基于競爭性等位基因特異性PCR技術的麥芽品種純度定性和定量檢測

蔣培基，王德良，徐東東，黃承雪，郭剛剛，欒春光,*，蒲 彪*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100015；3.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081）

大麥屬于小麥族大麥屬，是古老的禾谷物作物之一，是我國繼水稻、小麥、玉米之后的第4大禾本科作物[1]。麥芽是由大麥浸泡吸水發芽后烘干而成，是啤酒釀造的主要原料[2]。大麥麥芽一直以來都是啤酒廠把控產品質量的關鍵[3]。麥芽質量的好壞不僅影響啤酒品質以及口感，而且不同麥芽品種之間的淀粉、蛋白質等成分存在的差異也會造成啤酒廠在釀造工藝上存在一定的差別[4]。目前，大麥種植過程中會出現由于機械、生物等途徑造成的混雜，制麥和銷售中也會出現不法商販的人為摻假，導致市面上的大麥麥芽均一性不高，因此給釀造工藝的選擇上帶來很多問題，啤酒質量得不到保障[5-8]。所以，對于啤酒行業開展大麥麥芽的品種和純度檢測勢在必行。

近些年來，快速發展的分子標記技術以其遺傳穩定、重復性好及易操作等優點已經開始替代同工酶電泳和簡單理化指標分析等傳統方法，成為農作物品種鑒定的主要方法[9]。基于第1、2代DNA分子標記技術建立起來的農作物品種鑒定方法，比如限制性片段長度多態性[10-14]、隨機擴增片段長度多態性[15-16]和簡單重復序列[17-18]，相對于蛋白水平的鑒定具有一定優勢，但這些方法都是基于核酸片段的多少和片段大小完成物種的鑒別。對于親緣關系相近的品種之間存在判斷上的誤差，且無法完成混雜或人為摻雜的樣品進行檢測[19]。為克服以上缺點，人們開發出了第3代DNA分子標記，即單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。該分子標記的出現為農作物的品種鑒定提供了更為高效、準確、靈敏的檢測手段。楊潤婷等[20]對比了兩種常用的SNP分型方法，等位基因特異性聚合酶鏈式反應（allele-specific polymerase chain reaction，ASPCR）和高分辨率熔解曲線分析（high resolution melting analysis，HRMA），對16 個柚栽培品種和8 個柚雜種后代材料進行7 個SNP位點的分型研究時發現AS-PCR和HRMA均適用于柚類品種的區分和鑒定。 而AS-PCR方法是一種準確、低成本的SNP分型方法，適合普通實驗室使用。Bungartz等[21]用SNP基因芯片對20 個大麥品種進行品種鑒定研究，共發現6 334 個SNP標記。高麗峰等[22]分析來自Illumina小麥9K Infmium SNP芯片數據中6 254 個位點，從中篩選出43 個足以將193 份名優特和359 份實驗材料分開的SNP位點。除在基因組水平分析尋找相應的SNP標記物外，Pattemore等[23]還通過兩個大麥品種的轉錄組進行序列分析并確定了兩個典型大麥品種SNP的數量和分布，生成一組能區分兩個品種的特異性SNPs。以上研究表明，大麥基因組中含有豐富的多態性良好的SNP位點，可以用來對品種進行快速有效的鑒定。但以上研究中并未提出基于SNP檢測技術鑒定大麥麥芽品種的具體方法，而利用SNP分子標記技術對大麥麥芽純度的檢測也鮮有研究報道，張利莎等[24]利用30 個SNP位點成功對大麥麥芽盲樣進行檢測，但是實驗中并沒有提供大麥品種在各個SNP位點的基因型，無法直接用于實際檢測。

目前，SNP檢測方法雖然有所發展，但通過直接測序法確認的SNP結果往往受測序深度的影響，無法從測序誤差中鑒別出雜合子，所以需要更多的重復實驗提高準確性[25]。隨著測序技術的改進和發展，測序成本越來越低，直接測序法得到越來越多人的青睞[26-27]。Taq man探針與競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術的出現，不僅使得SNP的檢測更為高效、準確，而且操作簡單、可重復性高[28-30]。從而也使得基于SNP對品種鑒定的方法得以應用與推廣。本研究擬通過測序的方法，篩選并確認出能夠區分7 個大麥麥芽品種的SNP位點，進而運用KASP技術對麥芽樣品進行定性定量的檢測，從而建立了可以用來對麥芽進行定性和定量檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花30、風啤麥4號、風啤麥3號、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德、海德曼斯，由中國食品發酵工業研究院收集。預混樣品由麥特卡夫與卡普蘭德混合，混合比例為1∶1，并標注為“麥特卡夫”，由中國食品發酵工業研究院提供。

