γ-輻照生鮮豬肉中氨基酸及小分子肽組成特征分析

何立超，吳文敏，楊海燕，孫秀秀，彭偉明，岳麗莉，靳國鋒,*，馬美湖

（1.武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

生鮮肉由于其水分含量高、蛋白質等營養物質含量豐富，在屠宰、分割、加工等過程中極易受微生物污染，如沙門菌、大腸桿菌、李斯特菌等致病菌。因此，生鮮肉的殺菌保鮮對其貯藏品質起著決定性的作用。關于生鮮肉殺菌保鮮方法的研究報道很多，主要包括物理法（如輻照[1-2]、超高壓殺菌[3]、超聲殺菌[4-5]、冷等離子體殺菌[6]、脈沖電場殺菌[7]等）和化學法（如使用乳酸[8-9]、CO2[10]等）。而輻照作為一種冷殺菌方式，能殺滅肉品內部絕大部分甚至全部的微生物，被認為是提高肉品衛生安全性、延長保質期最有效的方法之一[11-12]。Robert等[13]研究發現經3 kGy輻照后的生鮮牛肉，在4 ℃條件下可以貯藏42 d，而對照組未輻照的樣品只能貯藏7 d。我國1986年就出臺了《輻照食品衛生管理規定（暫行）》，允許肉品進行輻照處理，并在1994年制定了《輻照豬肉衛生標準》[14]。但是，到目前為止在我國輻照技術真正商業化用于生鮮肉的保鮮尚鮮見，其主要原因是肉類被輻照后會產生類似臭蛋味、血腥味、金屬味、燒焦味、硫磺味等輻照異味[15]，為消費者所不能接受。已有研究證實，肉品輻照異味主要是由于輻照過程中蛋白質發生氧化、降解有關。林若泰等[16]研究發現冷卻真空包裝豬肉γ-輻照后的異味成分主要是二甲硫、二甲二硫、甲硫醇等含硫揮發性化合物，且這些揮發性化合物主要來自于肌肉中的含硫氨基酸（半胱氨酸、蛋氨酸）以及VB1的輻照降解。Ahn等[17]認為肉品輻照過程中含硫氨基酸側鏈容易發生降解形成異味化合物。但是，到目前為止大多數肉類輻照方面的研究還主要集中在輻照的殺菌效果和揮發性輻照異味化合物組成方面，而關于輻照過程中肌肉蛋白質的降解情況研究很少。已經有大量研究表明，食品中蛋白質降解形成的一些小分子寡肽對食品的滋味有非常重要的影響[18]。

本研究主要通過分析豬肉輻照前后肌肉中蛋白質降解形成小分子寡肽（＜3 kDa）的情況以及氨基酸組成變化情況探索輻照對生鮮豬肉蛋白質降解的影響，為輻照技術在生鮮肉品中的應用提供參考，同時也為將來進一步研究輻照異味（滋味）形成機理提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉為雨潤集團公司當日宰殺的豬后腿肉。

茚三酮、氨基酸分析用緩沖液（均為色譜純）日本日立公司；氨基酸混合標準品、三氟乙酸、甲酸（色譜級） 美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

AR2140電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QY-300電動勻漿機 江蘇周莊科研器械廠；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；D-37520-3-30K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Q ExactiveTM質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；60Co-γ輻照源（活度1.1×1016Bq） 湖北省輻照實驗中心。

1.3 方法

1.3.1 樣品輻照

將購買的新鮮豬后腿肌肉去除結締組織及肉眼可見的脂肪，將其切成50 mm×40 mm×15 mm規格大小肉塊6 塊，將所有肉塊平均分成2 組，其中一組作為未輻照對照樣品，另一組進行3 kGy γ-輻照（劑量率3.4 kGy/h）。輻照結束后樣品立即取樣進行氨基酸及多肽組成的分析。

