大豆分離蛋白超聲處理對其與木糖美拉德反應及產物乳化能力的影響

張志凱，肖軍霞，牟瑤瑤，黃國清*

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是以低溫脫脂大豆粕為原料生產的一種植物蛋白產品，主要由清蛋白和球蛋白組成，其中清蛋白約占5%、球蛋白約占90%[1]。SPI具有良好的乳化能力，是非常好的天然水包油型乳化穩定劑[2]，已在甜品、香腸、湯料等的生產加工中發揮重要作用。

改性是進一步拓展SPI應用范圍的重要措施。到目前為止，文獻已經報道了大量可用于SPI改性的方法，包括物理法、化學法、酶法等[3]。在物理法中，超聲處理已經引起了部分學者的關注，已被證實可使SPI的結構更加舒展并可顯著改善其溶解[4-6]、乳化[7-9]、流變[10]、凝膠[11-14]和感官[15]等多種功能性質。美拉德反應是另外一種非常有潛力的SPI改性方法，與麥芽糊精[16-17]、葡聚糖[18-19]、阿拉伯樹膠[20]、羧甲基纖維素鈉[21]、乳糖[22]等多糖發生美拉德反應后，SPI的乳化活性及其他功能性質均有顯著提高。

超聲處理可以加速SPI與多糖之間的美拉德反應并提高所得美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）的乳化性質。比如，王喜波等[23-24]利用超聲輔助SPI與葡聚糖之間的美拉德反應，所得MRPs的乳化活性及乳液的凍融穩定性均有了顯著的提高；穆利霞等[25]就超聲對加速SPI與多糖接枝反應的機理進行探討，發現超聲處理可顯著增加SPI肽鏈的伸展度、分子內部自由氨基的暴露程度及無規則卷曲的數量。

上述研究表明，超聲處理與美拉德反應結合可以顯著提高SPI的乳化活性及所得乳液的穩定性，但是目前鮮見關于SPI單獨經超聲處理后與還原糖的美拉德反應規律及所得MRPs乳化活性的報道。因此，本實驗先在一定功率下超聲處理SPI不同時間，然后使其與木糖（xylose，XYL）在濕熱條件下發生美拉德反應，研究SPI超聲處理對其與XYL美拉德反應及MRPs部分性質的影響，最后再對利用MRPs制備的乳液在不同食品加工條件下的穩定性進行研究。本實驗對于推動超聲處理在SPI生產、進一步拓展SPI的應用范圍具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 臨邑禹王植物蛋白有限公司；D-木糖 上海藍季生物有限公司；大豆油 益海糧油工業有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司；UV-2000紫外分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；分析天平、Delta320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）公司；90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠有限公司；LG10-2.4A高速離心機 北京醫用離心機廠；NicoleIR200傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科學儀器公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度分析儀英國馬爾文實驗設備公司；ZDG-0.25真空冷凍干燥機煙臺冰輪股份有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；FJ200-SH型數顯高速分散均質機 上海標本模型廠；F-2700熒光分光光度計天美（中國）科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

取5 份4.000 0 g SPI分別加入96.000 0 g蒸餾水，用恒溫磁力攪拌器充分攪拌得到質量濃度為4 g/100 mL的溶液，然后置于超聲清洗機中在25 ℃、16 000 Hz條件下分別處理20、40、60、80、100 min。預實驗發現，SPI與XYL在混合質量比4∶1、反應體系pH 8.0及水浴溫度90 ℃反應6 h后所得MRPs的溶解性最好，因此本實驗中的美拉德反應均在此條件下進行。超聲處理結束后，向各SPI溶液中分別加入1.000 0 g XYL，攪拌均勻，調節溶液pH 8.0，然后置于90 ℃水浴鍋內反應6 h，得到各種MRPs（記為SPI（Ult）-XYL-MRPs）。另外，將未經超聲處理的SPI與XYL按上述條件混合、溶解（所得混合物記為SPI-XYL-Mix）后在相同條件下反應得到美拉德反應產物（記為SPI-XYL-MRPs），作為實驗對照。

1.3.2 MRPs的表征

1.3.2.1 美拉德反應程度的測定

美拉德反應的中間產物在294 nm波長處具有特征吸收，最終產物在420 nm波長處具有特征吸收[26]，因此可通過檢測這兩個波長下的吸收揭示SPI與XYL的美拉德反應程度。

將SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYL-MRPs、SPIXYL-Mix于4 000 r/min離心20 min，收集上清液，用蒸餾水分別稀釋100 倍和15 倍后用紫外-可見分光光度計測定其在294 nm和420 nm波長處的吸光度。

