1 株產(chǎn)桔青霉素擴展青霉的鑒定及其產(chǎn)毒條件優(yōu)化

李慧芳，趙利娜，鄭香峰，王 蕓，刁軍委，張曉云，張紅印,*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學生命科學研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

桔青霉素（citrinin，CIT）是一種由青霉、曲霉、紅曲霉屬的某些菌株產(chǎn)生的對革蘭氏陽性菌具有強烈抑菌效果的真菌次級代謝產(chǎn)物[1-2]。CIT是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界范圍廣泛關注的霉菌毒素，是食品和飼料的天然污染物，主要發(fā)生在儲藏的谷物、玉米、小麥、大米、大麥和堅果中[3-4]，且會與其他毒素共同存在。體內(nèi)體外的大量研究已經(jīng)證明CIT對人體和動物具有腎毒性[5]、胚胎毒性[6]、致畸性[7]、致癌性[8]，還會破壞小鼠的生殖系統(tǒng)[9]，導致動物機體消化系統(tǒng)紊亂，發(fā)生腹瀉[10]，是另一個除赭曲霉毒素A之外引起巴爾干地區(qū)腎病的潛在病原體[11]。此外，CIT可與其他真菌毒素如赭曲霉毒素、展青霉素等發(fā)生協(xié)同作用，增強對人畜的危害[12-13]。鑒于CIT污染廣、毒性大的特點，人們對于CIT的關注度越來越高。

2000年日本率先規(guī)定了紅曲色素中CIT的含量不能超過0.2 μg/g[14]，歐盟要求CIT在紅曲霉發(fā)酵大米中的限量標準為2 μg/g[15]。我國直到2008年才規(guī)定液態(tài)和固態(tài)紅曲類產(chǎn)品中CIT限量標準分別為50 μg/L和1 μg/g，而對食品中CIT無限定指標。GB 5009. 222—2016《食品中桔青霉素的測定》中增加了大米、玉米、辣椒粉樣品中CIT限量標準為25 μg/kg，大麥、燕麥、小麥中CIT不得超過10 μg/kg，紅曲及其制品中CIT限量標準修改為80 μg/kg。然而對于水果及其制品中CIT的限量值仍未提及。

早在1931年，已有報道指出從桔青霉（Penicillium citrinum）的液體培養(yǎng)基中分離得到CIT[16]。后來發(fā)現(xiàn)曲霉屬和紅曲霉中也有大量的菌株能夠積累CIT[17]。此外，CIT也是青霉屬某些菌株的代謝產(chǎn)物，如黃綠青霉（Penicillium citreoviride）、點青霉（Penicillium notatum）等。青霉是導致水果腐爛的主要真菌，因此產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物CIT對各種水果及其制品都有不同程度的污染[18-19]。Andersen等[20]從水果、果汁和谷物中分離得到260 株青霉，研究發(fā)現(xiàn)近85%的青霉能夠產(chǎn)生CIT。Aziz等[21]檢測了腐爛葡萄、蘋果、梨等水果傷口處的CIT，發(fā)現(xiàn)CIT含量為280～920 μg/kg。Dietrich等[22]對超市中的幾種果汁進行了CIT檢測，結(jié)果表明果汁中也含有CIT，最高質(zhì)量濃度達到20 μg/mL。尤其是柑橘果實，常常受到CIT的污染。CIT的污染基本上發(fā)生在柑橘采后貯藏期，受環(huán)境、收獲年份及地理位置等的影響，CIT對柑橘的污染程度有所不同。對于水果中真菌毒素的研究，目前主要集中在葡萄及其制品中赭曲霉毒素，蘋果及其制品中展青霉素等的研究，對于柑橘果實中的真菌毒素尤其是CIT的研究鮮有報道[23]。

