應(yīng)用多重PCR快速鑒定自然發(fā)酵肉制品中6 種葡萄球菌

許隨根，陳 曦*，李家鵬，李金春，楊君娜，熊蘇玥，戚 彪，米瑞芳，黃 鑫，喬曉玲，王守偉*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，國家肉類加工工程技術(shù)研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

在自然發(fā)酵肉制品中，木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌和松鼠葡萄球菌通常是占據(jù)優(yōu)勢地位的葡萄球菌菌種[1-8]，它們在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中能夠產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶，對發(fā)酵肉制品風(fēng)味品質(zhì)的形成起著重要作用[9]，同時還能產(chǎn)生硝酸還原酶和一氧化氮合酶影響發(fā)酵肉制品色澤[10]，同時還產(chǎn)生過氧化氫酶具有抗氧化活性[11]，其中，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌是目前商業(yè)肉品發(fā)酵劑所用菌種的重要來源[12]。快速準確地識別和鑒定自然發(fā)酵肉制品中的葡萄球菌，可大大提高優(yōu)良肉品發(fā)酵劑葡萄球菌菌株的篩選鑒定效率，也有利于建立基于葡萄球菌菌群變化的發(fā)酵肉制品質(zhì)量監(jiān)控技術(shù)。

葡萄球菌屬的許多種其菌落形態(tài)、菌體特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。傳統(tǒng)的生理生化實驗耗時費力，Vitek 2鑒定系統(tǒng)、脂肪酸分析等則成本較高，不能滿足發(fā)酵肉制品葡萄球菌檢測中的快速、準確、低成本的需要[13]。目前，許多非培養(yǎng)方式鑒定技術(shù)被用于葡萄球菌的鑒定，包括種特異性聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、16S rDNA測序、聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[14-15]、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）等[16-17]、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）[18-19]。在眾多非培養(yǎng)方式鑒定方法中，特異性PCR技術(shù)以其快速、準確、簡單及低成本等優(yōu)點備受青睞，已得到了廣泛應(yīng)用[20]。至今，馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肉葡萄球菌的單菌種特異性PCR檢測方法已經(jīng)先后被建立[21-26]。

本研究以發(fā)酵肉制品中常見的肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌和松鼠葡萄球菌為研究對象，設(shè)計和篩選菌種特異性引物，優(yōu)化PCR體系，建立6 種葡萄球菌的多重PCR鑒定方法，應(yīng)用于發(fā)酵肉制品微生物檢測過程中的葡萄球菌快速識別與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

建立多重PCR方法體系所用菌株：1 株為本實驗室篩選，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；2 株購自丹麥科漢森公司，17 株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），詳見表1。多重PCR方法體系驗證所用菌株：本實驗室從傳統(tǒng)肉制品中分離得到，并采用Vitek 2微生物生理生化鑒定儀對菌株進行種屬鑒定。

表1 實驗菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA）肉湯（MRS）、胰蛋白胨大豆肉湯、腦心浸液肉湯 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；Premix TaqTM酶混合液 大連寶生物工程有限公司；SYBR Green I染料 北京康普生物技術(shù)有限公司；無水乙醇 北京化工集團；MCE-202 MultiNA微芯片電泳試劑盒 島津企業(yè)管理（中國）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計 德國賽多利斯公司；GI54DWS全自動高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；ESCO二級生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR儀美國伯樂公司；5417R冷凍離心機 德國艾本德公司；B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；MCE-202 MultiNA微芯片電泳系統(tǒng) 島津企業(yè)管理（中國）股份有限公司；Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)法國生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗菌株的培養(yǎng)

將表1中實驗菌株分別接種于100 mL培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。其中腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌分別取培養(yǎng)2、4、6、8、12、24、48 h菌液，用無菌生理鹽水10 倍系列稀釋后，合適的稀釋度取1 mL傾注于MSA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.2.2 細菌基因組DNA的制備

