藥性細菌感染[1]。美國疾病預防與控制中心2013年統計報道，美國每年至少有兩百萬人感染各種耐藥性細菌，其中耐藥性細菌感染直接導致的死亡人數超過23000人[2]。為積極應對細菌耐藥帶來的挑戰，維護人民群眾身體健康，2016年國家衛生計生委等14個部門聯合制定了《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016—2020年)》[3]。

海洋占地球總面積的70.8%，是一個具有多層次耦合的自然系統。與大陸環境相比海洋環境有著明顯的特點。首先海洋中存在著水-汽-冰三態轉化的復雜過程，其次海水在包括波浪、潮汐和海流等水文動力下不停運動著。而這些特點都會直接或間接影響海洋環境中的微生物生境進而影響細菌耐藥性的傳播擴散。研究表明海洋環境已成為攜帶抗生素抗性基因(ARGs)的微生物傳播擴散的重要媒介之一[4-6]。本文系統闡述了海洋環境中細菌耐藥性的產生原因、流行現狀及傳播途徑，并提出了今后的研究重點。

1 海洋環境中細菌耐藥性產生原因

抗生素在海洋環境中可能發生水解、光解和生物降解等一系列降解反應[7]。然而不同抗生素在海水環境中殘留時間長短不一，部分抗生素進入水體后降解緩慢(如土霉素，即使在低濃度下也能存在很長時間[8])，在水體中能較長時間地維持一定濃度，細菌在藥物選擇壓力下就產生了耐藥性[9]。因此海洋環境就成為細菌耐藥性傳播擴散的理想場所。除了天然存在于原始環境的細菌耐藥性和抗生素抗性基因[10]，海洋環境中有3種可能的途徑會導致細菌耐藥性發生：第一種途徑是陸源耐藥性細菌隨著河流徑流入海；第二種途徑是人類活動使用的抗生素隨地表徑流入海，海洋細菌在其長期選擇壓力下產生抗性；第三種是對海洋土著生物分泌的活性代謝產物產生的抗性。

抗生素污染源可直接或間接進入海洋環境，海洋環境中的抗生素來源主要有3種：一種是工業、城市生活廢水中的殘留抗生素直接流入海水水體或經地下水間接污染海水水域。城市的污水處理系統并不能完全去除廢水中的殘留抗生素，某些抗生素在污水處理過程中無法被有效地去除，去除效率一般為60%～90%[11]；第二種是來源于水產養殖業抗生素藥物的濫用。抗生素被大量用于水產經濟動物疾病的預防和治療，或以飼料添加劑的形式用來改善飼料轉化率促進動物的生長。有研究證明由于大部分的抗生素很難被動物吸收利用，因此大約有30%～75%的抗生素以母體化合物形式隨糞便和尿液排出體外[12]，這些抗生素返回到環境中，對公眾健康構成潛在威脅[13-14]。因此直接加到水體用于治療或預防病害的、未被水產養殖生物吸收的和隨糞便排泄的抗生素可能聚積于水體及底泥沉積物中造成污染[15]； 另一種是來源于臨床醫療機構的廢水排放。抗生素作為治療用藥在臨床上得到廣泛應用且使用量巨大。抗生素使用后，少部分經過機體新陳代謝而被吸收或代謝，但大部分以原形或活性代謝物形式隨糞便、尿液排出體外[16]，最終通過生活污水、醫院廢水、藥企廢水及廢棄物等途徑進入環境[17]。例如，Szekeres等[18]發現與磺酰胺類抗生素有關的磺胺I類抗生素抗性基因(sul1)和磺胺II類抗生素抗性基因(sul2)存在于羅馬尼亞研究場所的醫院廢水中。

