不同熱處理溫度下大豆11S球蛋白Zeta電位、粒徑和紅外光譜分析

齊寶坤，趙城彬，江連洲，徐 靚，李 紅，李 楊,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

大豆11S球蛋白是一種具有不均勻性的寡聚蛋白，由酸性多肽鏈（A亞基，分子質量350～370 kDa）和堿性多肽鏈（B亞基，分子質量約20 kDa）構成[1]。酸性亞基和堿性亞基堆積形成2 個六元環結構，形成一個中空的扁圓柱體，以疏水性六聚體的形式存在，氫鍵和靜電作用對大豆11S球蛋白整體結構的穩定具有重要的貢獻[2]。熱殺菌和噴霧干燥是大豆蛋白食品生產加工過程中常用的熱處理方法，這影響著大豆蛋白的穩定性、乳化性和溶解性等功能性質[3]。

目前，關于熱處理對大豆11S球蛋白結構和溶解/聚集狀態影響的報道較多。Marcone等[4]利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）研究熱處理對大豆11S球蛋白結構的影響，指出酰胺I帶1 635 cm－1處紅外光譜峰強度的增加表明大豆11S球蛋白在熱聚集過程中分子間維持β-折疊的氫鍵加強。Tezuka等[5]研究指出當大豆11S球蛋白在100 ℃熱處理時，大部分球蛋白分子快速形成可溶性聚集體；繼續延長加熱時間，可溶性聚集體越變越大，最后形成沉淀。Mills等[6]利用核磁共振光譜研究熱處理過程中大豆11S球蛋白二級結構的變化，表明當加熱溫度升高至95 ℃時大豆11S球蛋白富含Gln和Glu殘基的高可變區中具有氫鍵結構的α-螺旋結構消失。Zeta電位和平均粒徑表征蛋白質的溶液穩定性和聚集程度，同時能夠反映蛋白質分子結構變化[7]。Cruz-Torres等[8]對11S球蛋白的結構及Zeta電位和流體動力學半徑等理化性質的研究表明，蛋白質的結構和溶液性質與其功能性質密切相關。FTIR技術是結構分析的重要工具，能夠分析蛋白質分子內的氫鍵，是測定多肽和蛋白質二級結構的有效方法[9]。大豆11S球蛋白的大多數活性基團包埋于緊密球狀分子內部，這極大地限制了大豆蛋白在食品加工中的應用。本實驗采用加熱溫度80、90、100 ℃對大豆11S球蛋白進行熱處理0～90 min，測定蛋白質的Zeta電位和平均粒徑，同時對熱處理過程中的蛋白質進行紅外光譜分析，比較不同熱處理溫度條件下大豆11S球蛋白Zeta電位、平均粒徑和二級結構的變化規律，為大豆蛋白功能性質的改善及新產品的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農46） 東北農業大學大豆研究所；牛血清白蛋白、溴化鉀（分析純） 美國Sigma公司；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FD 5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；Allegra 64R低溫高速離心機 美國Beckman公司；AKTA-蛋白質純化儀 美國GE公司；ZetaPALS-Zeta電位儀、ZetaPALS-激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司；MAGNAIR560 FTIR系統 美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

參照齊寶坤等[10]的處理方法。1.3.2 大豆11S球蛋白的熱處理

將大豆11S球蛋白分散于磷酸緩沖液中，室溫條件下磁力攪拌2 h，使蛋白質最終質量分數為2%。對大豆11S球蛋白溶液進行熱處理，熱處理溫度為80～100 ℃，熱處理時間為10～90 min。考察熱處理對大豆11S球蛋白Zeta電位和粒徑分布的影響，同時進行紅外光譜分析。

1.3.3 Zeta電位的測定

根據Crudden等[11]的測定方法，采用ZetaPlus Zeta電位儀測定大豆11S球蛋白溶液的Zeta電位。將11S球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質量分數為0.2%，上樣體積為1 mL。Zeta電位測定條件：聚苯乙烯池（1 cm）若干，鉑電極（0.45 cm2，間距0.4 cm）一對。溫度為25 ℃，溫度平衡時間為2 min。

1.3.4 粒徑分布的測定

根據李楊等[12]的測定方法，采用ZetaPlus粒度分析儀測定大豆11S球蛋白的平均粒徑分布。將11S球蛋白樣品用磷酸緩沖液稀釋至蛋白質量分數為0.2%的溶液。過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜，室溫條件下進行測量。

1.3.5 FTIR測定

根據Zhao Chengbin等[13]的方法測定大豆11S球蛋白樣品的FTIR。利用五氧化二磷對樣品進行充分干燥，取干燥后的樣品1 mg，以質量比1∶100的比例與溴化鉀混合、研磨，然后采用壓片機進行壓片。在25 ℃條件下進行4 000～400 cm－1的波數掃描，設置波數精度為0.01 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描次數為64 次。采用Peakfit軟件對FTIR圖譜進行擬合，分析二級結構類型和相對含量。

