傳統魚露發酵過程中細菌群落演替及對其揮發性風味形成的影響分析

李春生，王悅齊，李來好*，陳勝軍，吳燕燕，胡 曉，榮 輝

（中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300）

魚露也稱“魚醬油”，是一種以低值魚類或水產品加工副產物為原料，經過天然發酵制得的風味獨特的調味品。魚露色澤呈琥珀色，味道鮮美，富含牛磺酸、人體必需氨基酸、有機酸、微量元素等營養成分，備受人們的青睞。傳統魚露作為一種天然發酵產品，發酵周期長達10—18 個月，其發酵過程是以蛋白質、脂質和糖類等營養物質為基質，在微生物和酶的作用下發生以營養物質分解為主體的一系列復雜代謝活動，逐漸產生醛、酮、醇、酯等化合物[1-2]，從而形成魚露獨特的風味。

微生物是傳統魚露風味形成不可或缺的因素，明確傳統魚露發酵過程中復雜微生物群落結構對于揭示魚露風味形成機制具有重要作用，是實現傳統魚露產業技術提升的重要環節。目前，國內外學者主要利用純培養方式對魚露中的微生物進行探索，在具有特定活性微生物篩選方面已取得了大量成果，如從魚露發酵液中分離高產蛋白酶活性的Virgibacillus sp. SK33[3]、Bacillus subtilis CN2[4]、Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7[5]等，分離具有高效生物胺降解活性的Halomonas shantousis SWA25[6]、Staphylococcus carnosus FS19[7]等。然而，自然界中微生物群落及其棲息的環境遠比人們預期的復雜和多樣，通過純培養技術在實驗室所獲取的微生物僅占環境微生物總量的1%左右，這使得傳統純培養方法在魚露微生物研究上存在局限性，無法全面揭示魚露中微生物的真實狀況。隨著分子生物學技術的發展，基于高通量測序技術的非培養方法為全面真實地了解環境中微生物群落結構提供了可能，此方法直接從環境中提取微生物群體基因組DNA，通過對微生物rRNA基因的若干可變區進行序列測定，可全面真實地反映環境樣品中微生物的種類和豐度。近年來，高通量測序技術已在豆醬[8]、蝦醬[9]、糯米酒[10]、干酪[11]等多種發酵食品微生物群落結構研究上進行了應用。然而，目前關于我國傳統魚露發酵過程中微生物群落結構的研究鮮見報道。

鑒于此，本研究采用Illumina MiSeq平臺對不同發酵時間下魚露細菌的16S rRNA基因進行高通量測序，分析魚露發酵過程細菌群落結構及多樣性變化規律，采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術研究魚露發酵過程中的揮發性風味成分，并利用Pearson相關性分析方法研究細菌群落結構對傳統魚露揮發性風味形成的影響規律，這對于揭示魚露風味的形成機制以及優化傳統魚露的發酵工藝具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚露采自于廣東省魚露生產廠家，根據傳統生產工藝，按照30%的用鹽量將鳀魚和食鹽進行混合，在的發酵池中進行發酵，取發酵時間為0、1、3、6、12 個月的魚露發酵液，用定性濾紙過濾，收集濾液保存于－80 ℃冰箱待測。

細菌基因組DNA提取試劑盒 美國Omega科技公司；AMPure XP beads核酸純化試劑盒 美國Beckman公司；2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）標準品 日本TCI公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司；GCMSQP2010 plus GC-MS聯用儀 日本島津公司；65 μm DVB-PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 魚露發酵過程細菌群落結構分析

參照文獻[12]方法。采用美國Omega科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）提取魚露發酵液中細菌的基因組DNA。設計細菌的16S rRNA基因序列V4片段擴增的通用引物：515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。聚合酶鏈式反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環；72 ℃延伸7 min。使用AMPure XP beads核酸純化試劑盒純化擴增產物，利用Illumina MiSeq PE250進行雙末端測序。