1.3.2.2 紅外光譜分析

將各MRPs冷干后與KBr按質量比100∶1混合、研磨均勻，用壓片機壓制成均勻的薄片，將壓片置于紅外光譜儀在波數4 000～400 cm－1進行掃描分析，以空白KBr作為背景對照。

1.3.2.3 Zeta電位的測定

取SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYL-MRPs和SPIXYL-Mix各1 mL，加入9 mL蒸餾水稀釋，振蕩均勻后用激光粒度分析儀測定電位。

1.3.2.4 熒光分析

將SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYL-MRPs和SPIXYL-Mix凍干后準確稱取一定量的粉末，用10 mmol/L的pH 7.0磷酸緩沖液稀釋至SPI質量濃度為1 mg/mL。將稀釋液加入到熒光光度計的比色皿中，設置激發波長為334 nm，按5 nm/min的速率在350～500 nm范圍內掃描，測定熒光強度。

1.3.3 乳化性的測定

將SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYL-MRPs和SPI-XYL-Mix凍干，用0.1 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液溶解，使溶液中的SPI質量濃度達到1 mg/mL，然后按照體積比3∶1加入大豆油，于10 000 r/min高速攪拌5 min得到均勻的O/W乳狀液。

取1 mL上述乳狀液用蒸餾水稀釋5 倍，另取1 mL乳狀液與39 mL 1 g/L的SDS溶液混合均勻，以相同質量濃度的SDS溶液為空白，測定500 nm波長處的吸光度（A500nm），按式（1）計算乳化活性[27]：

式中：L為光路長度，此處為1 cm；N為稀釋倍數。

同時測定乳液在該時刻（T0）及放置10 min后在500 nm波長處的濁度（T10），按照式（2）計算乳化穩定性：

1.3.4 乳狀液穩定性的測定

選擇超聲處理時間20、40、80 min研究SPI超聲處理對SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液穩定性的影響。

1.3.4.1 對離子強度的穩定性

將1.3.1節中所得的SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYLMRPs和SPI-XYL-Mix溶液各取3 份，向溶液中加入大豆油，使大豆油的體積分數為25%，于10 000 r/min攪拌5 min得到均勻的O/W大豆油乳狀液，然后加入一定量的NaCl固體，使NaCl質量濃度分別達到0、0.15 mg/mL和0.20 mg/mL，將其置于4 ℃貯藏12 h，測定乳液的粒徑及分層指數。

1.3.4.2 熱穩定性

將1.3.1節中所得的SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYLMRPs和SPI-XYL-Mix溶液各取3 份，加入大豆油，使大豆油的體積分數為25%，于10 000 r/min高速攪拌5 min得到均勻的O/W大豆油乳狀液，分別在60、80、90 ℃加熱15min，降至室溫后測定乳液的粒徑及分層指數。

1.3.4.3 對鹽和加熱的協同穩定性

將1.3.1節中所得的SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYLMRPs和SPI-XYL-Mix溶液各取3 份，向溶液中加入大豆油，使大豆油的體積分數為25%，于10 000 r/min攪拌5 min得到均勻的O/W大豆油乳狀液，加入一定量的NaCl固體，使NaCl的質量濃度分別達到0、0.15 mg/mL和0.20 mg/mL，然后分別在60、80、90 ℃加熱15 min，降至室溫后測定乳液的粒徑及分層指數。

1.3.4.4 pH值穩定性

將1.3.1節中所得的SPI-XYL-MRPs、SPI（Ult）-XYLMRPs和SPI-XYL-Mix溶液各取3 份，向溶液中加入大豆油，使大豆油的體積分數為25%，于10 000 r/min攪拌5 min得到均勻的O/W大豆油乳狀液，用1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調節pH 3.0、4.5、7.0。將所得乳液置于4 ℃貯藏12 h，測定乳液的粒徑及分層指數。

1.3.4.5 乳狀液粒徑

當乳液發生聚集時粒徑會增大，因此其相對變化可以反映乳液對環境條件的穩定性。取0.5 mL乳狀液于玻璃試管中，用去離子水稀釋10 倍，然后用激光粒度儀測定乳狀液的粒徑。

