不同熱處理溫度下大豆11S球蛋白Zeta電位、粒徑和紅外光譜分析

齊寶坤，趙城彬，江連洲，徐 靚，李 紅，李 楊,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

大豆11S球蛋白是一種具有不均勻性的寡聚蛋白，由酸性多肽鏈（A亞基，分子質(zhì)量350～370 kDa）和堿性多肽鏈（B亞基，分子質(zhì)量約20 kDa）構(gòu)成[1]。酸性亞基和堿性亞基堆積形成2 個(gè)六元環(huán)結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)中空的扁圓柱體，以疏水性六聚體的形式存在，氫鍵和靜電作用對(duì)大豆11S球蛋白整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要的貢獻(xiàn)[2]。熱殺菌和噴霧干燥是大豆蛋白食品生產(chǎn)加工過程中常用的熱處理方法，這影響著大豆蛋白的穩(wěn)定性、乳化性和溶解性等功能性質(zhì)[3]。

目前，關(guān)于熱處理對(duì)大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)和溶解/聚集狀態(tài)影響的報(bào)道較多。Marcone等[4]利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）研究熱處理對(duì)大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，指出酰胺I帶1 635 cm－1處紅外光譜峰強(qiáng)度的增加表明大豆11S球蛋白在熱聚集過程中分子間維持β-折疊的氫鍵加強(qiáng)。Tezuka等[5]研究指出當(dāng)大豆11S球蛋白在100 ℃熱處理時(shí)，大部分球蛋白分子快速形成可溶性聚集體；繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間，可溶性聚集體越變?cè)酱螅詈笮纬沙恋怼ills等[6]利用核磁共振光譜研究熱處理過程中大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，表明當(dāng)加熱溫度升高至95 ℃時(shí)大豆11S球蛋白富含Gln和Glu殘基的高可變區(qū)中具有氫鍵結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu)消失。Zeta電位和平均粒徑表征蛋白質(zhì)的溶液穩(wěn)定性和聚集程度，同時(shí)能夠反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化[7]。Cruz-Torres等[8]對(duì)11S球蛋白的結(jié)構(gòu)及Zeta電位和流體動(dòng)力學(xué)半徑等理化性質(zhì)的研究表明，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和溶液性質(zhì)與其功能性質(zhì)密切相關(guān)。FTIR技術(shù)是結(jié)構(gòu)分析的重要工具，能夠分析蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵，是測(cè)定多肽和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的有效方法[9]。大豆11S球蛋白的大多數(shù)活性基團(tuán)包埋于緊密球狀分子內(nèi)部，這極大地限制了大豆蛋白在食品加工中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用加熱溫度80、90、100 ℃對(duì)大豆11S球蛋白進(jìn)行熱處理0～90 min，測(cè)定蛋白質(zhì)的Zeta電位和平均粒徑，同時(shí)對(duì)熱處理過程中的蛋白質(zhì)進(jìn)行紅外光譜分析，比較不同熱處理溫度條件下大豆11S球蛋白Zeta電位、平均粒徑和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為大豆蛋白功能性質(zhì)的改善及新產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)46） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；牛血清白蛋白、溴化鉀（分析純） 美國Sigma公司；Lowry法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD 5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；Allegra 64R低溫高速離心機(jī) 美國Beckman公司；AKTA-蛋白質(zhì)純化儀 美國GE公司；ZetaPALS-Zeta電位儀、ZetaPALS-激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司；MAGNAIR560 FTIR系統(tǒng) 美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

參照齊寶坤等[10]的處理方法。1.3.2 大豆11S球蛋白的熱處理

將大豆11S球蛋白分散于磷酸緩沖液中，室溫條件下磁力攪拌2 h，使蛋白質(zhì)最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。對(duì)大豆11S球蛋白溶液進(jìn)行熱處理，熱處理溫度為80～100 ℃，熱處理時(shí)間為10～90 min。考察熱處理對(duì)大豆11S球蛋白Zeta電位和粒徑分布的影響，同時(shí)進(jìn)行紅外光譜分析。

1.3.3 Zeta電位的測(cè)定

根據(jù)Crudden等[11]的測(cè)定方法，采用ZetaPlus Zeta電位儀測(cè)定大豆11S球蛋白溶液的Zeta電位。將11S球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，上樣體積為1 mL。Zeta電位測(cè)定條件：聚苯乙烯池（1 cm）若干，鉑電極（0.45 cm2，間距0.4 cm）一對(duì)。溫度為25 ℃，溫度平衡時(shí)間為2 min。

1.3.4 粒徑分布的測(cè)定

根據(jù)李楊等[12]的測(cè)定方法，采用ZetaPlus粒度分析儀測(cè)定大豆11S球蛋白的平均粒徑分布。將11S球蛋白樣品用磷酸緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液。過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜，室溫條件下進(jìn)行測(cè)量。

