基于拉曼光譜解析凍藏過程中魚糜蛋白的結構變化

高文宏，葉瑞森，潘廷跳，曾新安

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

冷凍魚糜是生產各類魚糜制品（魚香腸、魚丸、模擬蟹肉等）的原材料，是肌原纖維蛋白的濃縮物[1]。在冷凍過程中，受冰晶的機械破壞、結合水的脫離、細胞液的濃縮、次級鍵的新生和斷裂等因素的影響，蛋白質分子發生聚集和氨基酸多肽鏈逐漸展開，從而導致冷凍變性，蛋白質逐漸喪失生物活性[2-4]。隨著冷藏的不斷進行，魚糜蛋白物理化學性質發生變化[5]：蛋白鹽溶性、總巰基含量、Ca2+-ATP酶活性等呈現下降趨勢；而二硫鍵含量、羰基含量、表面疏水性等則呈現上升趨勢。現階段對于魚糜蛋白冷凍變性的研究，主要集中在物理化學性質變化方面，較少涉及到微觀分子結構水平，對變性的解釋多數停留在假設階段。為進一步探索蛋白質冷凍變性規律，有必要明確凍藏過程中蛋白質結構變化。

目前對蛋白質結構的研究主要采用圓二色譜、熒光光譜、核磁共振、紅外吸收光譜和拉曼光譜等技術。其中，拉曼光譜是一種包含分子振動、轉動及結構等信息的散射光譜，受水相干擾小，可以對固、液相樣品進行快速無損檢測[6-7]。該技術通過反射氨基酸或者肽鏈的不同種振動模式得到響應信號，能提供包含蛋白質分子二級結構和三級結構信息的光譜信息圖[8-9]。作為一種新興的研究手段，拉曼光譜技術已經被運用到監控肉類蛋白（如肌球蛋白）結構變化[10-11]。本實驗基于拉曼光譜檢測技術，對草魚魚糜進行光譜掃描并獲得拉曼“指紋譜”，重點討論魚糜蛋白特征峰區帶圖譜，解析魚糜蛋白結構變化信息，嘗試在分子層面評價魚糜蛋白冷凍變性；同時利用化學方法輔助驗證蛋白冷凍變性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚 市購；超微量Ca2+-ATP酶測試盒 南京建成生物工程研究所；實驗所用試劑均為分析純或生化級。

1.2 儀器與設備

YLS-86A食品加工機 中山市雅樂思電器實業有限公司；JW-3024HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；FJ-200高速分散均質機 上海標本模型廠；UV-1800紫外分光光度計 日本島津制作所；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HR Evolution拉曼光譜儀 美國HORIBA Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜樣品的制備

新鮮草魚去頭尾、鱗片以及內臟，用清水沖洗干凈，選取白肉放入食品加工機中絞碎，得到碎肉分別進行清水和（0.15%）鹽水漂洗（溫度10 ℃以下，每次攪拌5 min，靜置3 min）后用紗布進行脫水（水分質量分數控制在80%），得到新鮮魚糜定型于圓柱形鋁制模具（半徑2 cm，高1.5 cm），封口袋包裝后置于－18 ℃凍藏。整個加工過程用碎冰控制溫度。分別對新鮮魚糜樣品、凍藏2 周和凍藏8 周魚糜樣品進行數據采集。

1.3.2 鹽溶性蛋白含量的測定

參照楊利艷等[12]的方法，略作修改。2 g魚糜添加20 mL磷酸緩沖液（I=0.05，pH 7.5），充分勻漿30 s，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。重復上述步驟1 次。所得沉淀添加20 mL Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl-0.01 mol/L NaCO3-0.04 mol/L NaHCO3），充分勻漿30 s，置于4 ℃提取20 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液用雙縮脲法測定鹽溶性蛋白含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白液的提取

參照胡耀輝等[13]的方法，略作修改。2 g魚糜添加20 mmol/L Tris-maleate溶液（pH 7.0，內含0.05 mol/L KCl），充分勻漿30 s，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，棄去上清液。所得沉淀添加20 mmol/L Tris-maleate溶液（pH 7.0，內含0.5 mol/L KCl），充分勻漿30 s，置于4 ℃提取1 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液為肌原纖維蛋白液。

