不飽和脂肪酸對豬肉蛋白質乳化特性的影響

周 紛，孫 迪，許帥強，劉登勇，邵俊花,3,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

乳化作用是指兩種不相混溶的液體如油和水中的一種以極小的粒子均勻地分散到另一種液體中形成乳狀液的作用[1]。其中，把油滴分散到水中稱為水包油型乳狀液，水滴分散到油中則稱為油包水型乳狀液[1]。乳液經過機械攪打并且放置一段時間后，乳化體系中油水兩相間試圖減少接觸面積，而出現乳析、聚集、奧氏熟化、聚結和相轉變等現象，導致體系中油脂顆粒或者油滴粒徑的變化[2]。根據乳狀液中液滴粒徑的大小不同，可將乳狀液分為宏觀乳狀液（＞1 μm）、納米乳狀液（50～500 nm）和微乳液（＜50 nm）。在食品類乳狀液中，液滴粒徑在0.1～100 μm范圍內[2]。理想化認為乳化肉糜中脂肪球直徑大小為0.1～50 μm[3]。

脂肪酸按飽和程度可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，USFA）兩大類，其中USFA分為單不飽和脂肪酸（monounsaturatedfatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）[4]。MUFA主要為油酸（C18:l），PUFA包括亞麻酸（C18:3）、亞油酸（C18:2）、DHA（C22:6）等[4-5]。油酸較易被人體吸收，能夠減少高血脂的發生，也可抑制低密度脂蛋白的升高[6]。亞油酸是必需的脂肪酸，不僅能夠降低膽固醇，而且可以預防動脈粥樣硬化[7]。亞麻酸是含有3 個雙鍵的多元不飽和脂肪酸[5]，營養學界公認，如果嬰幼兒、青少年成長期間長期缺乏亞麻酸，會嚴重影響智力的正常發育[8]。

本實驗用油酸、亞油酸和亞麻酸這3 種脂肪酸處理肌肉鹽溶性蛋白質溶液，研究USFA對肌肉鹽溶性蛋白質乳化液乳化特性的影響，探究乳化液中脂肪酸和蛋白質的相互作用或者蛋白質與蛋白質相互作用對乳化液的影響情況，旨在改變脂肪酸組成、降低脂肪或者部分替代動物脂肪改善肉制品的保水保油和口感等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌 錦州市大潤發超市。油酸、亞油酸、亞麻酸、氯化鈉、三聚磷酸鹽、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速組織搗碎機 上海精科實業有限公司；磁力攪拌器 江蘇國華儀器廠；UV2250紫外-可見分光光度計 日本島津公司；T25 digital Ultra-turrak均質機德國IKA公司；BT-9300ST激光粒度分布儀 丹東市百特儀器有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Discovery DHR-1流變儀 美國TA公司；UMC-5C真空斬拌機 德國Stephan機械有限公司；BCD-215KALM立式冷藏柜 青島海爾股份有限公司；電熱鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；Nano ZS-90 Zeta電位儀 英國馬爾文公司；D-37520溫控離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉鹽溶性蛋白的提取及含量測定

肌肉鹽溶性蛋白的提取根據Zorba[9]和亢春雨[10]等的方法進行。具體步驟如下：剔除瘦肉上可見的結締組織和脂肪，切成肉丁，每100 g為一份，分裝于聚乙烯真空包裝袋中，置于－18 ℃貯藏備用。將100 mL 0.4 mol/L的NaCl溶液與25 g碎肉放入組織搗碎機，冰浴條件下18 000 r/min混合1 min，然后以8 000 r/min均質處理1 min。最后，用兩層紗布過濾去掉結締組織，提取的可溶性蛋白質量濃度的測定采用雙縮脲法[11]。

1.3.2 乳化液的制備

稀釋肌肉鹽溶性蛋白質量濃度至40 mg/mL和10 mg/mL，分別取一定體積添加體積分數0%、1%、3%和5%油酸（亞油酸或亞麻酸），配制成脂肪酸和肌肉鹽溶性蛋白混合液，并分裝于直徑為2.5 cm的塑料離心管中，在冰浴條件下用勻漿機9 500 r/min勻漿1 min，得到不同飽和程度脂肪酸與肌肉鹽溶性蛋白乳化液。4 ℃保存備用，并在30 min之內全部用完。其中，蛋白質量濃度為10 mg/mL時配制的乳化液用于乳化特性、化學作用力、微粒粒度分布及Zeta電位的測定，而蛋白質量濃度為40 mg/mL時配制的乳化液用于流變學的測定。

