不同真菌固體發酵對蕨菜主要活性成分及其體外抗氧化和抗炎癥作用的影響

吳永祥，吳麗萍，胡曉倩，金泰完*

（1.黃山學院生命與環境科學學院，安徽 黃山 245041；2.安東國立大學食品科學與生物技術學院，韓國 慶尚北道 安東 760749）

蕨菜（Pteridium aquilinum (Linn.) Kuhn var.latiusculum (Desv.) Underw.）又稱拳頭菜、龍爪菜、蕨兒菜、如意菜等，屬鳳尾蕨科多年生的草本植物。蕨菜廣泛分布于我國東北、西北、華北、西南等，蘊藏量豐富，營養價值高，是我國優質的綠色天然健康食品，被譽為“山菜之王”。蕨菜作為藥食兩用植物，有很高的藥用價值，有清熱解毒、消腫、利水、安神、潤腸通便等功效，可用于治療高血壓、糖尿病、風濕性關節炎等癥狀[1-2]。現代藥理研究表明：蕨菜含有多糖[3]、多酚類[4]、黃酮類[5-6]、萜類[7]等多種生物活性物質，具有抑菌[8]、抗氧化[9-10]、降血脂[11]、抗腫瘤[11]及增強機體免疫[12]等功效。

真菌固體發酵是指以藥（食）用真菌為發酵菌株，以具有活性成分的植物原料為藥用基質，在雙向發酵過程中，藥用基質為真菌生長提供所需營養，真菌對藥用基質進行分解與再合成，從而產生新的功效成分，提高藥效[13-14]。目前已有多篇文獻利用木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌3 種功能真菌進行固體發酵的報道：Son等[15]以靈芝菌株對茵陳蒿葉進行固體發酵，有效提高了活性成分，顯著增強了其抗炎癥作用；Kim等[16]利用靈芝菌株對人參進行固體發酵，顯著提升了人參的免疫調節作用；Neifar等[17]利用木蹄層孔菌對橄欖油餅進行了固體發酵，使油餅中纖維素含量降低、蛋白質含量提高，從而大大提高了油餅的營養價值；鄔建國等[18]利用裂褶菌對葛根渣進行固體發酵，異黃酮含量提升了70%以上。由此可見，利用3 種功能真菌進行固體發酵，不僅可以改善食品風味、增強營養價值，而且可能會提高活性成分含量或產生新的功效成分，從而提高藥效。然而，目前尚鮮有關于蕨菜發酵工藝的研究，本實驗以藥食同源的蕨菜為藥用基質，采用木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌進行固體發酵，對發酵前后蕨菜的主要活性物質總酚、總黃酮含量進行測定，對其抗氧化和抗炎癥作用進行比較，以探討真菌固體發酵對蕨菜活性成分及藥理作用的影響，以期為蕨菜進一步的開發利用提供科學依據，并作為一個例證，為3 種真菌固體發酵在食品加工中應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨菜，2015年5月于安徽省黃山市采集；木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌 韓國微生物培養中心；RAW264.7細胞株 美國模式培養物集存庫。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、VC、丹寧酸、Folin-Ciocalteu試劑、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、Griess試劑美國Sigma公司；Dulbecco’s modified eagle medium（DMEM）培養液、胰蛋白酶、胎牛血清及其他細胞培養試劑 美國Gibco公司。

1.2 儀器與設備

SpectraMax-190型全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；EV341型旋轉蒸發儀 北京萊伯泰科儀器有限公司；CP-ST50A 型CO2培養箱 長沙長錦科技有限公司；DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；IX51型倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和菌懸液的制備

將保藏的木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養基上，于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d后再轉接于PDA平板培養基上。待菌種長滿平板后，在無菌操作臺內用打孔器（d=6 mm）打取已活化好的菌種接種到PDA液體培養基中，于25 ℃、180 r/min搖瓶培養7 d。培養后，10 000 r/min高速攪拌10 s，即得到均勻的菌懸液[13,19]。