1.4 數據統計分析

每組實驗進行3 次重復，作圖采用Origin 8.5軟件完成，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的Zeta電位分析

Zeta電位是溶液中帶電微粒雙電層中剪切面的電勢，能夠反映膠體體系的穩定性。當Zeta電位絕對值較低時，體系內的蛋白分子表面電荷較少，體系不穩定，分子間容易相互靠近聚集形成沉淀；當Zeta電位絕對值較高時，體系內的蛋白分子表面電荷較多，可以通過靜電斥力維持體系穩定，使蛋白分子間不易發生聚集[14]。Zeta電位不僅與蛋白質表面電化性質有關，而且還與體系溫度有關[15]。如圖1所示，與未經熱處理的大豆11S球蛋白相比，熱處理會使11S球蛋白的Zeta電位絕對值降低，這說明熱處理后蛋白表面電荷減少。隨著熱處理時間的延長，80 ℃和90 ℃熱處理大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對值呈減小趨勢，這表明熱處理后蛋白質分子結構發生一定程度的展開，疏水性氨基酸外露，使得蛋白質表面電勢降低。然而，100 ℃熱處理大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對值呈先減小后增大的趨勢，這可能由于熱處理一方面使得大豆11S球蛋白分子結構發生一定程度的膨脹，使得球蛋白分子表面的靜電荷密度相對降低，11S球蛋白溶液的Zeta電位絕對值也隨之降低，多肽鏈間靜電相互作用增大，使得部分展開的多肽鏈互相靠近[16]；另一方面大豆11S球蛋白部分發生變性，分子結構去折疊展開，疏水基團暴露出來，它們之間通過疏水相互作用互相靠近。在靜電相互作用和疏水相互作用下，展開的多肽鏈間和暴露出來的疏水基團間很容易在2 種作用力下形成聚集體，帶電氨基酸在聚集體表面重新排布[17]，使得Zeta電位絕對值又出現增大。

圖1 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的Zeta電位Fig. 1 Zeta potential of 11S glycinin under different heat treatment conditions

2.2 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的平均粒徑分析

圖2 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的平均粒徑Fig. 2 Average particle size of 11S glycinin under different heat treatment conditions

在蛋白質聚集過程中，常用蛋白質的平均粒徑來表征蛋白的聚集程度，平均粒徑也能夠反映出蛋白質空間構象的改變[18]。由圖2可知，與未經熱處理的大豆11S球蛋白相比，熱處理后的11S球蛋白具有更大的平均粒徑，且高溫處理的蛋白粒徑進一步增大，表明較高溫度的熱處理利于大尺寸聚集體的形成。

80 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶液在加熱0～30 min范圍內平均粒徑顯著增大，由112.6 nm增加到321.5 nm，但30 min后平均粒徑變化較小。這是因為熱處理破壞了維持蛋白質的主要作用力如疏水作用、靜電作用、范德華力等，同時熱處理時間的延長會加速蛋白質分子運動，增加了蛋白質碰撞幾率，蛋白質分子聚集現象增加[19]，表現為蛋白質分子平均粒徑的增大。在30 min后蛋白質分子粒徑的變化較小可能是由于在此溫度下大豆11S球蛋白并未發生明顯的聚集行為。

90 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶液的平均粒徑隨熱處理時間的延長逐漸增加，熱處理90 min后粒徑由112.6 nm增加到512.5 nm。100 ℃熱處理的大豆11S球蛋白分子平均粒徑在前20 min增幅較明顯，由112.6 nm增加到459.8 nm，但隨著加熱時間的延長，聚集體粒徑變化較小。比較合理的解釋認為在90 ℃和100 ℃熱處理條件下，高溫使11S球蛋白發生變性，酸性亞基和堿性亞基之間的二硫鍵發生斷裂，酸性亞基部分伸展，巰基暴露，經過巰基/二硫鍵交換反應解離出堿性亞基，通過二硫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用等將酸性亞基和堿性亞基結合形成可溶性聚集體[20]。在90 ℃熱處理條件下蛋白質部分變性，形成的聚集體數量并不多，體系也沒有出現絮凝現象。然而，100 ℃熱處理形成大量具有較大粒徑的聚集體導致溶液在加熱后變得混濁。100 ℃熱處理超過20 min后，蛋白質已經完全變性，熱聚集體已經形成，蛋白分子的粒徑不會發生較大變化。