1.3.5 FTIR測(cè)定

根據(jù)Zhao Chengbin等[13]的方法測(cè)定大豆11S球蛋白樣品的FTIR。利用五氧化二磷對(duì)樣品進(jìn)行充分干燥，取干燥后的樣品1 mg，以質(zhì)量比1∶100的比例與溴化鉀混合、研磨，然后采用壓片機(jī)進(jìn)行壓片。在25 ℃條件下進(jìn)行4 000～400 cm－1的波數(shù)掃描，設(shè)置波數(shù)精度為0.01 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描次數(shù)為64 次。采用Peakfit軟件對(duì)FTIR圖譜進(jìn)行擬合，分析二級(jí)結(jié)構(gòu)類型和相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，作圖采用Origin 8.5軟件完成，采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的Zeta電位分析

Zeta電位是溶液中帶電微粒雙電層中剪切面的電勢(shì)，能夠反映膠體體系的穩(wěn)定性。當(dāng)Zeta電位絕對(duì)值較低時(shí)，體系內(nèi)的蛋白分子表面電荷較少，體系不穩(wěn)定，分子間容易相互靠近聚集形成沉淀；當(dāng)Zeta電位絕對(duì)值較高時(shí)，體系內(nèi)的蛋白分子表面電荷較多，可以通過靜電斥力維持體系穩(wěn)定，使蛋白分子間不易發(fā)生聚集[14]。Zeta電位不僅與蛋白質(zhì)表面電化性質(zhì)有關(guān)，而且還與體系溫度有關(guān)[15]。如圖1所示，與未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白相比，熱處理會(huì)使11S球蛋白的Zeta電位絕對(duì)值降低，這說明熱處理后蛋白表面電荷減少。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，80 ℃和90 ℃熱處理大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對(duì)值呈減小趨勢(shì)，這表明熱處理后蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的展開，疏水性氨基酸外露，使得蛋白質(zhì)表面電勢(shì)降低。然而，100 ℃熱處理大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對(duì)值呈先減小后增大的趨勢(shì)，這可能由于熱處理一方面使得大豆11S球蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的膨脹，使得球蛋白分子表面的靜電荷密度相對(duì)降低，11S球蛋白溶液的Zeta電位絕對(duì)值也隨之降低，多肽鏈間靜電相互作用增大，使得部分展開的多肽鏈互相靠近[16]；另一方面大豆11S球蛋白部分發(fā)生變性，分子結(jié)構(gòu)去折疊展開，疏水基團(tuán)暴露出來，它們之間通過疏水相互作用互相靠近。在靜電相互作用和疏水相互作用下，展開的多肽鏈間和暴露出來的疏水基團(tuán)間很容易在2 種作用力下形成聚集體，帶電氨基酸在聚集體表面重新排布[17]，使得Zeta電位絕對(duì)值又出現(xiàn)增大。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的Zeta電位Fig. 1 Zeta potential of 11S glycinin under different heat treatment conditions

2.2 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的平均粒徑分析

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的平均粒徑Fig. 2 Average particle size of 11S glycinin under different heat treatment conditions

在蛋白質(zhì)聚集過程中，常用蛋白質(zhì)的平均粒徑來表征蛋白的聚集程度，平均粒徑也能夠反映出蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的改變[18]。由圖2可知，與未經(jīng)熱處理的大豆11S球蛋白相比，熱處理后的11S球蛋白具有更大的平均粒徑，且高溫處理的蛋白粒徑進(jìn)一步增大，表明較高溫度的熱處理利于大尺寸聚集體的形成。

80 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶液在加熱0～30 min范圍內(nèi)平均粒徑顯著增大，由112.6 nm增加到321.5 nm，但30 min后平均粒徑變化較小。這是因?yàn)闊崽幚砥茐牧司S持蛋白質(zhì)的主要作用力如疏水作用、靜電作用、范德華力等，同時(shí)熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)加速蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，增加了蛋白質(zhì)碰撞幾率，蛋白質(zhì)分子聚集現(xiàn)象增加[19]，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分子平均粒徑的增大。在30 min后蛋白質(zhì)分子粒徑的變化較小可能是由于在此溫度下大豆11S球蛋白并未發(fā)生明顯的聚集行為。

90 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶液的平均粒徑隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，熱處理90 min后粒徑由112.6 nm增加到512.5 nm。100 ℃熱處理的大豆11S球蛋白分子平均粒徑在前20 min增幅較明顯，由112.6 nm增加到459.8 nm，但隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，聚集體粒徑變化較小。比較合理的解釋認(rèn)為在90 ℃和100 ℃熱處理?xiàng)l件下，高溫使11S球蛋白發(fā)生變性，酸性亞基和堿性亞基之間的二硫鍵發(fā)生斷裂，酸性亞基部分伸展，巰基暴露，經(jīng)過巰基/二硫鍵交換反應(yīng)解離出堿性亞基，通過二硫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用等將酸性亞基和堿性亞基結(jié)合形成可溶性聚集體[20]。在90 ℃熱處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)部分變性，形成的聚集體數(shù)量并不多，體系也沒有出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象。然而，100 ℃熱處理形成大量具有較大粒徑的聚集體導(dǎo)致溶液在加熱后變得混濁。100 ℃熱處理超過20 min后，蛋白質(zhì)已經(jīng)完全變性，熱聚集體已經(jīng)形成，蛋白分子的粒徑不會(huì)發(fā)生較大變化。