1.3.2 真菌固體發酵蕨菜

將蕨菜洗凈晾干并切成均勻條狀，于60 ℃烘干，加水混合，使其充分吸收水分，再進行高壓濕熱滅菌。在超凈工作臺上取滅菌后的蕨菜于培養皿中，分別接種5%的木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌的菌懸液，于25 ℃培養箱中培養7 d。

1.3.3 固體發酵前后蕨菜醇提物的制備

將固體發酵前后的蕨菜冷凍干燥，粉碎過40 目篩，得蕨菜粉末。稱取蕨菜粉末50.0 g，10 倍體積分數70%乙醇溶液振蕩提取3 次，每次4 h。提取液過濾后合并，減壓濃縮后真空干燥成粉末，即得固體發酵前后的蕨菜醇提物。按式（1）計算各醇提物提取率：

式中：T為各醇提物提取率/%；MS為各提取物濃縮干燥后的質量/g；M0為各原料的質量，50.0 g。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定參考Folin-Ciocalteu法[20-21]并修改如下：取50 μL固體發酵前后的蕨菜醇提物和50 μL Folin-Ciocalteu試劑（0.25 mol/L），充分搖勻，靜置3 min后加入1.0 mL 0.7 mol/L的Na2CO3溶液，室溫靜置1 h顯色，于波長750 nm處測定吸光度。同時Folin-Ciocalteu試劑換成去離子水作為樣品空白對照組。按同法用單寧酸標準品作質量濃度-吸光度的標準曲線：Y=0.002X－0.005（R2＝0.997），其中總酚含量以醇提物中單寧酸當量計（mg/g）。

1.3.5 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定參考鋁鹽顯色法[22]并略作改動。取300 μL固體發酵前后的蕨菜醇提物和300 μL 2% AlCl3試劑，充分混合，室溫靜置1 h顯色，于波長420 nm處測定吸光度。同時AlCl3試劑換成無水乙醇作為樣品空白對照組。按同法用槲皮素標準品作質量濃度-吸光度的標準曲線：Y=0.009X＋0.020（R2=0.995），其中總黃酮含量以醇提物中槲皮素當量計（mg/g）。

1.3.6 清除DPPH自由基能力的測定

參考文獻[23]略作改動，取100 μL不同質量濃度固體發酵前后的蕨菜醇提物（0.0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL），分別加入50 μL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，避光反應10 min，于517 nm波長處測定樣品組吸光度。以VC為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按式（2）計算DPPH自由基清除率：

式中：I為DPPH自由基清除率/%；AS為樣品組吸光度；ASB為100 μL醇提物與50 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度；AC為100 μL 70%乙醇與50 μL DPPH溶液的吸光度；ACB為100 μL 70%乙醇與50 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度。

1.3.7 清除ABTS＋·能力的測定

參考文獻[24]的方法，配制ABTS混合溶液，由7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液避光反應16 h。取50 μL不同質量濃度固體發酵前后的蕨菜醇提物（0.0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL），分別加入100 μL ABTS混合溶液，混勻，避光反應5 min，于734 nm波長處測定樣品組吸光度。以VC為陽性對照，每樣重復3 次，取平均值，并按式（3）計算ABTS＋·清除率：

式中：I為ABTS＋·清除率/%；AS為樣品組吸光度；ASB為50 μL醇提物與100 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度；AC為50 μL 70%乙醇溶液與100 μL ABTS溶液的吸光度；ACB為50 μL 70%乙醇溶液與100 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度。

1.3.8 RAW264.7細胞的培養與傳代

以含10%的胎牛血清作為基礎培養基，將RAW264.7細胞置于37 ℃、5% CO2且相對飽和濕度的培養箱中培養，根據細胞生長的情況，2 d換液1次。待細胞生長至80%時，用細胞刮將細胞刮下，離心后吹打分離細胞，進行傳代培養。