1.3.2 氨基酸組成分析

1.3.2.1 樣品酸水解

參考Galla等[19]的方法加以改進。將對照組和不同劑量輻照處理的肉樣分別用絞肉機進行絞碎處理，絞碎后分別稱取各處理組肉樣250 mg，裝入10 mL水解安瓿管中，緩慢加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，輕輕轉動安瓿管，使樣品全部到達管底部，并保證樣品全部潤濕后，保持恒穩氣流充氮2 min，丁烷噴槍封口，馬弗爐（110±1）℃水解24 h。水解管取出冷卻后，用醫用磨刀石切開水解管，用去離子水全部轉移到50 mL容量瓶中，定容、搖勻，雙層濾紙過濾，取濾液1 mL置25 mL小燒杯中，在加有NaOH的真空干燥箱中蒸干（約50 ℃），加入1 mL pH 2.2的HCl溶液（或0.02 mol/L HCl溶液）毛細管攪拌溶解，于10 000 r/min離心10 min，最后經0.22 μm水系微孔濾頭過濾，于樣品瓶中備用，低溫貯存（－20 ℃）待上機。

1.3.2.2 氨基酸標準曲線繪制

精確稱取氨基酸混合標樣0.24 mL，用0.2 mol/L HCl溶液定容至10 mL，Pro 6 nmol/50 μL，其余氨基酸單體3 nmol/50 μL，繪制梯度濃度，然后按樣品測定步驟進行。

1.3.2.3 氨基酸分析程序與條件

分析程序采用Hitachi氨基酸全自動分析儀蛋白質分析標準程序，分析周期75 min。分析柱26 mm×150 mm；樹脂2619；緩沖液流速0.225 mL/min；茚三酮流速0.3 mL/min；茚三酮壓力25 kg/cm2；柱壓90 kg/cm2；柱溫53 ℃；N20.28 kg/cm2；洗脫液級數5 級；進樣量50 μL；標樣濃度3 nmol/50 μL。樣品中氨基酸含量的最終結果以肉質量計（mg/100 g）。

1.3.3 多肽組成分析

1.3.3.1 小分子多肽提取

參考Ilko等[20]的方法，并作一定改進。50 mL無菌離心管內加入6 g肉樣和24 mL超純水，40 ℃振搖，靜置2 min后，均質2 min，然后4 ℃、3 000×g離心30 min。離心結束后，取上清液過濾，得到微濾液（多肽粗提液）。獲得的微濾液再用截留分子質量為5 kDa的超濾管以4 000×g進行20 min的超濾離心，截留分子質量小于3 kDa的多肽，得到相應超濾流穿液。上述樣品超濾過程各超濾離心管以冰塊和泡沫盒全程孵育，確保所有樣品溫度不超過4 ℃。

分別取各管超濾流穿液5 mL，轉移至各新管，冷凍干燥處理48 h，完全去除水分，得到多肽粗提粉末。每一批多肽粗提粉末均用500 μL的超純水進行復溶濃縮，之后分別轉移至1.5 mL EP管中。每個EP管中分別加入1 mL乙腈，劇烈振蕩，靜置5 min，用于析出超濾不完全且分子質量較大的蛋白和少量極性雜質。之后上離心機，10 000×g離心5 min，充分聚集沉淀。對各EP管內上清液做氮吹處理至溶液體積約500 μL，徹底去除加入的乙腈。剩余上清液采用針式過濾器和0.22 μm水系濾膜進行過濾，用于濾去多余的脂肪乳（粒徑大于0.22 μm），得到目標小分子多肽混合液。各EP管做好標記后，充氮置換掉殘余空氣，扣蓋并以Bemis無菌膜（Parafilm M?）嚴格密封，置于－20 ℃冰箱，待進行液相色譜-質譜分析。1.3.3.2 多肽序列分析