1.3.3 乳化活性和乳化穩定性的測定

采用濁度法測定乳化活性及乳化穩定性[12-13]。蛋白質量濃度為10 mg/mL的乳化液經過冰浴勻漿后立即從距離心管底0.5 cm的地方取勻漿液100 μL（剩下的勻漿備用），加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后用紫外分光光度計在500 nm波長處測定吸光度A1，勻漿后10 min再次在相同位置取勻漿液100 μL，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后測定吸光度A2，用0.1% SDS溶液作空白對照。每個處理組平行測定5 次，實驗重復3 次。乳化活性和乳化穩定性分別由式（1）、（2）計算：

式中：ω為乳化前蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳化劑中油的質量分數/%；A1為0 min時的吸光度；A2為10 min時的吸光度。

1.3.4 乳化液表面活性巰基含量的測定

參考Ellman[14]和Beveridge[15]等方法，并適當修改，采用吸光度法進行表面活性巰基的測定，具體方法如下：15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly緩沖液中。而后加入50 μL Ellman試劑（5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽溶于Tris-Gly緩沖液，4 mg/mL），25 ℃保溫反應60 min，離心（5 000×g，15 min），上清液在412 nm波長處測定吸光度，以含Ellman試劑的Tris-Gly緩沖液為空白對照。每個處理組平行測定5 次，實驗重復3 次，計算如式（3）所示：

式中：A為除去試劑空白后樣品的吸光度；D為稀釋倍數；C為樣品質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 乳化液微粒粒徑的測定

采用BT-9300ST型激光粒度分析儀測定乳化肉糜微粒的大小，可得到微粒粒度分布圖譜。具體參數設置如下：物質折射率實部為1.52，物質折射率虛部為0.10，介質折射率為1.33，分散劑為水，分析軟件為配套軟件[16]。其中，D10、D50和D90分別表示微粒的累計體積占顆粒體積群總體積的10%、50%和90%時的粒徑大小，即小于該粒徑的微粒體積占顆粒群總體積的10%、50%和90%[17]，每個處理組平行測定3 次，實驗重復3 次，測定D10、D50和D90并進行結果分析。

1.3.6 靜態流變的測定

在40 mg/mL肌肉鹽溶性蛋白溶液下，按油酸、亞油酸和亞麻酸添加量均分別為0%、1%、3%、5%配制得到脂肪酸與肌肉鹽溶性混合液，并在冰浴條件下用勻漿機9 500 r/min勻漿1 min，利用流變儀測定其黏度-剪切速率曲線。參照張文會[18]的方法，并進行適當調整。測試條件為恒溫15 ℃，測量板直徑40 mm，測定模式Flow Sweep，剪切速率選定10 個（2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 s－1），每個處理組平行測定3 次，實驗重復3 次。

1.3.7 乳化液Zeta電位的測定

根據Crudden等[19]的測定方法，并適當修改，用Nano ZS-90 Zeta電位儀測定乳化液和蛋白溶液中蛋白的Zeta電位值，溫度設置為25 ℃，每個處理組平行測6 次，實驗重復3 次。

1.4 數據統計分析

數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，采用ANOVA進行方差分析，數據進行正態分布檢驗，符合正態分布的多重比較采用Duncan’s法，不符合正態分布的用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05，差異顯著，作圖采用軟件Origin 8.6和Sigma Plot 12.5。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸對乳化液乳化活性和乳化穩定性的影響

乳化活性是蛋白質與蛋白質之間或者蛋白質與脂肪之間的相互作用[20]，其增加有助于乳化物的形成[9]。從圖1可以看出，隨著脂肪酸添加量的增加，乳化液的乳化活性均呈整體上升趨勢，并且增加幅度較大。在相同添加量脂肪酸的乳化液中，均表現為亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組。這證明脂肪酸的飽和程度對肌肉鹽溶性蛋白起到了一種較好的乳化作用；這也可能是因為亞麻酸和亞油酸的添加使得乳化液中蛋白質與脂肪酸之間的相互作用或者是蛋白質分子之間的靜電斥力增加，使得脂肪酸吸附的蛋白質量增加或者使得離散雙電層加厚，溶液潔面膜增厚，從而形成更加致密穩定的蛋白質膜，因而增加了乳化液的乳化活性[21-22]。