1.3.9 MTT法檢測RAW264.7細胞的活性

取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×105個/mL接種于96 孔板中，每孔100 μL。待細胞完全貼壁良好后（約24 h），更換含不同質量濃度固體發酵前后蕨菜醇提物（0.0、0.05、0.1、0.2 mg/mL）的培養基。培養24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，繼續培養3 h，然后去除孔內的液體，每孔中加入200 μL二甲基亞砜使紫色結晶充分溶解，于570 nm波長處測各孔的吸光度[25]。設置不加樣品的孔為空白對照組，其中每樣重復3 次，取平均值，并按式（4）計算細胞相對存活率：

式中：I為細胞相對存活率/%；AS為樣品組吸光度；AC為空白對照組的吸光度。

1.3.10 固體發酵前后蕨菜醇提物對LPS誘導RAW264.7細胞NO含量的影響

取對數生長期的RAW264.7細胞，以1×106個/mL接種于96 孔板中，每孔200 μL。待細胞完全貼壁良好后，更換含不同質量濃度固體發酵前后蕨菜醇提物（0.0、0.05、0.1、0.2 mg/mL）的培養基，孵育1 h后加入20 μL 1 μg/mL LPS進行誘導。設未誘導對照組、LPS組和LPS＋樣品組，每樣重復3次，培養18 h后，用Griess法檢測細胞上清液中NO含量[26]。按式（5）計算細胞上清液中NO的相對含量：

式中：I為細胞上清液中NO相對含量/%；AS為樣品組吸光度；ALPS為LPS組的吸光度。

1.4 統計學分析

所得數據以 ±s表示，運用SPSS 18.0軟件對實驗結果進行統計分析（One-way ANOVA），利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 固體發酵蕨菜最佳接種量的確定

圖1 接種量對總黃酮含量的影響Fig. 1 Effect of different inoculum amounts on total flavonoid content

為確定真菌固體發酵蕨菜最佳的接種量，參考文獻[16,27]，以質量分數2.5%、5%、10%接種于蕨菜，于25 ℃培養箱中培養7 d，由圖1可知，木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌3 種功能真菌接種量與蕨菜發酵后總黃酮含量的變化有很大關系。3 種真菌接種量在2.5%時，總黃酮含量有所增加，但增加效果不顯著，且過低接種量會使菌株生長緩慢，發酵周期延長，也使得染菌機率增大。當接種量在5%時，總黃酮含量顯著增加。當接種量在10%時，相對于接種量5%，總黃酮含量增加不顯著，且有降低的趨勢，這可能與過高接種量造成菌株生長過快，引起培養基溫度上升，影響菌株的正常代謝有關[28]。結果表明木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌接種量為5%時，總黃酮含量較高，故選定5%為菌種最適接種量。

2.2 固體發酵前后蕨菜醇提物的總酚、總黃酮含量的變化

由表1可知，木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物的提取率顯著高于未發酵蕨菜（P＜0.05），其提取率分別為24.14%、22.45%、26.63%，而未發酵蕨菜的提取率為17.56%。木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物的總酚含量明顯降低，從未發酵時的（48.50±0.62）mg/g分別減少到（18.61±2.29）、（32.18±0.37）、（38.84±0.58）mg/g，表示在真菌發酵過程中分解利用了蕨菜中的總酚物質，并較少或不合成多酚類化合物。已有研究顯示，微生物發酵能顯著影響原料中總酚的含量，總酚含量的變化與發酵菌種、發酵方式以及發酵時間有關，即不同菌種不同發酵時間不同發酵的方式產生酶的種類、量和活力是有很大差異的，既可以提高總酚含量也可以破壞多酚類物質的結構，這些差異造成了發酵前后總酚含量的不同[29-30]。

表1 發酵前后蕨菜醇提物的提取率及總酚與黃酮的含量Table 1 Extraction yields, total phenolic and flavonoid contents of native and fermented PAEE