1.3.4.6 乳狀液分層指數

將乳狀液進行靜置觀察，測量分層后底層清液的高度與總高度，根據式（3）計算分層指數[28]：

1.4 數據分析與分析

每個實驗重復3 次，結果以 ±s表示，采用SPSS 17.0（美國SPSS公司）進行統計分析。組間差異顯著性分析采用方差分析中的最小顯著性差異法測試，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SPI超聲處理對其與XYL美拉德反應的影響

圖1 SPI超聲處理時間對其與XYL美拉德反應的影響Fig. 1 Effect of ultrasonication time of SPI on its Maillard reaction with XYL

如圖1所示，MRPs溶液的A294nm和A420nm值均高于SPI與XYL的混合物溶液（SPI-XYL-Mix），表明兩者之間發生了美拉德反應。SPI超聲處理對其與XYL之間的美拉德反應有重要影響，且該影響與處理時間有關。當超聲處理時間為20 min和40 min時，所得MRPs溶液在294 nm和420 nm波長處的吸光度均高于SPI-XYL-Mix（但處理時間為20 min時差異不顯著）。這可能是由于SPI經超聲處理后更多的氨基暴露出來，同時溶解性增加，使得其與XYL的美拉德反應增強；當SPI的超聲處理時間延長至60 min時，所得MRPs溶液在2 個波長處的吸光度與40 min

時相比均顯著下降，但是隨著SPI超聲處理時間的進一步延長，吸光度又開始顯著增加。這可能是由于此時SPI的三級結構發生了更加劇烈的變化，該變化更加有利于SPI與XYL發生美拉德反應[25]。因此，SPI超聲處理可以增強其與XYL美拉德反應的程度。在隨后的研究中，選擇SPI超聲處理時間20、40、80 min進行進一步的研究。

2.2 MRPs的表征

2.2.1 紅外光譜檢測結果

圖2 SPI超聲處理對其與XYL形成的MRPs紅外光譜的影響Fig. 2 Effect of ultrasonication time of SPI on the FTIR pattern of MRPs

如圖2所示，醛基的特征吸收峰出現在3 750 cm－1處，此處各種SPI（Ult）-XYL-MRPs的強度大于SPI-XYLMRPs和SPI-XYL-Mix，證明SPI超聲處理可以促進含醛基中間產物的生成。1 560 cm－1處為C—N伸縮與N—H彎曲的吸收峰，SPI-XYL-MRPs在此處的強度要高于SPI-XYLMix，表明美拉德反應使得更多的—NH2暴露出來，SPI超聲處理使得該處的強度進一步增加，但是隨著超聲處理時間的延長，吸收強度逐漸降低，表明SPI與XYL之間發生了美拉德反應，且SPI超聲處理可以增強其與XYL之間的美拉德反應，這與圖1中的結果一致。

2.2.2 Zeta電位

由圖3可以看出，在選定的濃度下，SPI與XYL混合物（SPI-XYL-Mix）的Zeta電位僅為－13 mV；發生美拉德反應后，MRPs的Zeta電位仍為負值，但其絕對值提高到24.7 mV；SPI超聲處理進一步增加了相應MRPs的Zeta電位，但是不同處理時間之間沒有顯著的差異。這可能是美拉德反應產生了帶有負電荷的中間產物，同時超聲處理使得SPI中更多的羧基暴露出來，從而導致MRPs電位絕對值增加。MRPs電位絕對值在一定范圍內的提高可加強乳滴之間的靜電排斥作用，因此有望用于提高乳液的穩定性[29]。

圖3 SPI超聲處理時間對其與XYL所得MRPs Zeta電位的影響Fig. 3 Effect of ultrasonication time of SPI on the Zeta potential of MRPs

2.2.3 熒光特性

圖4 SPI超聲處理時間對其與XYL所得MRPs熒光特性的影響Fig. 4 Effect of ultrasonication time of SPI on the fluorescence characteristics of MRPs

由圖4可見，在激發波長為334 nm的情況下，超聲處理40 min后得到的MRPs的熒光強度最大，其次為80 min和20 min，再次為SPI-XYL-MRPs，SPI與XYL兩者的混合物的熒光強度最低。這表明，美拉德反應可以增強SPI的熒光強度，且SPI超聲處理可以進一步提高該參數，這與SPI與阿拉伯膠干熱處理后熒光強度降低的現象不一致[30]。這可能是由于超聲處理會使SPI結構更為舒展，使更內部更多熒光性基團暴露出來，同時美拉德反應還生成了新的熒光物質。超聲處理80 min時的熒光強度較40 min時低，這可能是由于長時間的超聲處理使SPI結構發生劇烈變化所致。