2.3 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的紅外光譜分析

FTIR是一種分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效方法，用于反映蛋白質(zhì)多肽鏈的構(gòu)象信息，尤其是二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。如圖3所示，對(duì)于大豆11S球蛋白而言，分子中的肽鍵是一種酰胺鍵，它在紅外光譜區(qū)有特征的光吸收峰。其中在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處吸收峰最強(qiáng)，主要是由C＝O的伸張振動(dòng)引起的，同時(shí)也與N—H的彎曲扭折和C＝N的伸縮振動(dòng)有關(guān)[22]。利用波段縮小技術(shù)將FTIR圖中的酰胺I帶細(xì)分，同時(shí)進(jìn)行高斯擬合處理，確定擬合圖譜中各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)類型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即1 610～1 640 cm－1為β-折疊，1 640～1 650 cm－1為無規(guī)卷曲，1 650～1 660 cm－1為α-螺旋，1 661～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角[23]，根據(jù)各峰積分面積計(jì)算大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息。

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白FTIR圖Fig. 3 FTIR spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Fig. 4 Secondary structure contents of 11S glycinin under different heat treatment conditions

由圖4A可知，對(duì)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的大豆11S球蛋白溶液來說，在整個(gè)80 ℃熱處理過程中，α-螺旋相對(duì)含量持續(xù)減少，而β-折疊相對(duì)含量持續(xù)增加。熱處理0～30 min β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量下降，無規(guī)卷曲相對(duì)含量升高，超過30 min后此變化趨勢(shì)相反。這說明80 ℃熱處理過程中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化可能相互抵消，而最終表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。陸彬等[24]通過FTIR研究熱變性引起白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，得到與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果。這種變化趨勢(shì)可能是由于80 ℃熱處理破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋，進(jìn)而通過分子間的相互作用重新形成β-折疊結(jié)構(gòu)[25-26]。

由圖4B可知，90 ℃熱處理2%的大豆11S球蛋白0～30 min會(huì)引起α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量的減少，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的增加，而無規(guī)卷曲相對(duì)含量變化不顯著。超過30 min熱處理，所有二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量沒有變化，表明90 ℃熱處理0～30 min發(fā)生α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。由圖4C可以看出，在100 ℃熱處理?xiàng)l件下，2%的大豆11S球蛋白溶液中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化速率顯著高于80 ℃和90 ℃熱處理，這可能與較高溫度條件下形成較大尺寸的熱聚集體有關(guān)（圖2）。100 ℃熱處理0～20 min會(huì)使α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，20～45 min各二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有相互轉(zhuǎn)化，而超過45 min后這種轉(zhuǎn)變進(jìn)一步加強(qiáng)。Moriyama等[27]研究指出，采用圓二色譜對(duì)牛血清蛋白進(jìn)行95 ℃熱處理，蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量隨溫度升高而降低，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量隨溫度升高而增加。Wang等[28]對(duì)大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，在20～60 ℃的低溫條件下熱處理時(shí)，大豆11S球蛋白的構(gòu)象幾乎未發(fā)生變化，但將熱處理溫度升高至90 ℃以上時(shí)，就出現(xiàn)了與本實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)果。發(fā)生這種二級(jí)結(jié)構(gòu)變化可能是由于在高溫?zé)崽幚項(xiàng)l件下，大豆11S球蛋白發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子去折疊展開，維持α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，使α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)遭到破壞[29]。被破壞的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，另一部分則形成了更為有序的結(jié)構(gòu)單元，這有利于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的形成[30]。

3 結(jié) 論

熱處理會(huì)改變大豆11S球蛋白的Zeta電位和平均粒徑。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，80 ℃和90 ℃熱處理?xiàng)l件下大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對(duì)值逐漸減小，平均粒徑顯著增大，超過30 min后粒徑變化較小。而100 ℃熱處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的Zeta電位絕對(duì)值呈先減小后增大的趨勢(shì)，平均粒徑逐漸增加。與80 ℃和90 ℃熱處理相比，100 ℃熱處理的Zeta電位絕對(duì)值變化更顯著，平均粒徑更大。紅外光譜分析表明，酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處吸收峰最強(qiáng)，擬合后得到大豆11S球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。對(duì)于2%的大豆11S球蛋白溶液，80 ℃熱處理過程中β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化可能相互抵消，而最終表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)；90 ℃熱處理0～30 min發(fā)生α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，超過30 min各二級(jí)結(jié)構(gòu)不再相互轉(zhuǎn)化；100 ℃熱處理0～20 min會(huì)使α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，20～45 min各二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有相互轉(zhuǎn)化，而超過45 min后這種轉(zhuǎn)變進(jìn)一步加強(qiáng)。