1.3.4 巰基含量的測定

參照張靜雅等[14]的方法，略作修改。肌原纖維蛋白液稀釋至4 mg/mL，取0.5 mL稀釋蛋白液加入4.5 mL 0.2 mol Tris-HCl緩沖液（內含8 mol脲素、2%十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L EDTA，pH 6.8），混勻后取出4 mL混合液加入0.4 mL 0.1%的5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），40 ℃水浴25 min，于波長412 nm處測定吸光度。空白組用0.6 mol/L KCl溶液代替。按下式計算巰基含量，以105g蛋白中含有巰基的物質的量計：

式中：A為波長412 nm處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為分子吸光系數13 600L/（mol·cm）；c為蛋白液質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 Ca2+-ATP酶活力測定

采用南京建成生物工程研究所超微量Ca2+-ATP酶測試盒測定，以每小時每毫克蛋白質產生無機磷的量（μmol/（mg·h））表示。

1.3.6 拉曼光譜掃描

將少量魚糜樣品平鋪在玻璃片上，置于載物臺上進行拉曼光譜掃描。采用氬離子激光器作為拉曼掃描光源，激光波長為633 nm，拉曼位移波數范圍為350～3 500 cm－1，采集時間為10 s，累積2 次。每個樣品取3 個點掃描，最終拉曼光譜曲線取3 次結果的平均值。采用拉曼設備配套軟件LabSpec 6對光譜進行基點校正并扣除熒光背底，以（1 004±2）cm－1（苯丙氨酸殘基在該峰位處保持穩定振動[15]）處峰位為內標進行歸一化。

1.4 數據處理

蛋白質二級結構定量通過Peakfit 4.12軟件進行峰的分離和曲線擬合，數據采用Origin 9.0軟件進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 草魚魚糜鹽溶性蛋白、巰基和Ca2＋-ATP酶活力的變化

圖1 草魚魚糜鹽溶性蛋白、巰基和Ca2＋-ATP酶活力變化Fig. 1 Changes in salt-soluble protein, sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity of grass carp surimi

在凍結和凍藏過程中，肌動球蛋白受大冰晶破壞以及蛋白水化層的消解等作用而發生冷凍變性，主要表現在蛋白桿部性質變化、鹽溶解性下降[16-17]。而肌動球蛋白是肌原纖維蛋白的重要組成部分，所以蛋白鹽溶性是反應魚糜蛋白冷凍變性的常用指標。同時隨著蛋白冷凍變性的不斷深入，蛋白分子之間生成疏水鍵和氫鍵等非共價鍵，生成超大的不溶性聚合體，鹽溶性蛋白含量減少[4]。由圖1可知，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周的魚糜鹽溶性蛋白含量分別為103.61、66.83 mg/g和57.66 mg/g，凍藏2 周和凍藏8周分別下降了35.50%和44.35%。可見，凍藏前2 周造成鹽溶性蛋白含量大幅下降（36.78 mg/g），后2～8 周又持續小幅下降了9.17 mg/g。

巰基含量的減少也是魚糜蛋白冷凍變性的重要體現。隨著凍藏時間的延長，巰基含量從新鮮魚糜的5.79 mol/105g下降到第2周的3.30 mol/105g，至凍藏8 周結束，巰基含量為1.74 mol/105g，下降幅度達69.95%。蛋白分子的聚集和變性引起巰基的暴露，使得巰基逐漸被氧化成二硫鍵，從而進一步改變蛋白分子的空間構型，加劇蛋白的冷凍變性。同時，在肌球蛋白活躍區域的巰基與Ca2＋-ATP酶活力密切相關[18]。

Ca2＋-ATP酶活力是反映肌球蛋白完整的主要探針，在一定程度上反映了蛋白的冷凍變性，其活性越高，說明蛋白品質越高[19-20]。Ca2＋-ATP酶活力在凍藏過程中不斷下降，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周分別為0.60、0.44、0.13 μmol/（mg·h），凍藏2 周和凍藏8 周的下降幅度分別達到26.67%和78.33%。

