ZnO薄膜的sol-gel法制備及其對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能

段長平，劉連利，魏旭青，徐姝穎，李秋瑩，孫 彤,*，勵建榮,*

（1.生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；3.中核四〇四有限公司，甘肅 蘭州 730000；4.渤海大學實驗管理中心，遼寧 錦州 121013）

越來越多的研究顯示，人類生活中的細菌感染大部分是由生物被膜引起的，單純由游離菌導致的食物中毒并不多見[1-2]。因此在食品生產和貯藏過程中形成的生物被膜可能是引起食源性疾病的根本原因[3-5]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為革蘭氏陰性菌，是一種典型水產品優勢腐敗菌，它大量存在于水、土壤及高水分高蛋白食品中，可還原氧化三甲胺，并產生H2S。腐敗希瓦氏菌易黏附于材料表面，從而形成生物被膜[6-7]。由于生物被膜的黏附性遠高于游離菌，若食品加工環境受到生物被膜污染，將很難處理干凈且易留下污染源，進而腐蝕食品生產設備和包裝材料，使生產成本提高，威脅食品安全[3,8]。抑制生物被膜的方法很多，但在生產過程中加藥對食品安全的威脅顯而易見[9-11]。因此，研制有效抑制生物被膜形成及生長的材料將為解決食品生產中的微生物污染提供技術支持[12]。

微納米級ZnO作為廣泛使用的一種無機抗菌劑，具有良好的穩定性和安全性[13-15]。制備ZnO的方法主要有直接沉淀法[16-17]、水熱合成法[18-19]、溶膠-凝膠（sol-gel）法[20-21]、化學蒸汽沉積法[22]等。Asakuma等[21]采用提拉法將溶膠均勻涂于基片上，高溫退火處理后得到納米ZnO薄膜。sol-gel法制備的納米薄膜具有形貌均勻、可控、反應條件溫和、重復性好等特點。有研究表明，借助ZnO的抗菌性能，ZnO納米粒子具有顯著的抑制生物被膜性能[23-24]，故有望應用ZnO薄膜作為抑制生物被膜的形成和生長的材料。

降低水產品加工及貯藏過程中容器及設備表面生物被膜殘留能夠減少其對產品的影響及設備的破壞，本實驗采用sol-gel法于多孔鈦片表面制備納米ZnO薄膜，借助X射線衍射光譜（X-ray diffraction，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、選區電子衍射（selected area electron diffraction，SAED）等表征手段研究涂膜次數對ZnO薄膜微觀結構的影響。以水產品腐敗希瓦氏菌為作用對象，考察ZnO薄膜微觀結構對其生物被膜抑制性能的影響。研究結果可為制備對水產品優勢腐敗菌生物被膜具有抑制作用的薄膜材料提供技術和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：腐敗希瓦氏菌（S. putrefaciens，ATCC8071，美國微生物菌種保藏中心，實驗室保藏）；培養基：LB肉湯、LB營養瓊脂；試劑：結晶紫、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、戊二醛等均為分析純；高純鈦箔（99.99%，0.02 mm） 清河縣佳潤金屬材料有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultima IV型X射線粉末衍射儀 日本理學Rigaku公司；2000FT-IR型紅外分光光度計 美國Varian公司；S-4800型場發射SEM 日本日立公司；Jem-2100F型場發射TEM 日本電子株式會社；OCA15EC型接觸角測量儀北京東方德菲儀器有限公司；Victor X3酶標儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司；WU800角磨機 寶時得機械（中國）有限公司；SK8210HP超聲波清洗器、上?？茖С晝x器有限公司；DF-II集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省榮華儀器制造有限公司；MS605D直流穩壓電源 東莞市邁豪電子科技有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；LRH型系列生化培養箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多孔鈦片及ZnO薄膜的制備

1.3.1.1 陽極氧化法制備多孔鈦片

角磨機打磨鈦片至表面光滑，分別于丙酮、乙醇中超聲清洗10 min（40 Hz、200 W），烘干。在拋光液（V（HF）∶V（HNO3）=1∶3）中化學拋光60 s后于去離子水中超聲清洗10 min，烘干。以鈦片為陽極，石墨為陰極，電極間距4.0 cm，電壓14.0 V，0.4% HF電解液中陽極氧化60 min。去離子水、乙醇清洗，干燥，得孔徑約為50 nm的多孔鈦片，待用。