2 海洋環境中細菌耐藥性流行現狀

近年來，細菌耐藥性研究重點逐漸由土壤、養殖場、臨床環境和污水處理系統中轉移到河口及海洋環境中。目前大部分海洋環境中細菌耐藥性的研究集中在可培養細菌的耐藥性分布狀況、抗生素抗性基因及其豐度檢測方面。蔣魁等[19]對來自于2012—2014年南海海水養殖魚類中分離到的病原菌哈維弧菌進行細菌耐藥性檢測發現，在廣東、海南和廣西地區養殖魚類中所分離到的哈維弧菌耐藥譜具有復雜多樣性特征，隨著時間年份的遞增，哈維弧菌耐藥譜種類也發生著變化，耐藥譜不斷擴大延伸。海灘娛樂水域耐藥性問題也是人們關注的焦點，如海口假日海灘浴場、三亞大東海浴場中分離到的革蘭陰性菌耐藥性檢出較為普遍，耐藥菌的構成比達到了45.0%[20]。王玥等[21]對大連星海浴場近岸海水中分離得到的41株大腸埃希菌進行藥敏試驗，結果顯示大腸埃希菌的多重耐藥率達到34%，表明大連星海浴場海水中大腸埃希菌多重耐藥狀況嚴重。馬來西亞馬塘紅樹林河口中分離到的耐藥性大腸埃希菌對氨基糖苷類和β-內酰胺類抗生素的耐藥率達到83%和37%[22]。此外，研究發現馬來西亞半島近岸海洋環境中耐藥細菌的流行率很高[23]。如分離自馬來西亞北部半島近岸海水和沉積物樣品中的氣單胞菌和弧菌均表現出對至少5種抗生素的耐藥性[24]。馬來西亞近岸海水中分離得到的耐藥性弧菌的多重耐藥率為68%[25-27]。不僅河口和近岸海洋環境中的細菌耐藥性流行率很高，馬來西亞海產品中分離得到的弧菌對各種抗生素也均具有耐藥性[23]。在可供游客參觀游覽且被列為自然保護區的無人居住島嶼Berlenga的近岸海水中也已分離到多重耐藥性大腸埃希菌且多重耐藥率達到39%[28]。

海洋環境中分布著多種抗生素抗性基因，如Hatosy等[29]研究發現44%的海洋優勢微生物類群(例如Pelagibacter、原綠球藻和弧菌等)中均發現了抗生素抗性基因的存在。Zhu等[30]在中國沿海4000多公里的18個河口沉積物中分析了ARGs，檢測到超過200個不同的抗性基因。在高豐度和多樣性豐富的抗生素抗性基因中，磺胺類和四環素類兩類抗生素抗性基因檢出率較高。鄒世春等[31]發現北江河水域中sul1和sul2基因含量水平顯著較高，污染較嚴重。渤海灣海水和沉積物中sul1和sul2檢測率為100%且豐度范圍為10-5～10-2/16S基因拷貝[32]。Gao等[33]在河口、附近的沿海和海洋流域中檢測到所有類型的ARGs中，sul-ARGs和tet-ARGs具有最高的檢測頻率，并且平均檢測率分別達到100%和87.9%。

海洋環境中可培養菌株耐藥性研究結果表明，海洋環境尤其是受人類活動影響較大的海域中細菌的耐藥率和耐藥程度嚴重，耐藥譜種類繁多。其中海水養殖致病菌、海洋環境中分布廣泛的革蘭陰性菌、環境糞便污染指示菌大腸埃希菌等是主要的研究對象；海水養殖環境、海水浴場、近岸海洋環境是主要的研究水域。抗生素抗性基因在河口、近岸海水及海洋環境中被大量檢出，具有種類豐富、分布普遍等特點。在眾多的抗生素抗性基因中磺胺類及四環素類抗生素的研究較多。海洋環境中細菌耐藥性問題日趨嚴重，為更有效避免耐藥性在海洋環境中的廣泛傳播擴散，保護公眾健康，開展細菌耐藥性相關研究是刻不容緩的。

3 海洋環境中細菌耐藥性傳播擴散途徑

海洋環境已逐步成為耐藥性細菌和抗生素抗性基因的重要“儲存庫”[34-35]，細菌耐藥性可通過增殖動力學垂直傳遞給微生物后代，也可通過水平基因轉移(horizontal gene transfer,HGT)在細菌中傳播，最終導致環境細菌成為各種抗生素抗性基因的天然儲存庫[36]。

耐藥決定因子通常位于染色體和可移動遺傳元件(如質粒、游離DNA、轉座子、整合子等)上，這些可移動遺傳因子可以在不同分類和生態類群的細菌間發生轉移[37]。研究發現水平基因轉移是耐藥性傳播的主要原因[38]。

因此，本文著重討論海洋環境中細菌耐藥性的水平基因轉移機制。越來越多的研究表明，細菌耐藥性可在可移動遺傳元件的作用下，通過水平基因轉移對環境中的共生菌和病原菌之間傳播擴散。水平基因轉移包括3種機制：接合、轉化和轉導。接合相比轉化提供了更有效的進入宿主細胞的方式；接合相比噬菌體轉導能夠提供一個更廣泛的宿主范圍。因此認為接合對ARGs的傳播影響最大，但最近研究表明轉化和轉導對ARGs播散也起到不可忽視的作用。

3.1 接合

接合(conjugation)又稱接合作用，是供體細胞通過性菌毛與受體細胞互相溝通，將遺傳物質(主要是質粒DNA)從供體菌轉移給受體菌，通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的遺傳重組現象[39]。接合現象既可以發生在同種細菌中，也可以發生在同屬不同種間的細菌中，傳遞的可以是不同種類抗生素的耐藥性。這種方式主要出現在革蘭陰性細菌中。趙莎等[40]研究大連付家莊海水浴場中大腸埃希菌耐藥性時發現抗生素抗性基因可通過質粒接合方式在同種屬環境菌株中進行傳遞。說明海洋環境中抗生素耐藥性可通過質粒接合方式進行傳播擴散。