采用Q Exactive?組合型四極桿Orbitrap質譜儀對輻照組預處理多肽樣品進行序列鑒定，詳細分級操作如下：

1）ZipTip μC-18微量層析柱用于純化多肽。潤濕柱子：吸取10 μL乙腈重復2 次；酸化柱子：吸取10 μL 0.1%三氟乙酸溶液重復2 次；吸附樣本：吹吸樣本15 次；除雜質：吸取10 μL 0.1%三氟乙酸溶液，重復2 次；洗脫樣本：吸取2～5 μL 0.1%三氟乙酸溶液-50%乙腈溶液，將此洗脫液轉入新EP管。

2）Empore? SPE Cartridges C18（standard density）柱純化多肽除鹽。SPE柱加1 mL甲醇活化柱料；加1 mL 0.1%甲酸除去甲醇；加5%乙腈-0.1%甲酸溶液平衡柱子；加入樣本（重復2 次）；加入5%乙腈-0.1%甲酸除鹽除雜，重復3 次；加入1 mL純乙腈洗脫到1.5 mL離心管，冷凍抽干。

3）多肽液相色譜-質譜檢測。多肽樣品溶解液（0.1%甲酸溶液、2%乙腈溶液）溶解，充分振蕩渦旋，13 200 r/min、4 ℃離心10 min，上清液轉移到上樣管中，色譜上樣量5 μL。預裝柱（Acclaim PepMap RSLC，C18，300 μm×5 mm，5 μm，100 ?，Dionex）對上樣多肽液進行脫鹽處理（0.1%三氟乙酸溶液洗滌柱子15 min），之后進入C18樹脂分離柱（Acclaim PepMap，C18，75 μm×150 mm，3 μm，100 ?，Dionex）對混合多肽進行分離，流動相A為體積分數0.1%甲酸溶液，流動相B為體積分數80%乙腈溶液和體積分數0.1%的甲酸溶液（99∶1，V/V），流速300 nL/min，每個組分分析時間65 min。質譜分析使用單一的全掃描質譜Orbitrap（質量掃描范圍m/z 400～1 500；分辨率140 000），分離后的肽段直接進入質譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測，質譜原始文件經過MM File Conversion軟件處理轉換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT（www.matrixscience.com）檢索Uniprot_Susscrofa數據庫。肽段分析圖譜進一步通過國家國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫進行BLAST驗證其可信度，獲得最終多肽序列。

1.4 數據統計與分析

氨基酸檢測結果以 ±s表示，并用SAS 9.3統計軟件進行單因素方差分析，每組實驗獨立重復3 次。對于第0天各樣品的多肽數據，多肽結果通過序列比較，對來源于蛋白的同源肽段清除位點進行分析，統計輻照前后的多肽清除位點，結果以表格和柱狀圖呈現。多肽組檢索參數設置為一級質譜誤差2×10－5；二級質譜誤差0.6 Da。

2 結果與分析

2.1 輻照前后豬肉氨基酸組成及差異分析

表1結果表明，輻照處理后樣品中大部分氨基酸的含量比對照組有顯著降低（P＜0.05），只有Vla、Pro 2 種氨基酸與對照組差異不顯著。在輻照后含量發生下降的氨基酸中Leu、Ile、Met、Glu、Thr、Ser、Cys最為明顯，這表明支鏈氨基酸（Leu、Ile）、含硫氨基酸（Met、Cys）和帶醇羥基的氨基酸（Ser、Thr）在輻照過程中最容易受輻照的影響。這可能主要與這些氨基酸的結構有關，含硫氨基酸分子中的硫原子、Ser和Thr分子中的羥基，這些基團更容易受輻照的影響。關于輻照對含硫氨基酸的影響，大量研究已經證明輻照會使肉品中的含硫氨基酸發生顯著降解，形成一些含硫的水溶性輻照異味化合物[21]。Ahn等[22]通過對單體氨基酸進行輻照實驗研究發現脂肪族的Ile、Leu和Val是所有非含硫氨基酸中最容易受輻照影響的氨基酸，輻照能促使它們發生Strecker降解反應，分別形成2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛以及2-甲基丙醛；其次是脂肪族羥基氨基酸Ser和Thr，它們經過輻照后會形成大量的乙醛和丙醛。在肉品輻照過程中，氨基酸含量的變化還與蛋白質的水解有關，但是本研究中所有的氨基酸含量輻照后都呈不同程度的下降，這表明3 kGy劑量輻照還不足以使肌肉蛋白質徹底水解形成氨基酸，更多的可能是形成一些多肽。