鑒于CIT的毒性及在水果及其產(chǎn)品中的污染情況，本課題組在鎮(zhèn)江江心洲果園的腐爛柑橘上篩選出1株產(chǎn)CIT的菌株H1，經(jīng)鑒定為擴展青霉（Penicillium expansum），并進一步研究培養(yǎng)基、溫度、pH值、溶氧量、培養(yǎng)時間等對菌株H1生長及產(chǎn)CIT能力的影響。該研究不僅為生產(chǎn)條件下規(guī)避柑橘CIT產(chǎn)毒條件、減少毒素產(chǎn)生的風險提供一定的依據(jù)，同時為控制CIT產(chǎn)毒方法的研究提供實驗支撐，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌株H1采用平板劃線法分離自江蘇省鎮(zhèn)江江心洲果園的腐爛柑橘果實。

CIT標準品 北京普華仕科技發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Sigma公司；甲苯、乙酸乙酯、甲酸、酵母浸膏、瓊脂、蔗糖、葡萄糖、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、L-谷氨酸單鈉國藥集團化學試劑有限公司；核酸染色液、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Supermix（包含PCR緩沖液、dNTP、Taq酶等）、DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；實驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（配熒光檢測器） 安捷倫科技有限公司；7300型基因擴增儀 美國ABI公司；ChemiDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀 北京六一公司；血球計數(shù)板 丹陽市健陵醫(yī)療器械公司；全自動高壓滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；數(shù)碼成像光學顯微鏡 江南光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和試劑的配制

馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，加水煮沸20 min，過濾后往濾液中加入20 g葡萄糖，蒸餾水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：在PDB培養(yǎng)基的基礎上加入20 g瓊脂，其余處理完全相同。

味精（MSG）培養(yǎng)基：ZnSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CaCl20.1 g，KH2PO45 g，K2HPO45 g，L-谷氨酸單鈉 5 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

酵母浸膏蔗糖（YSM）培養(yǎng)基：酵母浸膏40 g，蔗糖160 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

復合萃取劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7∶3∶1，V/V）。

CIT標準儲備溶液：將1 mg CIT標準品溶于1 mL色譜級甲醇中，制成1 000 μg/mL的CIT標準儲備溶液，保存在－20 ℃冰箱中。

1.3.2 分子生物學鑒定

首先使用DNA提取試劑盒提取菌株的DNA，然后用PCR儀擴增得到該菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、BenA、CaM、PRB2序列，引物分別為ITS：ITS1（F）：TCCGTAGGTGAACCTGCG和ITS4（R）：TCCTCCGCTTATTGATATGC；BenA：Bt2a（F）：GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC和Bt2b（R）：ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC；CaM：CMD5（F）：CCGAGTACAAGGARGCCTTC和CMD6（R）：CCGATRGAGGTCATRACGTGG；PRB2：5Feur（F）：GAYGAYCGKGAYCAYTTCGG和7CReur（R）：CCCATRGCYTGYTTRCCCAT。PCR擴增體系采用25 μL體系：超純水6.5 μL、正反引物各2.5 μL、PCR Supermix 12.5 μL、待測菌DNA提取液1 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性1 min，54 ℃（根據(jù)引物選擇合適的退火溫度）退火1 min（或1 min 30 s），72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫。

PCR完成后，以1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，電泳程序：100 V，100 mA，30 min，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。將菌株H1的ITS、BenA、PRB2、CaM序列與NCBI資料庫中已有的序列作比對，測序結(jié)果使用Clustal W方法對齊，并用MEGA6.0進行聚類分析，以Neighbor-Joining分析方法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，從而確定菌株的親緣關系及分類地位。

1.3.3 菌懸液的制備

將菌株H1接種于PDA培養(yǎng)基上活化，25 ℃培養(yǎng)7 d，用接種環(huán)挑取孢子至無菌生理鹽水中，振蕩混勻，用無菌槍頭吸取菌懸液從蓋玻片側(cè)邊滴于血球計數(shù)板上，吸掉蓋玻片外多余液體，在10×40 倍顯微鏡下觀察計算菌懸液的濃度，調(diào)整菌懸液孢子的濃度至1×106個/mL備用。研究環(huán)境條件對菌株生長和產(chǎn)毒的影響時吸取1 mL 1×106個/mL的孢子懸浮液至目標液體培養(yǎng)基中，每個實驗做3 個平行3 組重復。