2.2 草魚魚糜蛋白拉曼光譜圖

圖2 草魚魚糜蛋白拉曼圖譜Fig. 2 Raman spectra of grass carp surimi proteins

如圖2所示，魚糜蛋白空間構象與氨基酸殘基微環境的變化主要集中在500～1 800 cm－1（指紋圖譜區）和2 800～3 050 cm－1（C—H伸縮振動區）體現。通過對比魚糜樣品在上述2 個重要拉曼譜帶的特征峰峰位和相對峰強度信息，可以解釋凍藏對草魚魚糜蛋白結構變化的具體影響。魚糜蛋白拉曼光譜區帶的指認[10-11,15,21]，如表1所示。

表1 草魚魚糜蛋白拉曼光譜中譜帶歸屬Table 1 Tentative assignment of selected bands in the Raman spectra of grass carp surimi proteins

2.3 蛋白質主鏈構象

圖3 草魚魚糜蛋白酰胺III區拉曼圖譜Fig. 3 Raman spectra in amide III region of grass carp surimi proteins

拉曼特征光譜中酰胺III區（1 230～1 350 cm－1）是構象靈敏的譜帶區。該譜帶區域能提供多肽鏈主鏈構象的振動信息[21]，包括C—N伸縮振動、N—H面內彎曲振動、Cα—C伸縮振動以及C＝O面內彎曲振動。另外，圖譜中蛋白二級結構中的α-螺旋結構、多種形式的C—H彎曲振動以及芳香環的振動信息也反映了碳骨架的主鏈構象。

如圖3所示，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周的魚糜蛋白拉曼峰分別出現在1 320、1 320、1 315 cm－1處，相對峰強為0.949 7、0.960 7、0.902 4。凍藏前2 周，該處拉曼峰峰位置未出現變化。而隨著凍藏時間繼續延長，魚糜蛋白在酰胺III區的拉曼峰逐漸向小波數方向偏移。至8 周凍藏期結束，拉曼峰位偏移了5 cm－1，整體峰強的減小，說明魚糜蛋白中α-螺旋結構減少。但凍藏2 周魚糜樣品的拉曼峰峰強有所上升，尚未得到很好的解釋。魚糜蛋白二級結構中β-折疊譜帶（1 230～1 245 cm－1）和無規卷曲譜帶（1 240～1 255 cm－1）部分重疊，使得酰胺III區的解析相對困難。凍藏2 周以及凍藏8 周相比新鮮魚糜蛋白，在1 250 cm－1附近中均形成了拐角，峰形坡度有所減緩，并且凍藏8 周的減緩趨勢更加明顯。有研究表明[11]，在1 250 cm－1和1 315 cm－1附近形成的譜帶分別是由肌球蛋白的球形結構和纖維狀結構的頭部和尾部區域的α-螺旋結構引起的。蛋白質分子的冷凍變性、巰基的氧化、水分子-蛋白質分子間氫鍵的變化，造成了蛋白質原有的二級結構和空間構象的破壞。

碳鏈骨架中C—C伸縮振動能引起940 cm－1（圖3）附近拉曼峰的變化，是α-螺旋結構在拉曼光譜上的另一個重要體現。該峰的相對強度從新鮮狀態的0.931 8下降到凍藏8 周后的0.891 3，相對強度下降幅度達到了4.37%。蛋白質α-螺旋結構的破壞并逐步向β-折疊和無規卷曲的轉變，導致了該區段譜帶信號減弱。

2.4 二級結構定量結果

酰胺I區（1 600～1 700 cm－1）對蛋白質二級結構的解析提供了更加豐富的信息。這個譜帶區域不僅含有C＝O伸縮振動的信息，還提供了多肽鏈基團內部的C—N伸縮振動、Cα—C—N彎曲振動以及N—H面內彎曲振動的信息[22]。魚糜蛋白的二級結構對其的加工特性影響顯著[23]：α-螺旋結構的含量與加工中的凝膠強度密切相關；β-折疊結構則提供了魚糜凝膠的硬度；β-轉角和無規卷曲結構則不能促使生成有序的凝膠網狀結構。一些拉曼光譜和紅外光譜的蛋白質解析工作發現[24-25]，酰胺I區的譜帶信息與蛋白質主鏈構象和二級結構的定量相關。多肽鏈分子的天然構象決定了肽鏈-肽鏈分子間的氫鍵易改變，造成了酰胺I區的圖譜信息的改變。