根據(jù)細菌基因組DNA試劑盒說明書進行。

1.2.3 特異性引物設(shè)計

選擇表1中菌的rpoB、gap、hsp60、tuf、sodA基因作為目的基因，用BioEdit比較其gap、rpoB、hsp60、tuf、sodA基因的基因序列，之后用Oligo7軟件設(shè)計3 對特異性引物，引物確定后，使用BLAST程序通過GenBank對各引物及擴增產(chǎn)物同源性進行比對，最終確定利用肉葡萄球菌的gap基因、腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌的rpoB基因設(shè)計菌種特異性引物。馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌則利用已經(jīng)報道的引物，所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 用于多重PCR的特異性引物Table 2 Specific primer sequences for multiplex PCR

1.2.4 引物的特異性檢測

提取表1中實驗菌株的基因組DNA作為模板，然后進行PCR擴增。針對引物添加量、退火溫度、循環(huán)數(shù)等進行優(yōu)化，確定最適反應(yīng)體系。采用25 μL的PCR體系，其中Premix Taq?酶混合液12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 2 μL，加無菌重蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，進行32 個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，冷卻到4 ℃，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL擴增產(chǎn)物進行微芯片電泳檢測。

1.2.5 多重PCR體系建立

將表2的6 對引物進行混合，以各目的菌株的DNA作為模板檢測多重PCR特異性，針對引物添加量、退火溫度、循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)文獻報道各引物對在多重PCR過程中呈相互抑制的關(guān)系，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)引物濃度配比可以有效避免目標條帶漏檢的現(xiàn)象，是影響多重PCR有效擴增目標條帶的關(guān)鍵因素[30]，首先設(shè)計不同引物濃度梯度的組合體系（表3中組合體系1～5），之后根據(jù)各引物所產(chǎn)生的條帶亮度調(diào)整不同菌種引物濃度（表3中組合體系6～21），以擴增出均一、清晰、明亮且特異性良好的目的條帶為標準，最終確定多重PCR體系為50 μL，包括Premix Taq?酶混合液25 μL，引物F（10 μmol/L）、引物R（10 μmol/L）各6.1 μL（引物F、引物R為6 種菌特異性引物按比例混合組成），每種菌模板DNA各1.5 μL，加無菌重蒸水補足至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，進行32 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)微芯片電泳檢測。

表3 引物添加量及組合體系Table 3 Primer addition and combination systems

1.2.6 多重PCR特異性檢測

采用優(yōu)化的多重PCR體系，分別以腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA以及6 種菌的DNA混合體為模板進行多重PCR特異性檢測實驗。

1.2.7 多重PCR靈敏度檢測

將6 種菌分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌生理鹽水進行10 倍系列稀釋后，平板計數(shù)；同時提取各稀釋度的菌體DNA，利用多重PCR方法進行檢測。

提取6 種菌對數(shù)生長期的菌體DNA，檢測濃度后分別進行10 倍系列梯度稀釋，以各稀釋度DNA作為模板進行多重PCR檢測。

1.2.8 多重PCR準確性驗證

采用建立的多重PCR方法對傳統(tǒng)肉制品中分離的8 株葡萄球菌進行鑒定，其結(jié)果與8 株菌利用16S rDNA序列分析、生理生化鑒定結(jié)果對比，驗證本實驗建立的鑒定方法的準確性。

1.2.9 PCR產(chǎn)物的微芯片電泳檢測

本實驗使用MCE-202 MultiNA 微芯片電泳系統(tǒng)，具體操作參照其使用說明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析及圖像處理

利用Excel 2010、SPSS19軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析；微芯片電泳圖像利用MultiNA viewer軟件進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性檢測結(jié)果

圖1 引物特異性驗證結(jié)果Fig. 1 Validation of the specificity of the primers

分別利用菌種特異性引物對表1中菌株進行PCR檢測，結(jié)果如圖1所示。所有目標菌株均產(chǎn)生預(yù)期條帶，且沒有非特異性條帶出現(xiàn)，非目標菌株則都沒有擴增出任何條帶。表明實驗所用的6 對引物具有很好的特異性，能夠應(yīng)用于這6 種葡萄球菌的種屬鑒定。