1.3.4 不同培養(yǎng)條件的確定及其菌絲干質(zhì)量的測定

不同培養(yǎng)基：分別吸取1 mL 1×106個/mL的H1孢子懸浮液至裝有50 mL目標培養(yǎng)基（PDB、YSM和MSG培養(yǎng)基）的250 mL三角瓶中，于25 ℃、130 r/min的恒溫恒濕搖床中培養(yǎng)14 d，其他條件保持一致。結(jié)束培養(yǎng)后用紗布過濾，將菌絲球置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量菌絲干質(zhì)量[24]，每個實驗做3 個平行3 組重復，用以檢測培養(yǎng)基對H1生長的影響。

培養(yǎng)溫度：分別選擇4、15、20、25、30、35、40 ℃于130 r/min的恒溫恒濕搖床中培養(yǎng)14 d，其他條件保持一致；pH值：通過添加HCl或NaOH將YSM培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，25 ℃、130 r/min的恒溫恒濕搖床中培養(yǎng)14 d，其他條件保持一致；溶氧量也會影響菌株的生長和產(chǎn)毒，將接種后的培養(yǎng)基分別放置于25 ℃培養(yǎng)箱靜置和25 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)14 d，其他條件保持一致；培養(yǎng)時間選擇1～5 周，每周測定1 次。

1.3.5 菌株CIT含量的測定

CIT提取參照Wang Shichao等[25]的方法，略作修改。

菌株H1使用上述不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)2 周后加入2 倍體積的提取液復合萃取劑，于60 ℃、130 r/min水浴搖床中振蕩提取60 min，靜置5 min，將上清液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，之后加入1 mL的色譜甲醇復溶，移液槍吸出至1.5 mL的EP管中，1 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，用注射器移入1.5 mL的進樣瓶中，用配備熒光檢測器的高效液相色譜儀檢測。檢測條件：熒光檢測器檢測波長：激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm；色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（用色譜純磷酸調(diào)至pH 2.5）1∶1（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗進行3 次生物學重復，數(shù)據(jù)以 ±s表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件的Student’s t檢驗或One-Way ANOVA的Tukey’s檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)CIT能力的確認

經(jīng)高效液相色譜測定可知，菌株H1代謝產(chǎn)物色譜圖（圖1b）中保留時間為8.849 min，和CIT標準品（圖1a）的保留時間8.842 min接近，可能是由于菌株H1代謝產(chǎn)物中雜質(zhì)較多，影響了保留時間。向H1產(chǎn)物樣品中添加適宜濃度CIT標準品重新進行液相檢測，該峰與CIT標準品峰完全重合，得出8.849 min處的物質(zhì)為CIT。

圖1 CIT標準品（a）、菌株H1產(chǎn)物（b）高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of CIT standard and sample from strain H1

2.2 產(chǎn)毒菌株形態(tài)學鑒定結(jié)果

將菌株H1單點分別接種到PDA培養(yǎng)基和柑橘傷口處，25 ℃培養(yǎng)，其生長形態(tài)和菌落形態(tài)如圖2所示，H1在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，培養(yǎng)3 d和7 d菌落直徑分別為20 mm和58 mm左右。菌絲起初為白色，約3 d后顏色逐漸轉(zhuǎn)暗綠色，7 d左右轉(zhuǎn)灰綠色，中心部位較突出，有放射狀皺紋，無滲出液，質(zhì)地絨狀，外緣呈白色，近外緣處有淡黃色滲出物，背面呈肉桂色。H1接種在柑橘上腐爛直徑較大，生長2 d后腐爛直徑約為8.8 mm（傷口直徑3 mm），說明該菌株會引起柑橘腐爛。在10×40 倍顯微鏡下可見分生梗無色，末端處有2 個左右的分枝，分枝上有許多呈放射狀的小梗，分生孢子橢圓形，無色，呈鏈狀。

圖2 菌株H1的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig. 2 Colony and microscopic morphology of strain H1

2.3 分子生物學鑒定

菌株H1的ITS、BenA、CaM、PRB2的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后的長度分別為540、451、519 bp和1 142 bp（圖3），圖4是以Neighbor-Joining分析方法基于ITS、BenA、CaM、PRB2序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)合形態(tài)學結(jié)果，將菌株H1鑒定為擴展青霉（P. expansum）。