表1 輻照前后樣品中的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of pork meat before and after irradiation

2.2 輻照前后豬肉中多肽組成及差異分析

根據文獻報道分子質量小于3 kDa的小分子肽對食品的滋味有重要影響，是食品滋味的重要貢獻者[23-24]。因此，本研究輻照結束后，通過超濾的方法提取肌肉中分子質量小于3 kDa的寡肽，然后對其進行高效液相色譜-電噴霧串聯質譜檢測分析，表2表明，肌肉經輻照后共產生分子質量小于3 kDa的多肽104 種，分別來源于21 種不同的肌肉蛋白質。對104 條多肽進行分析，發現這些多肽中最大分子質量為2 888 Da，來自Importin 13 OS=Susscrofa；最小分子質量為670 Da，來自肌鈣蛋白I。通過對不同分子質量小分子肽頻率分布進行統計，由圖1可知，3 kGy輻照后生成的小分子肽分子質量主要集中在1 200～2 600 Da之間，占到了輻照產生的小分子肽總量的76%。

表2 新鮮豬肉經輻照（3 kGy）顯著產生的小分子多肽序列Table 2 Major small molecular polypeptides in fresh pork produced after 3 kGy irradiation

續表2

續表2

圖1 3 kGy輻照后形成小分子肽的分子質量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of small peptides produced after 3 kGy irradiation

2.3 輻照后產生多肽的總體分布

根據Uniprot數據庫結合BLAST驗證表2中所有21 種蛋白序列號，并統計各種多肽的組織來源分布，如表3所示。

通過統計分析發現鑒定到的104 種多肽中，53%來自于肌肉結構蛋白降解，其中15.4%的多肽來源于肌聯蛋白，6.7%的多肽來源于伴肌動蛋白，8.6%的多肽來源于肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I。其中，肌鈣蛋白T產生的輻照小分子肽（6.7%）顯著多于肌鈣蛋白I產生的輻照小分子肽（1.9%）（P＜0.05）。另外4.8%多肽來源于肌間線蛋白，5.8%來源于肌收縮蛋白，2個擁有LIM結構域的蛋白——LIM結構域結合蛋白3和輔肌動蛋白相關LIM蛋白1a產生小分子肽的比例則分別占到了8.7%和2.9%。據報道，LIM蛋白的LIM結構域往往與肌動蛋白纖維以及肌纖維的Z-線相聯系，而肌收縮蛋白也是分布于肌節Z-線上一種重要纖維外結構蛋白質，往往和肌動蛋白及α-輔肌動蛋白相互結合作用[25]。因此，肌原纖維內骨架蛋白（肌聯蛋白、伴肌動蛋白、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I）的有限降解對輻照小分子肽具有突出貢獻（30.7%），而肌原纖維外骨架蛋白如肌間線蛋白、肌收縮蛋白和肌肉LIM結構域蛋白對輻照小分子肽的貢獻（22.2%）要低于肌原纖維內骨架蛋白（30.7%），這可能主要與其在肌肉中的含量以及水解敏感性有關。陳韜等[26]報道肌聯蛋白、伴肌動蛋白都是在肌原纖維蛋白中含量比較高且很容易發生水解的蛋白質。

表3 輻照（3 kGy）顯著產生的小分子多肽來源及分布比例Table 3 Origin and distribution proportions of major small molecular peptides in pork produced after 3 kGy irradiation