2.2 多重PCR體系建立

多重PCR擴增結(jié)果受dNTP濃度、引物、Mg2+濃度、Taq聚合酶、擴增條件等諸多因素影響[31]。根據(jù)文獻與聚合酶預(yù)混液試劑盒說明書，首先確定多重PCR體系總體積、Taq聚合酶預(yù)混液添加量和模板DNA添加量。針對引物添加量進行優(yōu)化，多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，不同比例的引物用量擴增的結(jié)果有所不同，引物用量較低時，會出現(xiàn)目標條帶未被擴增的現(xiàn)象。而當(dāng)引物用量過高時，會導(dǎo)致單一目標條帶過于明亮且彌散。當(dāng)6 種目標菌的引物濃度配比差異過大，易出現(xiàn)雜帶擴增的現(xiàn)象，圖2中1～4泳道，由于腐生葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌引物濃度含量較低（4 種引物用量均低于0.4 μL），因此，4 種菌的相應(yīng)條帶較暗或者未被擴增，16～19泳道，由于肉葡萄球菌引物濃度過低（引物用量0.2 μL），出現(xiàn)其目標條帶未被擴增現(xiàn)象，5泳道，當(dāng)6 種菌引物用量過高（6 種菌引物用量1.5 μL），又導(dǎo)致目標條帶過于明亮且彌散，同時出現(xiàn)非特異性擴增，6～8和12～15泳道，均有雜帶擴增現(xiàn)象，20～22泳道，均可擴增出6 條清晰、明亮且特異性良好的條帶。考慮到條帶明亮度的均一性及最大限度地提高擴增效率，最終，確定多重PCR體系中，木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、肉葡萄球菌和腐生葡萄球菌的引物添加量分別為0.6、1、1、1.5、1、1 μL（引物組合體系20）。

圖2 體系優(yōu)化電泳結(jié)果Fig. 2 Electrophoretic results from system optimization

2.3 多重PCR特異性檢測結(jié)果

利用上述建立的多重PCR體系，分別以腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌DNA作為模板，進行多重PCR特異性驗證。如圖3所示，目標菌株均擴增出預(yù)期大小的條帶，無非特異性擴增條帶出現(xiàn)，陰性對照未擴增出任何條帶，表明該體系可同時擴增出6 種葡萄球菌，引物間未發(fā)生交叉錯配現(xiàn)象，結(jié)果表明建立的多重PCR體系具有很好的種間特異性。因此，可利用該方法檢測自然發(fā)酵肉制品中葡萄球菌群落，或?qū)σ逊蛛x純化的葡萄球菌菌株進行快速種屬鑒定。

圖3 多重PCR特異性驗證結(jié)果Fig. 3 Validation of the specificity of multiple PCR

2.4 多重PCR的靈敏度檢測結(jié)果

2.4.1 多重PCR檢測單菌種的菌落數(shù)檢出限

利用平板計數(shù)方法，確定腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的菌液初始濃度分別為4.6×107、6.5×107、7.7×107、7.4×107、6.1×107、9.1×107CFU/mL。每種葡萄球菌的培養(yǎng)液經(jīng)10 倍梯度稀釋后，提取DNA進行多重PCR，結(jié)果如圖4所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的檢出限分別為4.6×101、6.5×102、7.7×101、7.4×101、6.1×101、9.1×101CFU/mL。目前肉制品中這6 種葡萄球菌檢出限相關(guān)報道較少。Shome等[29]應(yīng)用多重PCR方法檢測了牛奶中的松鼠葡萄球菌和表皮葡萄球菌，檢出限分別為103CFU/mL和102CFU/mL，與之相比本實驗多重PCR方法的靈敏度更好；姜彥君等32]報道了食品中3 種致病菌的多重PCR鑒定方法，其中金黃色葡萄球菌檢出限為101CFU/mL，與本實驗結(jié)果一致。

圖4 多重PCR檢測單菌種的菌落數(shù)檢出限Fig. 4 Detection limit of multiple PCR for colony counts of single strains

2.4.2 多重PCR檢測單菌種的DNA含量檢出限

測定腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA的初始質(zhì)量濃度分別為110、155、144、169、187、228 μg/mL，10 倍系列梯度稀釋后，以各稀釋度DNA作為模板進行PCR檢測。圖5各圖分別顯示其1～7泳道都擴增出目的條帶，陰性對照均未擴增出條帶，分析結(jié)果可以知道腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA的多重PCR檢出限分別為0.22、0.31、0.288、0.338、0.374、0.456 pg。