圖3 菌株H1的PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplification products of genomic DNA from strain H1 on 1% agarose gel

圖4 菌株H1基于ITS（a）、BenA（b）、CaM（c）、PRB2（d）序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree obtained from Neighbor-Joining analysis of ITS (a),BenA (b), CaM (c), and RPB2 (d) sequences of strain H1

2.4 培養(yǎng)基種類對菌株生長和產(chǎn)毒的影響

圖5 培養(yǎng)基種類對菌株H1生長及產(chǎn)CIT的影響Fig. 5 Effects of different media on mycelial growth and CIT production of strain H1

由圖5可知，菌株H1在3 種培養(yǎng)基上均能生長和產(chǎn)毒，在YSM培養(yǎng)基上生長最旺盛，PDB培養(yǎng)基上生長狀況與MSG培養(yǎng)基上接近。同時，從圖5可以看出，菌株H1在YSM培養(yǎng)基上CIT產(chǎn)量也最高，達到1.2 μg/g以上，而PDB培養(yǎng)基上CIT產(chǎn)量最低，僅為0.3 μg/g。因此后續(xù)實驗均選擇YSM培養(yǎng)基用于菌株H1的產(chǎn)毒研究。已有研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)CIT的紅曲霉在有機氮含量豐富的培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)毒能力都較高，尤其是在酵母浸膏中[26]。本研究培養(yǎng)菌株H1所用的YSM培養(yǎng)基中酵母浸膏的比例為4%，有機氮含量較為豐富，CIT產(chǎn)量最高，與上述研究結(jié)果一致。由于柑橘中氨基酸含量較為豐富，可以為P. expansum侵染柑橘提供較為豐富的氮源，更有利于P. expansum的生長和CIT的產(chǎn)生，所以在柑橘運輸貯藏過程中應盡量減少其機械損傷，從源頭阻止P. expansum侵染果實。

2.5 溫度對菌株生長和產(chǎn)毒的影響

圖6 溫度對菌株H1生長及產(chǎn)CIT的影響Fig. 6 Effects of culture temperature on mycelial growth and CIT production of strain H1

如圖6所示，菌株H1在4 ℃和35 ℃時不生長，也檢測不到CIT。15～25 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，其菌絲質(zhì)量濃度和產(chǎn)毒量均增加，至25 ℃時達到最大值。以上實驗結(jié)果表明溫度對菌株H1生長和產(chǎn)毒影響均較大，4 ℃的低溫和35 ℃的高溫均會抑制該菌株生長和產(chǎn)毒，因此在實驗中可通過低溫或偏高溫度貯藏抑制H1的生長和產(chǎn)毒。

2.6 pH值對菌株生長和產(chǎn)毒的影響

圖7 pH值對菌株H1生長及產(chǎn)CIT的影響Fig. 7 Effects of initial medium pH on mycelial growth and CIT production of strain H1

從圖7可以看出，菌株H1在pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的培養(yǎng)基上均可生長，其中菌絲質(zhì)量濃度最小的為堿性（pH 11）培養(yǎng)條件，為2 g/L左右，pH 3.0～9.0時菌絲質(zhì)量濃度相當。說明其生長范圍較為廣泛，生存能力較強。同時，培養(yǎng)基的pH值對菌株產(chǎn)CIT的影響呈逐漸遞減的變化趨勢，在培養(yǎng)基pH 3.0時CIT產(chǎn)量最高，達到12.8 μg/g，之后產(chǎn)毒量依次降低，在培養(yǎng)基pH 11.0時，產(chǎn)物中幾乎檢測不到CIT，說明堿性環(huán)境能抑制毒素合成，與Sandra等[27]的研究結(jié)果一致，這為探究控制毒素方法提供了思路，有必要對其進行深入的研究。而Xiong Xu等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，降低紅曲發(fā)酵液的pH值至3.0以下時可以抑制CIT的產(chǎn)生。這可能是由于菌株H1系從柑橘腐爛傷口處篩選出來的，柑橘果肉偏酸性，宿主環(huán)境一定程度上影響了侵染菌株的特性。