圖1 脂肪酸對乳化液乳化活性的影響Fig. 1 Effect of fatty acids on emulsifying activity

圖2 脂肪酸對乳化液乳化穩定性的影響Fig. 2 Effect of fatty acids on emulsion stability

從圖2可以看出，隨著添加量的增加，乳化液乳化穩定性均逐漸降低，當脂肪酸的添加量達到3%和5%時，各組乳化液的穩定性較低，且與添加量為0%和1%的處理組均具有顯著性差異（P＜0.05），此時的乳狀液有明顯的分層現象發生，這可能因為乳狀液的分散相液滴在體系中處于永不停止的布朗運動，產生了不同程度的失穩現象[23]。此外，添加油酸和亞油酸的乳化液乳化穩定性，均表現添加量為3%和5%之間差異不顯著。但是，當脂肪酸添加量為3%和5%時，同種添加量下乳化液乳化穩定性均是表現為亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組。這說明脂肪酸添加量在一定條件下，脂肪酸的飽和程度對乳狀液貯藏穩定性有很大影響。此外，3%脂肪酸的添加量比5%脂肪酸添加量的乳狀液穩定性高，5%脂肪酸添加量的乳狀液分層高度最大，這說明5%添加量的條件下，脂肪酸-全肉鹽溶性蛋白乳化液容易發生聚集和橋聯現象，導致乳狀液的不穩定現象發生[24]。同時，這也可能是因為5%的脂肪酸添加量下由于沒有足夠的蛋白質包裹脂肪酸的液滴，部分脂肪酸液滴重新聚集成團，重新形成油層分布在溶液的上部[24]或者是形成較多的蛋白質膜因重力的作用下沉導致分層嚴重。

2.2 脂肪酸對乳化液表面活性巰基的影響

圖3 脂肪酸對乳化液表面活性巰基的影響Fig. 3 Effect of fatty acids on surface active sulfhydryl content of emulsion

蛋白質分子中，巰基是最具活性的功能基團[22,25]。巰基存在于肌球蛋白分子內部，當肌球蛋白結構發生變化，暴露出自由巰基，這些自由巰基就會發生氧化反應，然后形成二硫鍵[22,25]。由圖3可以看出，油酸和亞油酸組均隨著脂肪酸添加量的增加，乳化液的表面活性巰基也明顯增加（P＜0.05），而亞麻酸組隨著添加量的增加，乳化液的表面活性巰基變化并不明顯，這說明油酸和亞油酸的添加量（1%～5%）可能會使得肌球蛋白結構發生較大變化，暴露出較多的自由巰基，進而發生氧化反應形成二硫鍵，使得全肉鹽溶性蛋白的表面巰基含量也隨之增加[22,25]。此外，在整個添加量變化的過程中，表面活性巰基的含量始終表現為油酸組＞亞油酸組＞亞麻酸組，這說明添加亞麻酸會降低全肉鹽溶性蛋白的表面巰基含量，而添加油酸會更好地使肌球蛋白結構發生變化，從而暴露出較多的自由巰基。

2.3 脂肪酸對乳化液微粒粒度的分布

實際食品乳化液中微粒尺寸分布在一定范圍內，屬于多分散乳狀液，多分散相乳狀液可以用單峰、雙峰或者多峰表示，這主要取決于微粒尺寸分布的峰值數量[16-17,26]。由圖4可知，橫坐標是乳化液微粒的直徑大小，縱坐標是某一粒徑的微粒占顆粒群總體積的百分比。整體上油酸、亞油酸和亞麻酸組的乳化液粒度分布曲線均呈現“單峰”型。其中，各處理組均在微粒粒徑大小為10 μm左右出現明顯的峰值，而且在微粒粒徑大小為40 μm左右時，分布曲線微微上升，但未形成明顯的峰。各處理組與空白組對比可以看出，各處理組的微粒粒度分布曲線均比空白組的分布曲線左移，并且添加量越大分布曲線發生左移的現象越明顯，從油酸、亞油酸和亞麻酸的添加量方面可以得出，添加量越少意味著乳化液中生成了更多的肌動球蛋白聚集體[27]。