蛋白質中二級結構含量的不同，會影響其在酰胺I區的峰形[9,26-27]：α-螺旋結構含量高的蛋白在該譜段的峰會集中在1 645～1 657 cm－1之間，β-折疊結構含量高的會集中在1 665～1 680 cm－1之間，而1 660 cm－1之間附近的拉曼峰則預示蛋白質無規卷曲結構含量高。代表蛋白不同二級結構的拉曼峰存在一定程度的峰位重疊的現象，造成了各二級結構定量上的困難。實驗中通過去卷積、求二階導和曲線擬合的方法對拉曼峰進行分峰處理，得到單個峰位信息。

圖4 草魚魚糜蛋白酰胺I區分峰和迭代擬合曲線Fig. 4 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands in amide I region of grass carp surimi proteins

圖5 草魚魚糜蛋白酰胺I區二級結構相對含量Fig. 5 Secondary structure contents from amide I band region of grass carp surimi proteins

通過Peakfit 4.12軟件對酰胺I區進行峰分離和曲線迭代擬合處理得到圖4，然后對比不同二級結構對應的峰的峰面積[27-28]，計算出草魚魚糜蛋白二級結構的相對含量，如圖5所示。新鮮的魚糜與凍藏2 周和8 周的魚糜相比，α-螺旋含量逐步下降，由新鮮時相對含量34.31%下降到凍藏第2周的22.18%，至凍藏第8周時，α-螺旋相對含量下降到15.33%。可以看出，α-螺旋在凍藏初期（2 周內）劇烈下降，降幅達到12.13%，接下來6 周凍藏降幅為6.85%，下降速率減慢。新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周β-折疊相對含量分別為22.68%、24.33%和21.57%。凍藏過程中，β-折疊相對含量先略微升高后又下降，這可能是由于凍藏初期蛋白分子內或分子間的氫鍵作用力增強，引起β-折疊相對含量升高，而凍藏后期蛋白持續變性又引起氫鍵的變化。無規卷曲的相對含量持續增加，由新鮮魚糜的13.47%上升到凍藏8 周的30.89%，而β-轉角相對含量的變化不明顯。

2.5 酪氨酸和色氨酸殘基微環境

2.5.1 酪氨酸殘基

圖6 草魚魚糜蛋白氨基酸殘基微環境拉曼圖譜Fig. 6 Raman spectra of amino residue microenvironments from grass carp surimi proteins

酪氨酸殘基上對位取代苯環的振動能在830 cm－1和850 cm－1附近形成費米共振雙峰，此雙峰與基團所處的微環境和酚羥基間的氫鍵作用力有關[29]，I850/I830反映酪氨酸殘基處于“包埋”或者“暴露”狀態，是監控酪氨酸殘基微環境的有效探針。當I850/I830值介于0.7～1.0時，酪氨酸殘基處于“包埋”狀態，表明酪氨酸疏水性基團相互聚集，形成疏水核并被埋藏在多肽鏈內部；當I850/I830值低于0.3，表明酪氨酸殘基中存在強的氫鍵作用力；當I850/I830值大于1.0時，表明酪氨酸殘基暴露在水相或者極性的微環境中。新鮮、凍藏2 周和凍藏8 周魚糜樣品的I850/I830值分別為1.81、1.89和1.99，如圖6所示，草魚制成魚糜樣品后酪氨酸已經處于極性的水相微環境。這可能與加工過程中漂洗步驟有關，低溫清水和鹽水的漂洗使魚糜蛋白處于極性的水相環境中，疏水核受水相環境的影響逐漸打開，由“包埋”向“暴露”狀態的轉變。隨著凍藏的深入，冷凍造成的蛋白結構的改變使酪氨酸更加暴露在多肽鏈表面，魚糜樣品的I850/I830值上升。

2.5.2 色氨酸殘基

拉曼光譜中757 cm－1和1 340 cm－1附近區域能表征色氨酸殘基的微環境，I757下降（圖6）以及I1340下降（圖3）都反映了色氨酸殘基的暴露[21,30]。凍藏能引起I1340強度的下降，新鮮、凍藏2 周和凍藏8 周該值分別為0.869 0、0.872 1和0.758 9，說明8 周凍藏使色氨酸殘基從包埋的疏水性環境中暴露到極性環境。I757先由新鮮的0.275 1降至第2周的0.231 1，也印證了色氨酸殘基的暴露，但是該值在凍藏8 周沒有持續下降，反而升至0.261 7。這可能是757 cm－1附近色氨酸殘基微環境譜帶與755 cm－1附近的脂肪族氨基酸殘基振動譜帶相互重疊造成的。