圖5 多重PCR檢測單菌種的DNA含量檢出限Fig. 5 Detection limit of multiple PCR for genomic DNA from single strains

2.4.3 多重PCR檢測多菌種的菌落數(shù)檢出限

分別提取6 種菌的各稀釋度菌體DNA，并將同一稀釋度的6 種菌體DNA同比例混合后作為模板進行多重PCR，擴增產(chǎn)物利用微芯片電泳進行檢測。如圖6所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的多重PCR檢出限分別為4.6×102、6.5×102、7.7×102、7.4×102、6.1×102、9.1×102CFU/mL。檢測結(jié)果表明實驗建立的多重PCR方法具有較好的靈敏度。劉紅玉等[33]報道了多重PCR同時檢測肉中4 種致病菌，檢出限與本實驗結(jié)果一致。

圖6 多重PCR檢測6 種葡萄球菌的檢出限Fig. 6 Detection limit of six strains detected by multiplex PCR

2.4.4 多重PCR檢測多菌種的DNA含量檢出限

將6 種葡萄球菌的DNA進行等量混合，10 倍系列梯度稀釋后進行多重PCR檢測，如圖7所示，腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌的DNA含量檢出限分別為2.2、3.1、2.88、3.38、3.74、4.56 pg。錢志偉等[34]建立了乳制品中3 種致病菌多重PCR檢測體系，金黃色葡萄球菌檢出限為3.8 pg；胡冰雪等[35]建立肉制品中熒光假單胞菌、沙門菌和單核細胞性李斯特菌的多重PCR檢測方法，DNA檢測限為1 pg，與本實驗結(jié)果一致。

圖7 多重PCR檢測6 種葡萄球菌DNA的檢出限Fig. 7 Detection limit of multiplex PCR for genomic DNA from six Staphylococcus strains

2.5 多重PCR準確性驗證

從貴州地區(qū)采集了3 種不同工藝的自然發(fā)酵酸肉，提取了酸肉微生物群落總DNA。利用本實驗建立的多重PCR鑒定方法，從酸肉微生物群落中檢測到了這6 種葡萄球菌。為進一步驗證多重PCR檢測的準確性，利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，從酸肉中分離純化了若干葡萄球菌，其中8 株葡萄球菌經(jīng)過16S rDNA序列分析、生理生化鑒定為松鼠葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌。同時利用多重PCR對這8 株菌進行鑒定，結(jié)果見表4，可知不同方法對8 株菌的鑒定結(jié)果一致，因此，本實驗建立的多重PCR方法具有較高的種間特異性，可快速、準確地用于發(fā)酵肉制品中肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌的檢測和鑒定，具有較好的應(yīng)用前景。

表4 兩種鑒定方法檢測結(jié)果對照Table 4 Comparison of multiplex PCR and automated microbial Identification system for the detection of Staphylococcus

3 結(jié) 論

本實驗設(shè)計、篩選6 種凝固酶陰性葡萄球菌的特異性引物，通過優(yōu)化引物濃度、PCR擴增體系、擴增條件、檢測系統(tǒng)等建立特異性好且穩(wěn)定的多重PCR快速鑒定葡萄球菌的體系，此體系將傳統(tǒng)方法中大量的生化試驗轉(zhuǎn)化為一次性PCR擴增，具有操作簡便、快速、靈敏度高等特點，便于批量檢測，而且相對傳統(tǒng)鑒定方法檢測成本大大降低。PCR產(chǎn)物利用微芯片電泳檢測系統(tǒng)，此檢測系統(tǒng)靈敏度高、檢測時間短[36]，相比傳統(tǒng)電泳系統(tǒng)大大縮短檢測時間。本實驗建立的多重PCR體系檢出限達到2×102CFU/mL，DNA含量檢出限達到4 pg，具有較好的靈敏度和特異性，利用實驗建立的多重PCR鑒定體系3 h就可以判定出結(jié)果，相比傳統(tǒng)的生理生化實驗省時省力，多重PCR法相比Vitek 2鑒定系統(tǒng)、脂肪酸分析等則成本較低，能夠滿足不具備Vitek 2鑒定系統(tǒng)科研單位和科研工作者的鑒定需求，具有較好的應(yīng)用前景。