如表1所示，不同真菌固體發酵對蕨菜中總黃酮含量的影響不同。木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物的總黃酮含量較發酵前均顯著性增加（P＜0.05），從未發酵時的（4.78±0.84）mg/g分別增加到（7.06±0.05）、（8.32±0.59）、（8.95±1.23）mg/g，分別提高了47.7%、74.1%、87.2%。表明3 種真菌對蕨菜進行固體發酵，可以明顯提高總黃酮的含量，這可能與真菌在發酵過程中對蕨菜中的某些成分進行了轉化，形成了新的黃酮類化合物；真菌在發酵過程中產生豐富的初生或次生代謝產物，這些代謝產物與蕨菜中某些物質發生了反應形成了新的黃酮類化合物[19]。另有研究表明真菌在發酵過程中能夠產生較高活性的水解酶，如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶以及蛋白酶，這些水解酶能夠降解植物纖維素，降低淀粉等高分子對活性成分的包裹作用，有利于黃酮類物質的溶出[31-32]。這些結果與本研究所得的結果相一致。

2.3 固體發酵前后蕨菜醇提物對DPPH自由基清除作用的影響

表2 發酵前后蕨菜醇提物對DPPH自由基的清除作用Table 2 DPPH radical scavenging activity of native and fermented PAEE

由表2可知，固體發酵前后蕨菜醇提物對DPPH自由基清除能力均表現出明顯的量效效應，即隨樣品質量濃度增加，DPPH自由基清除能力隨之增加。其中裂褶菌發酵的蕨菜醇提物質量濃度（X）與清除率（Y）間的回歸方程為：Y=36.54X＋19.65（R2=0.978）；未發酵蕨菜醇提物質量濃度（X）與清除率（Y）間的回歸方程為：Y=80.64X－6.462（R2=0.995）；VC質量濃度（X）與清除率（Y）間的回歸方程為：Y=1 229X－0.257（R2=0.999）。木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物清除DPPH自由基能力較發酵前均有所下降，對DPPH自由基清除作用的IC50值分別為（1.74±0.04）、（0.92±0.03）、（0.83±0.04）mg/mL，而陽性對照VC、未發酵蕨菜醇提物的IC50值分別為（0.04±0.001）、（0.70±0.01）mg/mL。真菌發酵后蕨菜醇提物DPPH自由基清除能力的下降，與發酵過程中總酚含量的降低有關，說明蕨菜中的總酚可能是其發揮清除DPPH自由基作用的主要活性物質。

2.4 固體發酵前后蕨菜醇提物對ABTS＋·清除作用的影響

表3 發酵前后蕨菜醇提物對ABTS＋·的清除作用Table 3 ABTS radical scavenging activity of native and fermented PAEE

由表3可知，固體發酵前后蕨菜醇提物對ABTS＋·均有顯著的清除作用，并呈現明顯的量效關系。3 種真菌固體發酵后蕨菜醇提物清除ABTS＋·能力較發酵前均有所下降。ABTS＋·清除能力排序為陽性對照組VC＞未發酵組＞裂褶菌發酵組＞靈芝發酵組＞木蹄層孔菌發酵組，其對ABTS＋·清除作用的IC50值分別為（0.05±0.001）、（0.51±0.02）、（0.92±0.01）、（1.20±0.14）、（2.69±0.01）mg/mL。結果表明，固體發酵前后蕨菜醇提物對ABTS＋·清除能力的變化規律與對DPPH自由基清除能力的變化規律一致，說明蕨菜的抗氧化能力可能來自于蕨菜中的總酚物質。

2.5 固體發酵前后蕨菜醇提物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響

由圖2可知，在0.05～0.2 mg/mL質量濃度條件下，固體發酵前后蕨菜醇提物對RAW264.7細胞活性無顯著影響，且無劑量效應。當質量濃度達到0.2 mg/mL時，未發酵組及木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物的細胞存活率分別為103.94%、103.48%、106.84%、102.92%，與對照組相比，無統計學差異（P＞0.05）。以上說明，固體發酵前后蕨菜醇提物在0.2 mg/mL質量濃度內，對RAW264.7細胞無明顯毒性作用，可用于后續實驗的研究。