1.3.1.2 sol-gel法制備ZnO薄膜

室溫劇烈攪拌下，將50 mL 0.15 mol/L的NaOH-乙醇溶液迅速加入至50 mL 0.075 mol/L的乙酸鋅-乙醇溶液中，得混合溶液。多孔鈦片浸于沸騰的無水乙醇中1 h取出，于－0.08 MPa抽真空30 min后將其浸于上述混合溶液中，浸漬20 min后加熱至80 ℃，40 min后得藍色溶膠，取出多孔鈦片，水洗。100 ℃干燥2 h，得sol-gel涂膜1 次樣品。同條件下多孔鈦片sol-gel涂膜4 次后干燥，得另一樣品。收集同時制備的粉體，待用。

1.3.2 材料表征分析

采用X射線粉末衍射儀對同期制備粉體進行晶型分析，CuKα輻射，40 kV，50 mA，步寬0.02°，掃描速率4 °/min。利用KBr壓片法，采用2000FT-IR型紅外分光光度計測定ZnO薄膜剝離粉體的FTIR光譜，測試范圍4 000～400 cm－1，分辨率0.5 cm－1。采用S-4800型場發射SEM觀察樣品微觀形貌。采用Jem-2100F型場發射TEM測定剝離的多孔鈦片和ZnO薄膜的微觀形貌，并對其進行SAED分析。運用切線法，采用OCA15EC型接觸角測量儀測定樣品的水接觸角。

1.3.3 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能測定

取活化后OD595nm約為0.5的腐敗希瓦氏菌的菌懸液，以1∶200稀釋，取1 mL稀釋后菌液于無菌離心試管中，放入基片（0.5 cm×0.5 cm），28 ℃培養一定時間后取出。

1.3.3.1 材料表面生物被膜黏附性能測定

取上述基片于無菌離心試管中，用1 mL 0.9%生理鹽水清洗兩次以去除浮游菌，1 mL 1.0%結晶紫溶液中染色5 min后再用1 mL生理鹽水洗2 次去除浮色，加入體積分數33%冰乙酸溶液0.2 mL脫色10 min，移取脫色后溶液于96 孔板中，用Victor X3酶標儀測定OD595nm。

1.3.3.2 材料表面被膜菌生長曲線測定

取出菌懸液中培養一定時間后的基片，用無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加去離子水定容到1 L）沖洗3 次去除浮游菌，再將基片放入10 mL磷酸鹽緩沖液中，于53 kHz、25 ℃條件下超聲處理10 min，梯度稀釋所得菌懸液，采用平板計數法測定生物被膜上腐敗希瓦氏菌的菌落總數，繪制被膜菌生長曲線。

1.3.3.3 材料表面被膜微觀形貌觀察

菌懸液中培養一定時間后的基片用無菌水沖洗3 次，放入4 ℃預冷的2.5%戊二醛溶液中浸漬4 h，而后分別在30%、50%、70%、90%體積分數的乙醇溶液中浸泡30 min，在無水乙醇中浸泡1 h，取出后于超凈臺內自然風干。樣品噴金后，觀察其表面生物被膜的微觀形貌。

2 結果與分析

2.1 鈦片、多孔鈦片及ZnO薄膜的表征分析

2.1.1 XRD、FTIR分析

圖1 ZnO薄膜的XRD（a）、FTIR（b）圖Fig. 1 XRD patterns (a) and FTIR spectra (b) of ZnO films

ZnO的微結構影響ZnO薄膜的抗菌性。Shams等[25]發現納米粒子的形狀影響生物被膜的形成。Dutta等[26]發現ZnO的結晶狀態影響其抗菌性。與ZnO薄膜同時制備粉體的XRD表征結果表明，樣品為六角纖鋅礦結構ZnO晶體（JCPDS card No.36-1451），2θ角在31.77°、34.43°、36.26°、47.55°、56.61°、62.88°、67.97°、72.59°處的衍射峰分別對應ZnO晶體的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（112）、（004）晶面。由圖1a可見，衍射峰峰形不夠尖銳，半峰寬較寬，33.40°

和59.82°處有較弱的雜質峰，說明樣品結晶度較低，晶體粒徑較小且有少量中間產物存在。采用謝樂公式計算晶體平均粒徑為8.0 nm。

由剝離ZnO薄膜的FTIR圖（圖1b）可見，3 500～3 300 cm－1處的寬吸收峰和1 580 cm－1處的強吸收峰分別對應于—OH的伸縮振動和彎曲振動，表明樣品中含有結合水和毛細孔水。2 362 cm－1處的吸收峰是由于樣品吸附了空氣中CO2引起的。948 cm－1和835 cm－1處的吸收峰是Zn—OH—Zn和Zn—OH的伸縮振動吸收峰，469 cm－1處的吸收峰是Zn—O彎曲振動吸收峰。1 046 cm－1以及743、687 cm－1處的吸收峰為氫氧化鋅羥基（σ-OH）、（α-OH）的振動吸收峰[27]，1344～1395 cm－1處歸屬于ZnO表面羥基或橋聯羥基的伸縮和彎曲振動吸收峰，表明樣品中ZnO吸附了部分極性的—OH，且有少量含—OH的中間產物存在，與XRD分析結果一致。