輻照（3 kGy）不僅造成肌肉本身結構蛋白的降解，而且還在一定程度上降解了其他類型蛋白質，形成的小分子多肽占總多肽含量31.8%。如突觸融合蛋白3同源體、突觸足蛋白2、核質穿梭轉運體13、熱休克蛋白β-1、鉀離子電壓閥門通道-亞型蛋白家族A成員1蛋白、核孔復合體蛋白Nup85、視松蛋白和一種Goosecoid同源框蛋白，它們占總多肽比例分別為10.6%、6.7%、3.8%、4.8%、2.9%、1%、1%和1%。這說明肌肉中其他類型非結構性蛋白質的降解也在很大程度上貢獻了輻照風味。

而肌漿蛋白質主要包括肌紅蛋白和參與肌肉收縮功能反應的酶蛋白，例如糖酵解酶系、三羧酸循環及脂肪酸β-氧化酶系、氧化磷酸化酶系、電子傳遞體有關酶系等。而本研究也發現了5 類可能對輻照小分子肽有貢獻的酶系，它們包括細胞色素b、巖藻糖激酶、乳糖酶-根皮苷水解酶、磺基轉移酶和一種PI3 C α-蛋白酶抑制劑，它們分別占到小分子肽含量的3.8%、3.8%、3.8%、1.9%和1.9%，總共貢獻了15.2%的小分子肽。

2.4 輻解（3 kGy）顯著產生的風味多肽中疏水性氨基酸分布

圖2 疏水性多肽數量與序列中疏水性氨基酸比例關系圖Fig. 2 Relationship between the proportion of hydrophobic amino acids and the number of major hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation

圖3 強疏水性多肽數量與序列中強疏水性氨基酸比例關系圖Fig. 3 Relationship between the proportion of highly hydrophobic amino acids and the number of major highly hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation

文獻報道疏水性氨基酸在多肽中的組成及位置都會影響多肽風味[27-29]。為進一步探究輻照處理降解肌肉蛋白質影響其風味的規律，分析3 kGy輻照后產生的多肽中疏水性氨基酸的分布情況。從圖2可知，57.02%（65 種）多肽序列中疏水性氨基酸的比例超過了50%。根據氨基酸疏水值的高低，疏水值高于0.8以上的ILe、Leu、Vla、Phe、Trp歸類為強疏水值氨基酸，低于0.8的Phe、Met、Pro等歸類為低疏水值氨基酸[30]。圖3表明，輻照風味肽強疏水性氨基酸的比例較低，其中76.32%（87 種）多肽序列中強疏水性氨基酸的比例不超過40%。這說明肌肉結構蛋白質的輻解過程中，低疏水性和親水性的肽段更容易受到粒子轟擊而掉落下來，而這些低疏水性或親水性多肽可能對輻照滋味和輻照異味起重要作用。而在肌肉結構蛋白質的輻解過程中，輻照風味肽強疏水性氨基酸占比相對較少，可能是強疏水性氨基酸在蛋白質內部形成了疏水核心，不易暴露降解造成的。

3 結 論

輻照處理后樣品中大部分氨基酸的含量比對照組有顯著降低。其中支鏈氨基酸（Leu、Ile）、含硫氨基酸（Met、Cys）和帶醇羥基的氨基酸（Ser、Thr）在輻照過程中最容易受輻照影響而降解。肌肉輻照產生的分子質量小于3 kDa的多肽主要集中在1 200～2 600 Da范圍內，占到了原始多肽總量的76%。肌肉中不同蛋白質對輻照敏感性不同，其中，肌原纖維結構蛋白經輻解產生的小分子肽超過了全部肽總量的50%，且肌聯蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白和LIM蛋白這5種肌肉結構蛋白受3 kGy輻照顯著降解；而肌漿蛋白中的酶系經3 kGy輻照后僅產生很少量的小于3 kDa的多肽。