1.3.2 靜態頂空固相微萃取揮發性物質

參照文獻[13]方法。將5.0 g過濾后的魚露樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，加入2 μL內標物TMP溶液（1 000 mg/L），封閉瓶口后插入已老化好的萃取頭，置于溫度為60 ℃的磁力攪拌臺上，吸附40 min，再插入GC-MS進樣口進行解吸，進樣口溫度250 ℃，解吸5 min，重復測定3 次。為防止樣品間交叉污染，連續進樣的萃取頭需要在270 ℃的條件下老化10 min。

1.3.3 揮發性風味成分的GC-MS檢測條件

色譜柱為CD-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min，采用恒線速率，分流比1∶20，進樣量1 μL。升溫程序：起始溫度35 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫到60 ℃保持1 min，再以6 ℃/min上升到140 ℃保持1 min，最后以8 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min。離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍m/z 35～350，無溶劑切除時間。

1.4 數據分析

1.4.1 Illumina MiSeq PE250測序結果分析

原始的測序數據經過濾處理獲得Clean Data，然后利用FLASH（v1.2.11）軟件將雙末端測序得到的成對reads進行組裝，得到高變區的Tags。利用USEARCH（v7.0.1090）軟件將組裝好的Tags在97%相似度條件下進行聚類，得到用于物種分類的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）序列。利用RDP classifer（v2.2）軟件將OTU序列與數據庫進行比對，獲得物種注釋。根據每個物種在每個樣品的相對豐度進行物種熱圖分析。利用mothur（v1.31.2）軟件計算樣品的α多樣性值，包括observed species指數、Chao指數、ACE指數、Shannon指數及Simpson指數。利用QIIME（v1.80）軟件計算不同樣品間的β多樣性值，包括Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweighted UniFrac等。

1.4.2 揮發性風味化合物定量分析

利用Xcalibur軟件對揮發性風味化合物進行鑒定。利用計算機檢索各化合物，與WILEY和NIST 05a. L譜庫數據庫相匹配，僅報道正反匹配度均大于800的結果。

各揮發性風味化合物的絕對含量按照待測揮發物與內標物TMP的峰面積之比求得其絕對含量，計算公式如下：

式中：P為正己醛與內標物TMP的峰面積之比；N為內標物TMP的質量/μg；M為稱取的魚露樣品質量/g。

1.4.3 相關性分析

利用SPSS 19.0分析軟件中的z-score標準化法對原始數據進行線性變換，將結果映射在一定的區間范圍，導出標準化后的變量，然后利用Pearson相關性分析對標準化后變量之間的相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 Illumina MiSeq PE250測序數據統計

利用16S rRNA測序技術研究不同發酵時間下傳統魚露細菌群落結構和多樣性變化，測序數據統計如表1所示。所有樣品一共得到156 304 條Tags，平均每個樣品有31 260 條，Tags的平均長度為（252±1）bp。Tags經過優化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU。5 個樣品共產生387 種OTU，其中6 個月的OTU種類最多，達到312 種。

表1 魚露發酵過程細菌16S rRNA測序數據統計Table 1 16S rRNA sequencing data statistics of bacteria in fish sauce during fermentation

2.2 傳統魚露發酵過程中細菌多樣性變化

2.2.1 α多樣性分析

α多樣性是對單個樣品中物種多樣性進行分析，observed species指數、Chao指數和ACE指數反映樣品中群落的豐富度，不考慮群落中每個物種的豐度情況，而Shannon指數和Simpson指數則同時考慮群落中物種豐富度和物種均勻度的影響[14]。不同發酵階段魚露細菌α多樣性分析如表2所示。結果顯示，隨著發酵時間的延長，魚露中細菌多樣性越顯豐富；發酵時間為6、12 個月時，魚露中細菌多樣性最為豐富；發酵時間為6 個月時魚露細菌群落中物種的數量最多，而發酵12 個月時細菌群落中物種更為均勻。

表2 不同發酵時間魚露細菌α多樣性分析Table 2 α Diversity analysis for bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

2.2.2 Venn圖分析

圖1 不同發酵時間魚露細菌群落Venn圖分析Fig. 1 Venn diagram analysis of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