3.2 轉化

轉化(transformation)是受體細菌通過直接吸收來自供體細菌或環境中含有特定基因的游離DNA片段，并在受體菌內整合表達，從而獲得相應的遺傳現狀，使其獲得抗性的過程。Vries等[41]研究表明,至少有87種細菌可以通過自然轉化吸收胞外游離的DNA并發生水平轉移，包括假單胞菌和不動桿菌等菌屬。土壤細菌間耐藥質粒可通過接合或轉化的方式傳遞ARGs[42]。但游離的DNA在大洋海域中的濃度很低(0.6～88μg/L)[43-44]，而在游離DNA濃度過低的情況下發生高頻率轉化的概率較小。海洋環境中細菌耐藥性通過轉化方式水平基因轉移的機制還有待進一步研究發現。

3.3 轉導

轉導(transduction)是指噬菌體通過侵染宿主細胞，組裝子代噬菌體時錯誤地將菌體內的外源基因片段(抗生素抗性基因)帶入宿主細胞，整合到宿主細胞遺傳物質上并得以表達，從而使宿主細胞表現出抗性的基因轉移機制[45]。噬菌體對于細菌微生物在任何環境中的塑造起著重要的作用。噬菌體可通過局限性或普遍性轉導有利于微生物宿主的基因，進而促進自身的生存和傳播。轉導作用主要發生在同種細菌中，且傳遞的是同一種抗生素的耐藥性，這是因為噬菌體有特異性，并且所傳遞的DNA量很小。可轉移的DNA序列包括染色體DNA和MGEs，如質粒、轉座子及基因組島[46]。研究發現，海洋環境介質中，海洋噬菌體的種類多、濃度高，以噬菌體為媒介，以轉導為手段的遺傳物質傳遞的頻率也會較高[47]。海洋中還有數量眾多的浮游病毒，而且在大量海洋細菌的基因組中也發現有前噬菌體(prophage)基因的存在[46]。噬菌體在水生細菌耐藥性的傳播擴散方面起到重要作用。Jiang等[46]證明了海洋噬菌體宿主分離物能夠在細菌宿主中轉移抗生素抗性質粒，因此轉導可能是海洋環境中普遍發生的水平基因轉移方式。

3.4 基因轉移因子

一般認為只有以上3種機制介導了水平基因轉移，但是近年來，研究者們在光和紫色非硫細菌(Rhodobacter capsulatus)中發現了一類新的水平基因轉移機制。這是一種不是由典型噬菌體所介導的，但是與病毒介導的普遍性轉導相似的轉移機制[48]。研究者將這種介導水平基因轉移的物質稱為基因轉移因子(gene transfer agent,GTA)，并認為GTA有可能是海洋生態環境中介導水平基因轉移的主要機制。研究發現，64個含有原病毒的海洋細菌基因組中至少1/3的前噬菌體基因是編碼GTA的基因[49]。Bires等[50]也驗證了海洋中優勢菌群(α-proteobacteria和poseobacter)的代表菌株DSS-3可以借助GTA發生水平基因轉移，而且通過GTA的水平基因轉移并不需要細胞之間的接觸。

4 海洋環境中細菌耐藥性傳播擴散的影響因素

近年來，許多研究人員更加注重耐藥性的傳播擴散過程和耐藥機制。結果表明，基因突變并不能全面解釋耐藥性的快速大量傳播。在自然環境中，垂直傳播和水平基因轉移在耐藥性的傳播過程中起著至關重要的作用。耐藥性傳播過程是受到復雜的環境因素和多種理化因素綜合影響驅動的。因此，全面了解海洋環境中耐藥性傳播的影響因素將有助于闡明細菌耐藥性變化的趨勢，有助于改善人類健康和生態安全。

4.1 外部影響因素

4.1.1 外源抗生素

外源抗生素是影響海洋環境中耐藥性傳播擴散的重要影響因素之一。而外源抗生素與人為活動是密不可分的。鄒世春等[31]對北江各采樣點所獲得的磺胺類抗性基因污染水平與3種磺胺類抗生素總濃度的定量分析結果進行比較后發現，二者具有一定的相關性，這表明外源性抗生素對河流的污染是誘導抗性基因的重要因素。馬來西亞馬塘河口耐藥性大腸埃希菌的相關研究結果表明人為活動導致的抗生素排放加劇可能是大腸埃希菌多重耐藥性產生的主要因素[22]。用于娛樂活動，灌溉和其他目的的河流也已成為耐藥性傳播的重要媒介[51-53]。Niu等[32]研究發現渤海灣水體及沉積物中抗生素與相應的抗生素抗性基因具有相關性，表明抗生素在抗生素抗性基因的產生和轉移中起重要作用。