Taq酶、dNTP、10×Loading buffer 大連寶生物技術有限公司；PCR引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；KASP引物 上海艾吉析科技有限公司；植物基因組DNA高效提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti 96 Well Thermal Cycler、Qubit3.0熒光定量PCR儀北京Thermo Fisher Scientific有限公司；7500實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 大麥麥芽基因組的提取

準確稱取20 mg液氮研磨的麥芽粉末放入2 mL EP（Eppendorf）管中，按天根高效植物DNA提取試劑盒步驟提取大麥麥芽基因組DNA。提取的基因組DNA采用0.8%瓊脂糖TAE凝膠電泳進行質量檢測。經0.8%凝膠電泳檢測后，條帶完整，沒有降解。且條帶大小處于所需目的片段范圍之內。經Qubit3.0熒光定量PCR儀檢測后，DNA質量濃度均大于120 ng/μL，完全符合實驗所需的DNA質量濃度要求。

1.3.2 SNP位點的篩選

從NCBI上下載大麥基因組序列，通過Visual Genomics軟件篩選所需的SNP位點，參數選擇默認值。然后，在篩選到的多態性較好的108 個位點上下游300～500 bp位置設計引物，作為擴增的目的片段，擴增片段的引物采用premier 5.0進行設計。然后，以7 種大麥麥芽的基因組DNA為模板，用PCR儀擴增目的片段，PCR體系為20 μL：10×loading buffer 2 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；基因組DNA 1 μL（120 ng）；Taq酶0.2 μL；ddH2O 13.8 μL。PCR條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸7 min。擴增之后的產物送生工生物工程（上海）股份有限公司北京測序部進行測序。測序結果使用MegAlign軟件進行比對，確認篩選出的SNP位點，并建立對應7 個品種的SNP位點序列表與品種區分路線圖。

1.3.3 KASP引物的驗證

根據SNP位點前后的序列信息設計合成KASP引物（表1）。以7 種大麥麥芽品種基因組DNA為模板，利用ABI7500實時PCR儀進行KASP檢測。KASP體系：DNA（50 ng/μL）1 μL ，2×master mix 5 μL，雙蒸水4 μL，primer mix 0.14 μL。KASP條件：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火、延伸60 s，10 個循環（每個循環降低0.6 ℃）；94 ℃變性20 s，55 ℃退火、延伸60 s，26個循環。反應條件的設置以及結果的讀取均在7500 Software v2.3軟件上進行，對比確認基因型檢測的結果是否與一代測序統計結果SNP序列表中數據一致，驗證KASP引物的準確性。

表1 KASP引物信息Table 1 Information about KASP primers

1.3.4 預混麥芽樣品的定性檢測

從預混樣“麥特卡夫”中稱取100 mg大麥麥芽樣品，在研缽中加液氮研磨，稱取50 mg放入EP管中。按照1.3.1節的方法提取DNA以及對DNA質量進行檢測。以上實驗重復2 次，提取3 份樣品DNA，以確認實驗的準確性。以檢測合格的DNA樣品為模板，選擇驗證過的具有較好多態性的SNP位點設計對應的KASP引物進行檢測，檢測在實時熒光定量PCR儀上進行。此外，每個位點加入對應兩種不同基因型的大麥麥芽DNA作為陽性對照，陽性對照樣品如表2所示。反應體系與反應條件見1.3.3節，反應條件的設置以及結果的讀取均在7500 Software v2.3軟件上進行。該KASP實驗結果用于對比各SNP位點實測基因型是否與表2中麥特卡夫的基因型的一致性。

表2 定性檢測所使用陽性對照Table 2 Positive controls used for qualitative detection in this study

1.3.5 預混麥芽樣品定量檢測

根據1.3.4節的檢測結果，選取雜合基因型的SNP作為定量檢測的位點。從“麥特卡夫”樣品中隨機挑取100 粒大麥麥芽，每粒麥芽按照1.3.1節的方法提取基因組DNA作為定量檢測的DNA模板，用雜合基因位點的KASP引物在ABI7500實時PCR儀器上進行檢測。反應體系與反應條件如1.3.3節所示，反應條件的設置以及結果的讀取均在ABI7500 Software v2.3軟件上進行。定量檢測的結果以雜合位點上出現的麥特卡夫個數占總反應數的比值計算“麥特卡夫”樣品的檢測結果。