2.2.4 乳化活性

由圖5可以看出，美拉德反應可以顯著增強SPI的乳化活性。當未經超聲處理的SPI與XYL發生美拉德反應后（SPI-XYL-MRPs），其乳化活性與兩者的混合物（SPIXYL-Mix）相比增加了18.48%，這與大部分現有的報道一致[15,21]。SPI超聲處理進一步增強了所得MRPs的乳化活性。當處理時間為20 min和40 min時，所得MRPs的乳化活性分別為兩者混合物的1.59 倍和1.74 倍。但是當SPI超聲處理時間進一步延長時，所得MRPs的乳化活性又顯著下降，且與SPI-XYL-Mix之間無顯著差異。這可能是由于SPI的結構變化過于劇烈，削弱了其在油水兩界面的吸附作用，使得乳化活性略有降低。SPI超聲處理對其與XYL形成的MRPs的乳化穩定性沒有顯著影響。

圖5 SPI超聲處理時間對其與XYL所得MRPs乳化性能的影響Fig. 5 Effect of ultrasonication time of SPI on the emulsifying properties of MRPs

2.3 乳液穩定性

本實驗根據乳液粒徑的變化及分層指數[24]評價乳液在不同離子強度、溫度及pH值下的聚集特性及穩定性。

2.3.1 對離子強度的穩定性

圖6 SPI超聲處理對相應SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液離子強度穩定性的影響Fig. 6 Effect of SPI ultrasonication time on the stability of MRPs-stabilized emulsions at different ionic strengths

如圖6所示，隨著溶液中NaCl質量濃度的升高，SPIXYL-Mix穩定乳液的粒徑隨之增大，與未添加NaCl時相比，添加0.15 mg/mL和0.20 mg/mL NaCl后，乳液的粒徑分別增加了33%和91%，說明NaCl屏蔽了乳滴之間的靜電斥力，導致乳滴之間發生了聚集。SPI-XYL-MRPs穩定乳液的粒徑略低于SPI-XYL-Mix；當向乳液中添加兩個濃度的NaCl后，粒狀液的粒徑分別增加了94%和103%，變化幅度要高于SPI-XYL-Mix穩定乳液，表明乳液對離子強度的抗性有所減弱。

與SPI-XYL-MRPs相比，各種SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液的粒徑均有所提高，這可能是由于美拉德反應使得SPI分子質量變大所致。SPI超聲處理對乳液粒徑的變化有顯著影響，且該影響與超聲處理時間相關。當SPI超聲處理20 min時乳狀液在各NaCl溶液中的粒徑沒有顯著變化；當超聲處理時間延長至40 min和80 min時，所得乳液的粒徑隨NaCl質量濃度的升高顯著增加，與未添加NaCl時相比，兩種乳液在兩個NaCl質量濃度下的粒徑分別增加了31%、92%和35%、90%，表明此時乳液發生了聚集，但是與SPI-XYL-MRPs穩定乳液相比對離子誘導的聚集的抗性仍有所增強。

SPI-XYL-Mix穩定乳液的分層指數最高，美拉德反應顯著降低乳液在水溶液中的分層指數，但SPI是否進行超聲處理對該指數沒有顯著影響。乳液中添加NaCl后，乳狀液的分層指數均升高，表明NaCl能夠破壞乳滴使油析出。與SPI-XYL-MRPs相比，SPI超聲處理對乳液的分層指數沒有明顯的改善作用。

2.3.2 熱穩定性

圖7 SPI超聲處理對相應SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液熱穩定性的影響Fig. 7 Effect of SPI ultrasonication time on the thermal stability of MRPsstabilized emulsions

由圖7可以看出，所有乳液的粒徑均隨著貯藏溫度的升高而增加，表明高溫貯藏會引起乳液的聚集，這可能是由于高溫削弱了靜電斥力及增強了SPI分子之間的疏水性相互作用。美拉德反應顯著降低了乳液在高溫下的粒徑，但是與SPI-XYL-MRPs相比，對SPI進行超聲處理會引起相應乳液粒徑的增加，這與圖6的結果一致。當將乳液的貯藏溫度由60 ℃提高至80 ℃和90 ℃時，SPI-XYL-Mix穩定乳液的粒徑分別增加了24%和44%，SPI-XYL-MRPs穩定乳液的粒徑分別增加了16%和36%，說明美拉德反應可以削弱由環境溫度升高引起的乳液聚集；將SPI超聲處理20、40 min和80 min后，該增加值分別為5%、11%和3%、23%及13%、21%。因此，對SPI進行超聲處理可以進一步提高乳液對高溫貯藏的抗性。這可能是由于美拉德反應增強了MRPs的Zeta電位（圖3）從而使得相應乳液在高溫下仍可保持較強的靜電斥力所致。