2.6 二硫鍵的變化

圖7 草魚魚糜蛋白二硫鍵伸縮振動拉曼圖譜Fig. 7 Raman spectra of the stretching vibrations of disulfide bonds from grass carp surimi proteins

二硫鍵的特征振動譜帶在500～550 cm－1附近，并且與分子內部和分子間的巰基/二硫鍵相互轉化有關。此譜帶的巰基/二硫鍵高密度區域能形成多種形式的非網狀交聯結構。在525 cm－1和545 cm－1附近的振動分別為二硫鍵扭式-扭式-反式和反式-扭式-反式構象形式[9,26]。由圖7可以看出，新鮮魚糜蛋白的在548 cm－1處出現拉曼峰，這表明未經凍藏的魚糜蛋白二硫鍵主要為反式-扭式-反式構象。凍藏2 周后二硫鍵的拉曼峰向小波數（扭式-扭式-反式構象譜帶）移動至539 cm－1處，至凍藏8 周結束，拉曼峰移動至538 cm－1處。峰位的變化可能是由于部分二硫鍵的構象在凍藏初期（2 周內）由反式-扭式-反式向扭式-扭式-反式的轉變，凍藏2～8 周基本維持不變。隨著凍藏的深入，二硫鍵構象持續變化不大。

2.7 芳香族氨基酸C—H伸縮振動

芳香族氨基酸、多肽和蛋白質的C—H伸縮振動會在2 900 cm－1附近形成強烈的譜帶。拉曼圖譜中2 933 cm－1處形成尖峰，這是由CH3的對稱伸縮振動或者CH2非對稱伸縮振動引起的，而在2 874 cm－1附近形成的次峰則是由CH2非對稱伸縮振動引起的[21]。C—H伸縮振動形成的拉曼峰峰強的變化可能與羥基鏈在極性環境中暴露有關。另有研究[22]猜測α-螺旋結構的展開使得芳香族氨基酸暴露，造成脂肪族氨基酸的C—H基團間的疏水作用力增強。同時，C—H伸縮振動拉曼峰的長寬比與蛋白質的疏水性和功能特性（如乳化性）有關[31]。

圖8 草魚魚糜蛋白芳香氨基酸C—H伸縮振動拉曼圖譜Fig. 8 Raman spectra of C—H stretching vibrations of aromatic amino acid from grass carp surimi proteins

如圖8所示，經過8 周的凍藏，I2874和I2933從新鮮的1.908 1和3.868 7分別下降到1.721 5和3.352 6，降幅達到9.78%和13.34%。在魚糜凍藏期間，由于肌原纖維蛋白的冷凍變性，造成蛋白質主鏈構象的變化以及多肽鏈展開，促使芳香族氨基酸側鏈不斷暴露，形成疏水相互作用力，進而又導致蛋白質二級和三級結構不斷變化，蛋白質逐步喪失其功能特性。

3 結 論

草魚魚糜拉曼光譜中酰胺III區和940 cm－1峰形和峰強有效提供魚糜蛋白主鏈構象信息，凍藏過程中魚糜蛋白α-螺旋結構減少，蛋白構象由有序向無序逐漸轉變；且酰胺I區分峰、曲線擬合計算進一步說明這種無序化與無規卷曲的相對含量增加有關。I757、I1340和I850/I830變化，色氨酸和酪氨酸殘基暴露程度逐漸加深。表征二硫鍵構象的拉曼峰向小波數方向移動，凍藏可能造成部分二硫鍵由反式-扭式-反式構象向扭式-扭式-反式構象轉變；C—H伸縮振動峰I2933的減弱，芳香族氨基酸疏水相互作用力增強。另一方面，本實驗通過對不同凍藏期草魚魚糜化學指標的檢測，驗證凍藏引起魚糜蛋白的冷凍變性。綜上，拉曼光譜技術能夠有效評價冷藏對魚糜蛋白結構的影響，是利用化學特性評價冷凍魚糜蛋白體系的另一重要補充，從蛋白結構和化學鍵變化等方面更加微觀具體地評價冷凍變性。