2 結果與分析

2.1 SNP位點的篩選

表3 普通PCR引物信息Table 3 Information about the common PCR primers

表4 SNP標記信息Table 4 Information about SNP markers

表5 大麥麥芽品種的SNP信息Table 5 SNP data for 7 barley cultivars

圖1 7 個品種基于SNP區分路線圖Fig. 1 SNP-based discrimination of 7 varieties

本研究成功篩選4 個多態性良好的SNP位點。用于擴增4 個SNP位點的普通PCR引物信息如表3所示，對應的SNP位點信息如表4所示。同時，并根據不同麥芽品種在各位點的堿基差異建立7個麥芽品種的SNP位點數據表（表5）及樣品純度鑒定的圖譜（圖1）。

2.2 KASP引物的驗證

以7 個大麥麥芽品種的基因組DNA為模板，利用每個位點對應的KASP引物在7500實時熒光定量PCR儀上進行基因分型的檢測，以此確認位點以及KASP引物的準確性。SNP基因型檢測結果如圖2所示。B01位點的引物驗證結果（圖2a）表明：風啤麥4號、風啤麥3號、海德曼斯的檢測的位點結果為GG；花30、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德的檢測的位點結果為AA。B02位點引物驗證結果（圖2b）表明：花30檢測結果為GG；風啤麥4號、風啤麥3號、Sebastian、麥特卡夫、卡普蘭德以及海德曼斯的檢測結果為CC。B03的引物驗證結果（圖2c）表明：花30、麥特卡夫、海德曼斯檢測結果為CC；風啤麥4號、風啤麥3號、Sebastian、卡普蘭德檢測結果為GG。B04號位點的引物驗證結果（圖2d）表明：風啤麥4號、Sebastian檢測結果為CC；花30、風啤麥3號、麥特卡夫、卡普蘭德、海德曼斯檢測結果為TT。實驗結果表明，4 個位點的KASP引物對7 個品種進行SNP檢測結果與一代測序結果一致，表明SNP位點和KASP引物的正確性，位點和引物可用于后續的檢測。

圖2 B01（a）、B02（b）、B03（c）、B04（d）位點KASP引物驗證結果圖Fig. 2 Results of KASP primer validation at B01 (a), B02 (b), B03 (c), and B04 (d)

2.3 預混麥芽樣品的定性檢測結果

圖3 B01（a）、B02（b）、B03（c）位點樣品基因型檢測結果Fig. 3 Qualitative detection of B01 (a), B02 (b), and B03 (c)SNP markers

圖3 a表明，3份“麥特卡夫”樣品DNA的檢測結果為AA。圖3b表明，陽性對照麥特卡夫與3份“麥特卡夫”樣品DNA檢測結果相同，為CC。圖3c表明，3份“麥特卡夫”樣品檢測結果為GC。統計3 個位點的檢測結果與麥特卡夫標準品在這3 個SNP位點基因型做比較，見表6。B01、B02位點檢測結果與麥特卡夫一致，B03位點出現了雜合，說明該SNP標記在“麥特卡夫”混合樣中具有多態性，能夠用于后續麥芽混合樣的定量檢測。

表6 麥特卡夫樣品與麥特卡夫標準品在SNP位點的檢測結果比較Table 6 Comparison of the results for Metcalf and Metcalf standards with three SNP markers

2.4 預混麥芽樣品的定量檢測結果

由定性檢測結果可知B03位點為雜合位點，可用于定量檢測。在檢測的100 粒大麥麥芽DNA樣品中，48.6%的樣品基因型在B03位點上是G（舍去少量未成功檢測的DNA樣品），即 “麥特卡夫”麥芽樣品純度為48.6%（圖4），與預混樣真實值50%之間的誤差小于3%。

圖4 B03位點“麥特卡夫”定量檢測結果Fig. 4 Quantitative detection of Metcalfe using B03 SNP marker

3 結 論

本研究利用生物信息學方法，篩選并鑒定出4 個能夠區分7 個大麥麥芽品種的SNP位點。同時，合成了KASP引物，并驗證了KASP引物的正確性。結合KASP基因分型技術，對預混麥芽樣品“麥特卡夫”樣品進行檢測。檢測結果表明該樣品為混合樣品，“麥特卡夫”的純度為48.6%。檢測的效率與準確度能夠滿足啤酒企業的需求，該方法為后續大麥麥芽品種的SNP分子標記鑒定方法的建立提供了新的實驗思路以及數據庫信息，為啤酒企業對原料質量的控制提供了可實際應用的方法。