2.1.2 材料表面微觀形貌分析

由圖2可見，鈦片表面有光滑的不規則筍狀突起，介于50～150 nm。鈦片經陽極氧化法處理后，表面形成孔徑約50 nm、深度約100 nm的TiO2多孔，排列均勻。經sol-gel 1 次涂膜的多孔鈦片表面有少量ZnO顆粒沉積于孔道頂端，相互聚集且分布不均勻，同時可見孔道內壁無ZnO顆粒沉積，ZnO薄膜約50 nm厚。經4 次涂膜后，ZnO附著量明顯增大，少量ZnO顆粒進入孔道內壁，大量ZnO顆粒延孔壁頂端沉積，TiO2孔基本被覆蓋，且ZnO顆粒呈多層堆積結構，“孔隙”增大。分析認為，醋酸鋅的乙醇溶液和NaOH混合后發生了水解，加熱至80 ℃后促進其水解反應的發生，使Zn—O—Znn縮聚形成凝膠，干燥處理后，凝膠中的ZnO結晶析出，得六方纖鋅礦型ZnO[28]。在溶膠涂膜過程中，由于在真空條件下將多孔鈦片浸漬于溶膠中，則會有部分溶膠進入孔中，脫水后沉積于孔的內壁。而由于真空度有限，孔中尚有很多空氣，阻滯溶膠的進入，故表現為大多數ZnO顆粒沉積于多孔鈦片表面。

圖2 鈦片及不同涂膜次數的ZnO薄膜SEM圖Fig. 2 SEM images of titanium sheet and ZnO films with different cycles of coating

圖3 多孔鈦片及涂膜4 次ZnO薄膜的TEM和SAED圖Fig. 3 TEM images and SAED patterns of titanium sheet and ZnO films with 4 cycles of coating

由圖3a、b可見，多孔鈦片的孔徑約為50 nm，孔壁厚約5 nm，排列規則，其SAED結果中可見銳鈦礦型TiO2（JCPDS card No.89-4921）的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）晶面，說明多孔鈦片表面為TiO2。這是由于陽極氧化過程中鈦片表面聚集的O2－與Ti4+形成氧化膜，在電場作用下膜層表面發生場致氧化和場致溶解，進而形成孔核，隨氧化時間延長最終形成多孔結構[29]。多孔鈦片經sol-gel涂覆4 次后的薄膜中ZnO顆粒粒徑約5～10 nm，部分進入TiO2孔中，部分于孔壁邊緣（圖3c），與SEM結果一致。其SAED結果中可見ZnO晶體（JCPDS card No.36-1451）的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）晶面（圖3d），說明樣品為六方纖鋅礦型ZnO，與XRD分析結果相符。

2.1.3 材料表面親疏水性表征

表1 鈦片及ZnO薄膜的水接觸角Table 1 Water contact angle of titanium sheet and zinc oxide films

由表1可見，鈦片表面呈親水性，而多孔鈦片表面呈疏水性，ZnO薄膜呈強親水性，且涂膜4 次ZnO薄膜的親水性更強。分析認為，由于鈦片表面并不平整，存在較多不規則突起，在一定程度上增大了其表面液體與氣體的接觸面所占比例，故其接觸角較小，呈親水性。而多孔鈦片在與水接觸時，水滴無法與基底直接接觸，而與納米孔及納米孔中的空氣接觸，液滴與氣體接觸面積占比較大，故表現出較好的疏水性。由于納米ZnO粒徑小，且顆粒表面有毛細孔水和表面吸附水，且存在含有—OH的中間產物，使其親水性增強。隨著沉積次數增加，薄膜表面沉積的ZnO增多，故其親水性更強，表現為其水接觸角減小。

2.2 材料表面生物被膜附著性能分析

2.2.1 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜黏附率及被膜菌生長曲線

由圖4可見，生物被膜開始培養至2 h，材料表面生物被膜黏附率及被膜菌增長較快，表明生物被膜從最初的可逆附著轉化為不可逆附著，經歷了生化作用階段和菌體附著階段。在2～24 h范圍內，被膜黏附率及被膜菌菌落總數增長較快，表明生物被膜進入生長期。在24～36 h范圍內，被膜黏附率增加緩慢，但被膜菌幾乎不變，表明生物被膜進入成熟期，被膜菌代謝處于平衡狀態，活菌數量不再增加，而基片表面附著的多糖和蛋白質及死亡菌體增多。36 h后，被膜黏附率和菌落總數開始下降，生物被膜進入衰退期。