利用Venn圖可以展示多個樣品共有和各自特有OTU數目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。如圖1所示，5 個發酵時間點共有的細菌種類為62 種；發酵后期即6、12 個月份共有的細菌種類最多，達到237 種；發酵時間為6 個月時，獨有的細菌種類最多，達到42 種。

2.2.3 β多樣性分析

采用Bray-Curtis、unweighted UniFrac、weighted UniFrac等β多樣性指標比較不同發酵時間魚露細菌多樣性差異，如圖2所示。Bray-Curtis的計算只考慮樣品中物種的存在情況，而不考慮序列間的進化距離。結果顯示，發酵前期0、1、3 個月之間菌群差異較小，而與發酵后期6、12 個月的菌群差異較大（圖2A）。UniFrac是通過利用系統進化的信息來比較不同樣品間物種群落差異，其中unweighted UniFrac不考慮物種豐度，weighted UniFrac考慮物種豐度。結果顯示，在不考慮物種豐度的情況下，0 個月和1 個月之間菌群差異較小，6 個月和12 個月之間菌群差異較小，3 個月與6、12 個月之間的群落結構更為相似（圖2B）。在考慮物種豐度的情況下，結果與Bray-Curtis分析結果相似，發酵前期0、1、3 個月之間菌群差異較小，發酵后期6、12 個月之間菌群差異較小，但是發酵前期與發酵后期菌群差異較大（圖2C）。

圖2 不同發酵時間魚露細菌β多樣性熱圖分析Fig. 2 β Diversity heat map analysis of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages

2.3 傳統魚露發酵過程中細菌群落結構變化

2.3.1 基于門水平傳統魚露發酵過程細菌群落結構變化

圖3 在門水平下魚露不同發酵時期菌群相對豐度柱形圖（A）和熱圖（B）分析Fig. 3 Stacked-column (A) and heat map (B) analysis of relative abundances of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages at the phylum level

如圖3所示，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是魚露整個發酵過程中最主要的菌群，此結果與蝦醬[15]和豆瓣醬[8]中報道的結果相似。在起始發酵階段，主要以Firmicutes為主，并在3 個月時Firmicutes的相對豐度達到最高（96.8%）。隨著發酵時間的延長，Firmicutes的豐度逐漸降低，而Proteobacteria的豐度逐漸升高，在12 個月時達到46.0%。這個結果與蝦醬中菌群變化結果有所不同：發酵初期主要為Proteobacteria，發酵后期Firmicutes代替Proteobacteria成為主要菌群[15]。

2.3.2 基于屬水平傳統魚露發酵過程微生物群落結構變化

圖4 在屬水平下魚露不同發酵時期菌群相對豐度柱形圖（A）和熱圖（B）分析Fig. 4 Stacked-column (A) and heat map (B) analysis of relative abundances of bacterial communities in fish sauce at different fermentation stages at the genus level

如圖4所示，不同發酵時期在屬的水平下魚露的菌群顯著不同，其中鹽厭氧菌屬（Haloanaerobium）是魚露整個發酵過程中最主要的菌群。這個結果與蝦醬[15]、罐裝腌漬鯡魚（Surstr?mming）[16]和韓國魚醬油（Myeolchi-Aekjeot）[17]中菌群變化結果一致。在發酵起始階段，Haloanaerobium的相對豐度逐漸升高，并在3 個月時達到最高（92.1%），隨著發酵時間的繼續延長，Haloanaerobium的相對豐度逐漸降低。與發酵初期相比，發酵中后期時鹽單胞菌屬（Halomonas）、發光桿菌屬（Photobacterium）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）等菌群的相對豐度增加最為顯著。發酵末期，Halomonas成為優勢菌群，其相對豐度為25.8%。Tetragenococcus是豆瓣醬、泰國魚醬油[8,18-19]等鹽漬發酵食品中主要的菌群。本研究中，Tetragenococcus雖然是魚露發酵過程中主要的菌群之一，但是與報道的鹽漬發酵食品相比，Tetragenococcus的豐度相對較低。