2.7 溶氧量對菌株生長和產(chǎn)毒的影響

圖8 溶氧量對菌株H1生長及產(chǎn)CIT的影響Fig. 8 Effects of dissolved oxygen on mycelial growth and CIT production of strain H1

由圖8可知，靜置和搖床培養(yǎng)下菌株H1均可生長和產(chǎn)毒，H1在靜置條件下菌絲生物量最高，與王靜[29]的研究結(jié)果一致，可能是由于搖床培養(yǎng)下菌株會形成球狀，占據(jù)的空間變大，生長受到抑制。但在溶氧量較高的搖床培養(yǎng)下CIT產(chǎn)量達到最大值，是靜置條件下的12.13 倍，Hajjaj等[30]和Pereira[31]的研究也得到相同的結(jié)果，說明氧氣對于桔霉素的合成具有促進作用。

2.8 培養(yǎng)時間對菌株生長和產(chǎn)毒的影響

由于柑橘及其制品的儲運期往往比較長，在這期間菌絲生長和毒素產(chǎn)量是動態(tài)變化的，通過測定不同時期的培養(yǎng)基中菌絲生物量以及毒素積累量，了解菌株H1的生長狀態(tài)和CIT在產(chǎn)毒菌中的代謝變化，有利于深入研究CIT在菌體中的合成與代謝。如圖9所示，菌株H1培養(yǎng)1 周時已經(jīng)開始產(chǎn)生CIT，第2～5周，隨著時間的延長，CIT產(chǎn)量逐漸減少，第2周時CIT的積累量達到最高，CIT逐漸降低的原因可能是由于后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，CIT被分解，參與其他代謝途徑或保護菌體自身安全。不同菌株產(chǎn)生CIT的時間也有所不同，盧錦強等[32]發(fā)現(xiàn)紅曲霉培養(yǎng)10 d后，其CIT積累量達到最高。

圖9 培養(yǎng)時間對菌株H1生長及產(chǎn)CIT的影響Fig. 9 Effects of culture time on mycelial growth and CIT production of strain H1

3 結(jié) 論

本實驗從柑橘傷口處篩選的菌株H1經(jīng)形態(tài)學和多基因序列分析鑒定為擴展青霉，利用高效液相色譜對其是否產(chǎn)CIT進行驗證，并在體外研究培養(yǎng)基、溫度、pH值、溶氧量和培養(yǎng)時間對H1生長和產(chǎn)CIT能力的影響可知，菌株H1在所選取的幾種培養(yǎng)基上都可以生長和產(chǎn)毒，而YSM培養(yǎng)基最適合菌株生長和產(chǎn)毒；菌株H1的最適生長和產(chǎn)毒溫度為25 ℃，在15～30 ℃之間均能生長和產(chǎn)毒，4 ℃的低溫和35 ℃的高溫均會抑制該菌株生長和產(chǎn)毒；菌株H1適宜生長的培養(yǎng)基pH值范圍較寬，pH值對菌株生長的影響很小，H1的最適生長pH值為7.0，本研究中的菌株H1在培養(yǎng)基pH 3.0時產(chǎn)毒量達到峰值，在堿性環(huán)境中隨著pH值升高，產(chǎn)毒量減小，但都處于較低水平；溶氧量對于菌株H1生長無顯著影響，溶氧量較高的搖床培養(yǎng)下H1產(chǎn)毒能力較強，氧氣對CIT的合成具有促進作用；菌株H1在培養(yǎng)的第1周開始產(chǎn)生毒素，第2周時達到最高，之后毒素產(chǎn)量降低。綜上所述，菌株H1在pH 3的YSM培養(yǎng)基中25 ℃搖床培養(yǎng)生長較好，且生長2 周時毒素含量最高。通過實驗表明，H1在低溫下不生長，在非生長適宜溫度環(huán)境或堿性環(huán)境、溶氧量低等條件下產(chǎn)毒受到抑制。因此在食品加工儲存過程中應當應用這些特點以減少毒素產(chǎn)生，可以從根本上降低食品中CIT的污染。