SPI-XYL-MRPs和各種SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液在3 個選定溫度下的粒徑和分層指數均小于SPI-XYL-Mix，表明美拉德反應可以提高乳液的熱穩定性，但是SPI超聲處理對該指標沒有進一步的提升作用。

2.3.3 對溫度和離子強度的協同穩定性

圖8 SPI超聲處理對相應SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液熱和離子協同穩定性的影響Fig. 8 Effect of SPI ultrasonication time on the synergetic stability of MRPsstabilized emulsions under varying conditions of temperature and ionic strength

如圖8所示，當加入0.15 mg/mL的NaCl后，所有乳液的粒徑和分層指數均隨著貯藏溫度的升高而變大，乳狀液的穩定性逐漸變差；所有SPI-XYL-MRPs穩定乳液在所選條件下的粒徑和分層指數均小于SPI-XYL-Mix，表明美拉德反應可以顯著提高乳液在高溫高鹽條件下的穩定性，這與圖7的結果一致。

當將含0.15 mg/mL NaCl乳液的貯藏溫度由60 ℃提高至80 ℃和90 ℃時，SPI-XYL-Mix穩定乳液的粒徑分別增加了7%和13%，SPI-XYL-MRPs穩定乳液的粒徑分別增加了4%和25%；將SPI超聲處理20、40 min和80 min后，該增加值分別為3%、18%和5%、10%及16%、27%。這表明，對SPI進行適度的超聲處理可以提高乳液對高溫和高鹽貯藏環境的抗性。

與SPI-XYL-MRPs相比，SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液分層指數均有所增加，且在超聲處理時間為40 min時穩定性最差。因此，對SPI進行超聲處理并不能進一步提高相應乳液在鹽離子和高溫貯藏下的穩定性，這與圖6和圖7的結果一致。

2.3.4 pH值穩定性

SPI在等電點（pH 4.5）下乳化性差是影響其應用的重要因素之一[17]，本實驗也觀察到該現象。由圖9可知，所有乳液在pH 4.5下的粒徑最大，這是由于在等電點附近，SPI的溶解度降低；同時乳滴表面的電荷量較低，粒子間的靜電排斥力降弱，乳狀液發生絮凝或聚合，導致乳狀液失穩、粒徑變大。另外，所有乳液在pH 7.0下的粒徑最小，這是因為該pH值遠離SPI的等電點，因此乳液表面的電荷數量最大，靜電斥力更強，導致聚集現象最弱。美拉德反應顯著降低了乳液在所選pH值下的粒徑，表明該反應可以提高SPI在各pH值、尤其是等電點下的乳化能力，并可有效避免乳滴之間發生聚集。

圖9 SPI超聲處理對相應SPI（Ult）-XYL-MRPs穩定乳液pH值穩定性的影響Fig. 9 Effects of SPI ultrasonication time on the pH stability of MRPsstabilized emulsions

當將乳液的貯藏pH值由3.0提高至4.5～7.0時，SPI-XYL-Mix粒徑分別增加了4%，減小了35%，SPI-XYL-MRPs穩定乳液的粒徑分別增加了11%，減小了6%；將SPI超聲處理20、40 min和80 min后，該值分別增加2%、減小48%和增加5%、減小42%及增加31%、減小15%。因此，對SPI進行適度的超聲處理可以提高乳液對環境pH值變化的抗性，且該效應在pH值為7.0時尤為明顯。

與SPI-XYL-Mix相比，SPI-XYL-MRPs穩定乳液的分層指數明顯下降，但是對SPI進行超聲處理對該指標沒有進一步的促進作用。

3 結 論

本實驗先對SPI進行超聲處理，然后使其與XYL發生美拉德反應，并對所得MRPs的乳化活性及乳液穩定性進行研究。結果表明，對SPI進行超聲處理可以顯著促進其與XYL之間的美拉德反應；與未進行超聲處理的SPIXYL-MRPs相比，超聲處理顯著提高了相應MRPs的Zeta電位、熒光強度及乳化能力。與天然SPI相比，其經超聲處理后再與XYL發生美拉德反應顯著降低了相應MRPs穩定乳液在環境離子強度、加熱及pH值發生變化時的聚集程度，但是對乳液的分層情況沒有明顯的改善作用。