2.3 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的紅外光譜分析

FTIR是一種分析蛋白質結構的有效方法，用于反映蛋白質多肽鏈的構象信息，尤其是二級結構[21]。如圖3所示，對于大豆11S球蛋白而言，分子中的肽鍵是一種酰胺鍵，它在紅外光譜區有特征的光吸收峰。其中在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處吸收峰最強，主要是由C＝O的伸張振動引起的，同時也與N—H的彎曲扭折和C＝N的伸縮振動有關[22]。利用波段縮小技術將FTIR圖中的酰胺I帶細分，同時進行高斯擬合處理，確定擬合圖譜中各子峰與二級結構類型的對應關系，即1 610～1 640 cm－1為β-折疊，1 640～1 650 cm－1為無規卷曲，1 650～1 660 cm－1為α-螺旋，1 661～1 700 cm－1為β-轉角[23]，根據各峰積分面積計算大豆11S球蛋白二級結構的定量信息。

圖3 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白FTIR圖Fig. 3 FTIR spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

圖4 不同熱處理條件下大豆11S球蛋白二級結構相對含量的變化Fig. 4 Secondary structure contents of 11S glycinin under different heat treatment conditions

由圖4A可知，對于質量分數為2%的大豆11S球蛋白溶液來說，在整個80 ℃熱處理過程中，α-螺旋相對含量持續減少，而β-折疊相對含量持續增加。熱處理0～30 min β-轉角相對含量下降，無規卷曲相對含量升高，超過30 min后此變化趨勢相反。這說明80 ℃熱處理過程中β-轉角和無規卷曲結構的轉化可能相互抵消，而最終表現為α-螺旋結構轉變為β-折疊結構。陸彬等[24]通過FTIR研究熱變性引起白蛋白二級結構的改變，得到與本實驗類似的結果。這種變化趨勢可能是由于80 ℃熱處理破壞了α-螺旋結構的氫鍵，使α-螺旋結構解旋，進而通過分子間的相互作用重新形成β-折疊結構[25-26]。

由圖4B可知，90 ℃熱處理2%的大豆11S球蛋白0～30 min會引起α-螺旋和β-折疊相對含量的減少，β-轉角相對含量的增加，而無規卷曲相對含量變化不顯著。超過30 min熱處理，所有二級結構相對含量沒有變化，表明90 ℃熱處理0～30 min發生α-螺旋和β-折疊結構向β-轉角結構轉變。由圖4C可以看出，在100 ℃熱處理條件下，2%的大豆11S球蛋白溶液中的蛋白質二級結構變化速率顯著高于80 ℃和90 ℃熱處理，這可能與較高溫度條件下形成較大尺寸的熱聚集體有關（圖2）。100 ℃熱處理0～20 min會使α-螺旋和β-折疊結構迅速轉變為β-轉角和無規卷曲結構，20～45 min各二級結構沒有相互轉化，而超過45 min后這種轉變進一步加強。Moriyama等[27]研究指出，采用圓二色譜對牛血清蛋白進行95 ℃熱處理，蛋白質中α-螺旋結構含量隨溫度升高而降低，無規卷曲結構含量隨溫度升高而增加。Wang等[28]對大豆11S球蛋白二級結構進行研究，在20～60 ℃的低溫條件下熱處理時，大豆11S球蛋白的構象幾乎未發生變化，但將熱處理溫度升高至90 ℃以上時，就出現了與本實驗相同的結果。發生這種二級結構變化可能是由于在高溫熱處理條件下，大豆11S球蛋白發生變性，蛋白質分子去折疊展開，維持α-螺旋和β-折疊結構的氫鍵斷裂，使α-螺旋和β-折疊結構遭到破壞[29]。被破壞的α-螺旋和β-折疊結構一部分轉變為無規卷曲結構，另一部分則形成了更為有序的結構單元，這有利于β-轉角結構的形成[30]。

3 結 論

熱處理會改變大豆11S球蛋白的Zeta電位和平均粒徑。隨著熱處理時間的延長，80 ℃和90 ℃熱處理條件下大豆11S球蛋白的Zeta電位絕對值逐漸減小，平均粒徑顯著增大，超過30 min后粒徑變化較小。而100 ℃熱處理條件下蛋白質的Zeta電位絕對值呈先減小后增大的趨勢，平均粒徑逐漸增加。與80 ℃和90 ℃熱處理相比，100 ℃熱處理的Zeta電位絕對值變化更顯著，平均粒徑更大。紅外光譜分析表明，酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）處吸收峰最強，擬合后得到大豆11S球蛋白的二級結構相對含量。對于2%的大豆11S球蛋白溶液，80 ℃熱處理過程中β-轉角和無規卷曲結構的轉化可能相互抵消，而最終表現為α-螺旋結構轉變為β-折疊結構；90 ℃熱處理0～30 min發生α-螺旋和β-折疊結構向β-轉角結構轉變，超過30 min各二級結構不再相互轉化；100 ℃熱處理0～20 min會使α-螺旋和β-折疊結構迅速轉變為β-轉角和無規卷曲結構，20～45 min各二級結構沒有相互轉化，而超過45 min后這種轉變進一步加強。