4.1.2 降雨

現有研究表明降雨也會影響海洋環境中抗生素抗性基因的豐度。暴風雨可以通過攪動、混合等方式將沉積物中的耐藥細菌和抗生素抗性基因釋放到海水中。最近一項研究報道，美國弗吉尼亞州Stroubles Creek流域豐水期樣品中sul1、sul2、tetW和ermF抗生素抗性基因明顯高于枯水期樣品中的濃度[54]。Ahmed等[55]在美國佛羅里達州Tampa灣的豐水期和枯水期間，通過對幾個雨水排放口中的抗生素抗性基因濃度進行測定，結果表明在豐水期樣品中，整合子基因Intl2和Intl3的檢測率增加了42%。且在檢測到的抗生素抗性基因中，與枯水期相比，在豐水期期間收集的樣品中部分抗生素抗性基因的相對豐度(以ARGs GC/16S rRNA GC計算)顯著升高，表明降雨可能通過影響外源抗生素濃度和整合子濃度從而間接影響耐藥性的傳播擴散。

4.1.3 環境理化因子

抗生素隨河流徑流入海后，濃度會被稀釋減少。當抗生素濃度較低時，細菌耐藥性與外源抗生素之間的關系變弱。其他因素可能替代抗生素的作用影響了細菌耐藥性的傳播和抗生素抗性基因的轉移[33]。

重金屬可能是抵消降低河口和海洋環境中垂直傳播效果的主要因素之一。當抗生素選擇壓力較弱時，它們也可能在抗生素抗性基因的傳播擴散中發揮重要作用。Lu等[56]對兩個河口的sul-ARGs濃度變化結果的統計分析表明，幾種重金屬與sul-ARGs呈現顯著正相關，且Pearson的相關系數要高于抗生素殘留和sul-ARGs之間的相關系數。這表明，在河口和海洋環境中重金屬可能直接和間接地促成抗生素抗性基因的擴散，影響抗生素抗性基因的分布和傳播。

除了重金屬，其他環境因子也會影響耐藥性的傳播擴散。Yang等[57]研究表明酸性(pH=4)水環境不僅影響抗生素抗性細菌(ARB)的群落組成，還可能影響整合子介導的水平基因轉移，進而影響流域中抗生素抗性基因的相對豐度。郭業彬等[58]研究長江水系中產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBL)大腸埃希菌(Escherichia coli)耐藥基因轉移的影響規律時發現溫度和pH值對產ESBL大腸埃希菌耐藥基因水平轉移影響明顯。Lu等[56]研究發現，隨著鹽度的增加，sul-ARGs豐度的顯著降低。

4.2 內部影響因素

此外，還有研究發現環境中I類整合子也是影響抗生素抗性基因傳播擴散的重要因素。例如，Lu等[56]研究發現sul-ARGs的相對豐度與int1的相對豐度呈顯著正相關。Niu等[32]對I類整合子與抗生素抗性基因的回歸分析結果也表明，I類整合子促進了sul1和sul2的傳播和擴散。另有研究顯示環境中的微生物群落結構與細菌耐藥性也有著密切的關系[30,59]。Frost等[60]通過對體外競爭實驗研究抗生素抗性和敏感菌株之間的相互作用發現細菌群落的密度和空間結構對于β-內酰胺抗生素耐藥性的上升可能是至關重要的，同時結果證明結構化群落對抗生素抗性的選擇具有復雜且令人驚訝的影響。

5 研究展望

隨著陸源抗生素的遷移及人為因素影響，海洋環境逐漸成為耐藥性細菌和抗生素抗性基因的儲存庫。然而，目前對海洋環境中細菌耐藥性的研究仍然很有限，許多新的耐藥基因或抗性機制尚未被發現認識。隨著抗生素種類的不斷推陳出新，可能會產生以前未被發現的針對某種抗生素的耐藥基因，已知的耐藥基因也會出現突變從而產生新的耐藥基因。這些新的耐藥基因還需要進一步研究發現。此外，一些已知的耐藥機制還尚未在海洋環境中得到證實。同樣現在一些已經被發現但功能未知的耐藥基因的耐藥機制也需要進一步研究探索。雖然已知影響細菌耐藥性傳播擴散的因素有很多，但在注重生態環境的今天如何有效控制海洋環境中耐藥性的傳播還是個未解難題。很多研究表明海洋環境中細菌耐藥性與其中微生物的群落結構有著顯著相關性，但還需對其關聯性進行更深入的分析解釋。各種復雜的遷移運輸導致了海洋環境中抗生素的遷移污染，也留給我們許多問題去發現和解決。