此外，油酸空白組的峰值明顯高于其他處理組，并且在出現峰值之前，在微粒粒徑大小為1～10 μm之間時，體積分數始終表現為5%油酸＞3%油酸＞1%油酸＞空白，但在出現峰值之后，表現結果恰恰相反，這也說明了添加量越大分布曲線發生了規律性的左移現象；亞油酸各處理組的峰值變化并不明顯，且峰值出現前后各處理組的變化與油酸添加量的變化相似；5%添加量的亞麻酸組出現的峰值達到4.21%，明顯高于其他亞麻酸組，同時也高于油酸和亞油酸各處理組的峰值，這說明在一定的微粒粒徑大小范圍內，5%亞麻酸組可以較好地與全肉鹽溶性蛋白相互作用，使得5%亞麻酸較好地被鹽溶性蛋白包裹或者被蛋白質基質物理鑲嵌[28]，從而得到的乳化液顆粒比較均一，集中程度較好。

圖4 乳化液微粒粒度體積分數分布Fig. 4 Particle size distribution of emulsion

由圖5可以看出，所有處理組在微粒粒徑小于10 μm時，累計分布曲線變化較緩慢，隨后分布曲線急速上升，最后趨于100%。而且，油酸、亞油酸和亞麻酸各處理組的微粒粒徑累計分布，均表現的是空白組＜1%＜3%＜5%。

圖5 乳化液微粒累計體積分數分布Fig. 5 Cumulative particle size distribution of emulsion

粒度是描述一組顆粒降解程度的一個數學函數，它被定義為在一定范圍內，通過測量得到的該顆粒的相對數量[29]。由表1可以看出，隨著各脂肪酸添加量的增加，乳濁液中D10、D50和D90對應的粒徑大小均顯著性降低（P＜0.05），這說明在一定的添加量范圍內，全肉鹽溶性蛋白能夠較好地乳化油酸、亞油酸和亞麻酸，使得肌肉鹽溶性蛋白在脂肪酸顆粒或液滴周圍形成界面蛋白膜，減少脂肪酸顆粒或液滴的聚集[9]，進而使得乳化液中的顆粒粒徑大小降低。此外，在各種脂肪酸添加量一定的情況下，各處理組中微粒大小均表現為D10＜D50＜D90。當脂肪酸添加量達到3%時，乳化液中D10、D50和D90對應的微粒大小，則表現為油酸組＜亞油酸組＜亞麻酸組，這也說明隨著添加量的增加，乳化液中沒有足夠的蛋白質來包裹脂肪酸的液滴，部分脂肪酸液滴重新聚集成團易發生聚集和橋聯現象[24]。

表1 脂肪酸對乳化液粒徑大小的影響（n＝9）Table 1 Effect of fatty acids on particle size distribution of emulsion (n= 9)

2.4 脂肪酸對乳化液靜態流變特性的影響

圖6 不同剪切速率下脂肪酸對乳化液剪切應力的影響Fig. 6 Effect of different amounts of fatty acids added on shear stress of emulsions at different shear rates

流動行為和黏性特征是食物中蛋白質的重要功能性質，對乳化液和懸浮粒子提供物理穩定性，并且還能夠改善食品的口感和整體的品質[30]。由圖6可知，乳化液的剪切應力隨著剪切速率的增加均呈現先緩慢增加后急速上升的趨勢，這一結果與Er?elebi等[31]研究乳清分離蛋白中添加果膠和瓜爾豆膠的研究結果相似。

當剪切速率在2～256 s－1范圍內時，各組剪切應力隨剪切速率緩慢上升，此階段可能是脂肪酸和蛋白質競爭吸附的過程，表面的剪切應力開始被表面活性物質所控制[32]。當剪切速率超過256 s－1，各組的剪切應力急劇上升，此時由于摩擦產生了大量熱量，探頭表面瞬間產生的高溫使周圍的脂肪酸進一步熔化成更小的液態脂肪滴，這些形狀大小不同的脂肪滴周圍表面生成大量蛋白膜，分布在蛋白基質中，由于這些蛋白膜的束縛或者限制了乳化液的流動，使得乳化液不易發生流動[33-34]，因此需要較大的剪切應力。