圖4 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜的黏附率（a）及被膜菌生長曲線（b）Fig. 4 Adhesion rate (a) and total number (b) of live cells of S. putrefaciens biofilms on surfaces

在生物被膜生長的各個階段，鈦片表面的生物被膜黏附率和被膜菌數量均高于同期其他樣品，其次為多孔鈦片，而ZnO薄膜表面的生物被膜生長緩慢，且涂膜4 次樣品的抗生物被膜性能最優。鈦片表面無抗菌性物質，且具有親水性，故有利于生物被膜的附著和被膜菌的生長。而多孔鈦片表面形成了TiO2，且具有疏水性能，不利于生物被膜的早期黏附和被膜菌的生長。故其表面的生物被膜黏附率明顯低于同期的鈦片，而其表面的被膜菌數量僅略低于同期的鈦片，這是由于被膜黏附物質少，不能為被膜菌提供充足養分所致。多孔鈦片涂覆ZnO薄膜后的樣品表面雖然具有很強的親水性，有利于生物被膜的初期黏附，但由于ZnO具有較強的抗菌性能，其表面生物被膜黏附率和被膜菌數量均較鈦片和多孔鈦片有較大幅度降低，且涂膜4次樣品的抗生物被膜性能更優。ZnO納米粒子抗菌基于離子溶出機理，Zn2+溶出后進入生物被膜內，接觸菌體后與蛋白酶結合使之失去活性，進而使細菌死亡[15,30]。當被膜菌被殺死后，不再分泌被膜多糖等被膜黏附物，使生物被膜黏附率下降。同時，被膜黏附物質減少也不利于被膜菌的生長，使ZnO薄膜表面的被膜菌數量低于同期鈦片表面1～2 個數量級。由于涂膜4 次的ZnO薄膜厚度達50～100 nm，其ZnO顆粒的沉積量遠高于涂膜1 次的ZnO薄膜，故在生物被膜附著后，其Zn2+溶出較多，對被膜菌的殺菌能力更強，影響了被膜菌分泌生物被膜的黏附成分，表現為生物被膜的黏附率較低，同時可見，涂膜4 次的ZnO薄膜表面的被膜菌數量比涂膜1 次的ZnO薄膜低1 個數量級。

2.2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌表征

圖5 不同時間段鈦片及涂膜次數不同的ZnO薄膜表面生物被膜的SEM圖Fig. 5 SEM images of biofilms on titanium sheet and zinc oxide films with different cycles of coating at different incubation times

由圖5可見，在生物被膜培養至第2小時，材料表面形成少量黏附多糖及蛋白質膜，但未見菌落，表明生物被膜已黏附于材料表面，而被膜菌數量較少。培養至第12小時，各材料表面均可見黏附態生物被膜，且有形態完整的被膜菌（見圖中圈形標注），說明此時生物被膜進入生長階段。第36小時，材料表面的胞外多糖膜逐漸增厚，甚至有的將菌體包裹其中，說明生物膜進入成熟階段。第48小時，可見部分受損細胞及散落的黏附態物質，黏附多糖形成的連續膜部分脫落，說明此時已進入生物被膜的衰退期。比較同期的生物被膜微觀形貌，鈦片與多孔鈦片表面的生物被膜黏附物較多，ZnO表面的被膜黏附物和菌體數量較少，與材料表面生物被膜黏附率及被膜菌生長曲線的實驗結果一致。

3 結 論

鈦片陽極氧化處理后得到多孔鈦片，多孔鈦片表面經sol-gel法涂膜后得到六方纖鋅礦型ZnO薄膜，涂膜1 次的ZnO薄膜較薄，約50 nm，涂膜4 次后薄膜增厚至50～100 nm。薄膜中ZnO顆粒約5～10 nm，沉積于孔道頂端，相互聚集且分布不均勻。鈦片呈親水性，水產品腐敗希瓦氏菌生物被膜在其表面生長速率和附著量均較大；多孔鈦片呈疏水性，生物被膜在其表面的黏附率下降，但被膜菌生長未受到顯著抑制。ZnO薄膜呈較強親水性能，但由于ZnO具有殺菌性能，其對被膜黏附及被膜菌生長均有強抑制性能，且涂膜4 次所得ZnO薄膜對水產品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能最優。