2.4 傳統魚露發酵過程中揮發性風味化合物含量變化

傳統魚露不同發酵時期揮發性風味化合物含量變化結果如圖5所示。發酵1、3、6、12 個月的魚露樣品共檢測出54 種揮發性化合物，包括醛類（13 種）、酮類（5 種）、醇類（7 種）、酯類（5 種）、烴類（8 種）、酸類（7 種）和含氮化合物（9 種）。隨著發酵時間的延長，醛類、醇類、酸類、酯類和烴類化合物的總含量呈現逐漸上升的趨勢，酮類化合物的總含量呈現逐漸下降的趨勢，含氮化合物的總含量則變化不大。在整個魚露發酵過程，醛類、醇類、酸類化合物的總含量明顯高于其他風味化合物。

醛類化合物是脂質氧化的降解產物，一般具有令人愉快的氣味，如青草味、麥芽香味、水果香味和奶酪味[20-21]。在本研究中，醛類化合物是魚露發酵過程中種類最多和含量最高的揮發性風味化合物。3-甲硫基丙醛、2-甲基丙醛和3-甲基丁醛是含量最高的醛類化合物，其含量變化與醛類化合物總含量變化相似，在12 個月時含量達到最高。庚醛是魚腥味的主體成分，12 個月時魚露中庚醛的含量比1 個月降低了67.5%。其他9 種醛類化合物的含量較低，其中（E,Z）-2,6-壬二烯醛的含量最低，在整個發酵過程中均低于1 μg/kg。酮類化合物一般會產生醚味、奶酪味、焦香味[13,22]。魚露發酵過程共發現5種酮類化合物，相比于其他種類的風味化合物，酮類化合物的含量較低。

圖5 傳統魚露不同發酵時間揮發性化合物含量變化Fig. 5 Changes in contents of volatile flavor components in fish sauce at different fermentation stages

如圖5所示，醇類化合物主要來源于碳水化合物、氨基酸和脂肪的代謝[23-24]。魚露發酵過程中，乙醇、2-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇的含量相對較高，在4 個發酵階段均被檢出。魚露發酵過程中酯類化合物主要來源于醇類和酸類物質的酯化反應，其中以乙酯類物質為主，這可能與魚露發酵過程產生高濃度的乙醇有關，其中乙酸乙酯的含量最高，在4 個發酵階段均被檢出。這個結果與醬油中酯類揮發性化合物的報道一致[25-26]。

烴類化合物是魚露發酵過程中含量最低的一類揮發性化合物，共檢測到8 種烴類化合物，但是這幾種化合物的含量都較小，而且烷烴類化合物通常認為不具有氣味活性[27]，因此烴類化合物對魚露整體風味的貢獻較小。魚露發酵過程共檢測到7 種酸類化合物，其中只有乙酸在4 個發酵階段均被檢出，其含量變化與乙酸乙酯含量變化一致。

含氮化合物來源于碳水化合物和氨基酸發生美拉德反應或者氨基酸的熱分解。三甲胺、2-異戊基-6-甲基吡嗪和2-乙基呋喃在4個發酵階段均被檢出。三甲胺是魚露中魚腥味的主體成分，與庚醛的變化相似，發酵12 個月后魚露中三甲胺含量比發酵1 個月降低了63.4%，結果表明發酵時間的延長有利于降低魚露的腥味。

氣味活性值（odor activity value，OAV）是香氣化合物濃度與其閾值的比值，已廣泛應用于特征性香氣活性化合物的篩選，OAV≥1，則可認為此揮發性物質為主體呈香風味化合物，且OAV越大對整體香氣貢獻程度越高[28]。本研究利用OAV從魚露發酵過程檢測到的54 種揮發性風味化合物中篩選主體呈香化合物，結果如表3所示。在魚露整個發酵過程中共有9 種化合物為主體呈香風味化合物（OAV≥1），其中3-甲硫基丙醛（土豆香味）的平均OAV最大，達到135.98，其次是3-甲基丁醛（麥芽香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、2-甲基丙醛（麥芽香味）和乙酸乙酯（水果香味），另外還有2-乙基呋喃（青草味）、三甲胺（魚腥味）、2-甲基-1-丁醇（麥芽香味）和己醛（青草味、脂味），這些風味化合物對魚露的整體香氣輪廓有顯著的貢獻。本研究結果與Fukami等[29]對魚露的特征揮發性風味化合物鑒定結果相似。這些呈香風味化合物也被證實為是醬油[30]和豆瓣醬[31]等發酵食品的關鍵香氣化合物。結果表明，這9 種風味化合物可能是傳統魚露的關鍵主體呈香風味化合物。