剪切稀化在乳液的流變特性研究領域中是最常遇到的現象，它表現為剪切速率越大，黏度則越小的趨勢[35]。由圖7可知，隨著剪切速率的增大，所有處理組的乳化液黏度均逐漸減小，最后趨于平緩。其中，在較低的剪切速率下，隨著剪切速率的增大乳化液黏度急劇下降；在較高的剪切速率下，隨著剪切速率的增大乳化液黏度下降幅度很小，主要原因可能是在剪切應力作用下乳化液中液滴的取向作用遠高于布朗運動所引起的隨機效應，黏度隨之下降，當剪切作用力達到一定程度時，液滴定向排布，黏度趨于定值[16,36]。

圖7 不同剪切速率下脂肪酸對乳化液黏度的影響Fig. 7 Effect of different amounts of fatty acid added on viscosity of emulsions at different shear rates

由圖7可以看出，乳化液的黏度均明顯表現為5%油酸組＞3%油酸組＞1%油酸組＞空白組；由亞油酸組可以看出，剪切速率2～128 s－1的變化過程中，乳化液的黏度均明顯表現為5%亞油酸組＞3%亞油酸組＞1%亞油酸組＞空白組，之后隨著剪切速率的增加，亞油酸的添加量對乳化液的影響不大；由亞麻酸組可以看出，剪切速率在2～16 s－1的變化過程中，乳化液的黏度均明顯表現為5%亞麻酸組＞1%亞麻酸組＞3%亞麻酸組＞空白組，之后隨著剪切速率的增加，亞麻酸添加量對乳化液的影響不大。這說明在低剪切速率下，油酸、亞油酸和亞麻酸的添加量對乳化液黏度有一定影響，這可能是因為剪切速率過大，脂肪顆粒更小或脂肪細胞被破壞，脂肪顆粒總表面積增大，使得蛋白質不足以包圍所有脂肪顆粒，摩擦產生的熱量使得脂肪析出[33]，乳化液的黏度較低并且變化不明顯。

2.5 脂肪酸對乳化液Zeta電位的影響

圖8 脂肪酸對乳化液Zeta電位的影響Fig. 8 Effect of fatty acids on Zeta potential of emulsion

Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位，是膠體分散系穩定性的重要指標，廣泛用于描述膠體顆粒之間的靜電相互作用[37-38]。通常情況下，Zeta電位絕對值小于30 mV時，荷電粒子不穩定，容易聚集[37,39]。由圖8可以看出，乳化液的Zeta電位均是負值，并且Zeta電位的絕對值都小于30 mV，這說明此狀態下的乳化液不穩定，乳化液容易聚集[39]，同時也說明了測定乳化穩定性時出現容易分層現象的原因。由圖8可以看出，在添加了脂肪酸的乳化液中，Zeta電位的絕對值均為5%添加量＞3%添加量＞1%添加量，說明在這個范圍內，油酸、亞油酸和亞麻酸的添加量越多，乳化液中顆粒之間的相互作用或吸引力就會越強[37]。同時，油酸組Zeta電位絕對值均小于空白組，而且油酸組添加量之間和亞油酸添加量之間Zeta電位絕對值均差異顯著（P＜0.05）。此外，由圖8可以看出，同一添加量下，不同脂肪酸之間的Zeta電位也具有差異。其中，Zeta電位的絕對值均表現為亞麻酸組＞亞油酸組＞油酸組，Zeta電位值的這種差異可能是由脂肪酸極性頭部大小、脂肪酸所帶電荷、脂肪酸鏈在油水界面蛋白膜中堆積[40]導致。

3 結 論

通過提取豬肉肌肉鹽溶性蛋白，添加不同飽和程度且不同添加量C18脂肪酸（油酸、亞油酸和亞麻酸），經過均質得到不同狀態的乳化液。研究發現，脂肪酸的飽和程度和添加量對乳化液的乳化活性、乳化穩定性、化學鍵、微粒粒徑以及靜態流變等有著不同程度的影響。脂肪酸添加量越大，乳化液的乳化活性越強，而相同添加量下，脂肪酸的飽和程度對全肉鹽溶性蛋白起到較好的乳化作用，但添加量越大，乳化液的分層現象越嚴重，這可能是因為添加量越大乳化液越容易發生聚集和橋聯現象，同時也導致乳化微粒粒徑增大，乳化液剪切應力增大。