表3 傳統魚露發酵過程中的主體呈香化合物（OAV≥1）Table 3 Principal aroma compounds (OAV ≥ 1) in fish sauce at different fermentation stages

2.5 細菌群落結構對傳統魚露揮發性風味形成的影響規律

本研究篩選Halanaerobium、Halomonas、Photobacterium和Tetragenococcus 4 種優勢菌群與3-甲硫基丙醛、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-乙基呋喃、三甲胺、2-甲基-1-丁醇、己醛9 種主體風味化合物，利用Pearson相關性分析研究細菌群落結構對傳統魚露揮發性風味形成的影響規律，如表4所示。Halanaerobium與三甲胺呈顯著正相關，與乙酸乙酯呈顯著負相關，結果預示Halanaerobium可能會抑制傳統魚露發酵過程中水果香味的產生，促進傳統魚露發酵過程中魚腥味的生成。Halomonas與2-甲基丙醛呈顯著正相關，結果預示Halomonas可能會促進傳統魚露發酵過程中麥芽香味的生成。Photobacterium和Tetragenococcus與9 種主體風味化合物均無顯著相關。有趣的是Halomonas與除三甲胺以外的8 種主體呈香化合物均呈正相關，而這8 種化合物的含量均在發酵12 個月時達到最大，結果預示Halomonas可能在魚露發酵后期揮發性風味形成上發揮著重要作用。

表4 優勢菌群與主體揮發性風味化合物之間的Pearson相關性分析Table 4 Pearson’s correlation analysis between dominant bacterial communities and principal aroma compounds

3 結 論

采用16S rRNA高通量測序技術研究魚露發酵過程細菌群落結構及多樣性變化，魚露發酵過程細菌多樣性較為豐富，共檢測到387 種細菌。隨著發酵時間的延長，魚露細菌種類先上升后下降，在6 個月達到最大（312 種），從6 個月增加到12 個月菌群多樣性有所下降但菌群差異性變小。Firmicutes和Proteobacteria是魚露整個發酵過程中最主要的門。Haloanaerobium是魚露發酵過程中最主要的屬，隨著發酵時間的延長其相對豐度先上升后下降，在3 個月時達到最高（92.1%）。與發酵初期（0 個月）相比，發酵中后期Photobacterium、Tetragenococcus和Halomonas等菌群的相對豐度增加最為顯著。發酵末期（12 個月），Halomonas成為優勢的菌群，其相對豐度為25.8%。采用GC-MS技術研究魚露發酵過程中的揮發性風味成分，共檢測出醛、醇、酮、酯、烴、酸、含氮化合物7大類共54 種揮發性化合物，并根據OAV≥1篩選到9 種主體呈香風味化合物，其中3-甲硫基丙醛（土豆香味）的平均OAV最大（135.98），其次是3-甲基丁醛（麥芽香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、2-甲基丙醛（麥芽香味）、乙酸乙酯（水果香味）、2-乙基呋喃（青草味）、三甲胺（魚腥味）、2-甲基-1-丁醇（麥芽香味）和己醛（青草味、脂味），這些風味化合物對魚露的整體香氣輪廓有顯著貢獻。利用Pearson相關性分析考察4 種主要優勢菌群與9 種主體風味化合物之間的相關性，結果發現Halanaerobium與三甲胺呈顯著正相關，與乙酸乙酯呈顯著負相關，Halanaerobium可能會抑制傳統魚露發酵過程中水果香味的產生，促進傳統魚露發酵過程中魚腥味的生成；Halomonas與2-甲基丙醛呈顯著正相關，Halomonas可能會促進傳統魚露發酵過程中麥芽香味的生成。