圖2 發酵前后蕨菜醇提物對RAW264.7細胞活性的影響Fig. 2 Effects of native and fermented PAEE on cell viability in RAW264.7 cells

圖3 發酵前后蕨菜醇提物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO抑制作用的影響Fig. 3 Inhibitory effects of native and fermented PAEE on LPS-induced NO production in RAW264.7 cells

由圖3可知，未誘導對照組的RAW264.7細胞上清液中只含有少量的NO，給予LPS誘導后，細胞上清液中NO含量較未誘導對照組顯著提高（P＜0.05），表明體外RAW264.7細胞炎癥模型建立成功。固體發酵前后蕨菜醇提物對LPS誘導RAW264.7細胞NO的含量均有明顯的抑制作用，且隨著樣品濃度增加，細胞模型中NO的含量逐漸減少，與LPS組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌固體發酵后蕨菜醇提物抑制NO生成的作用較發酵前顯著增強，當質量濃度達到0.2 mg/mL時，對NO生成的抑制率分別為58.61%、63.57%、69.46%，而未發酵蕨菜醇提物的抑制率為27.09%。抗炎癥作用排序為裂褶菌發酵組＞靈芝發酵組＞木蹄層孔菌發酵組＞未發酵組，說明3 種真菌對蕨菜進行固體發酵，可以明顯提高其抗炎癥作用，這可能與發酵過程中這3 種真菌的代謝活動使蕨菜的總黃酮含量升高有關。有大量研究顯示，黃酮類物質能夠抑制LPS誘導RAW264.7細胞NO的釋放，具有良好的抗炎癥作用[33-34]。

2.6 發酵前后蕨菜醇提物的總酚、總黃酮含量與體外抗氧化、抗炎癥活性的相關性分析

表4 發酵前后蕨菜醇提物的總酚、總黃酮含量與體外抗氧化、抗炎癥活性的相關性分析Table 4 Correlation analysis between total phenolic and total flavonoid contents and antioxidant and anti-inflammatory activities of native and fermented PAEE

目前很多研究表明，植物中的化學成分含量與其生物活性之間存在著良好的相關性。陳瑋玲等[35]研究表明青錢柳葉不同提取物中總酚、總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、還原能力之間呈正相關，與總抗氧化能力呈顯著負相關。黃士淇等[29]研究不同真菌發酵對墨江紫米多酚及其抗氧化性的影響，結果表明發酵前后墨江紫米的抗氧化性與總酚含量有關，而與總花色苷含量變化不相關。由表4可知，發酵前后蕨菜醇提物的總酚含量與ABTS＋·清除能力具有較好的相關性，其次為DPPH自由基清除能力，與體外抗炎癥作用無顯著相關性，其中總酚含量與ABTS＋·、DPPH自由基清除能力的相關系數分別為0.980、0.955。相關性分析顯示，發酵前后蕨菜醇提物的總黃酮含量與ABTS＋·、DPPH自由基清除能力無顯著相關性，但與體外抗炎癥作用呈顯著正相關，相關性系數為0.954。

3 結 論

本研究結果表明，經過木蹄層孔菌、靈芝和裂褶菌3 種功能真菌的固體發酵，蕨菜醇提物的總酚含量、總黃酮含量以及體外抗氧化、抗炎癥作用均受到顯著的影響。發酵后蕨菜醇提物的總酚含量較發酵前明顯下降，總黃酮含量顯著增加，抗氧化能力降低，抗炎癥作用得到有效提高。發酵前后蕨菜醇提物的總酚含量與其抗氧化能力有較好的相關性，總黃酮含量與抗炎癥作用呈顯著正相關。發酵前后蕨菜的總酚、總黃酮物質種類繁多，需進一步分離純化，以篩選出更加明確有效的抗氧化和抗炎癥活性成分。本研究結果為進一步開發和利用蕨菜資源提供科學理論依據。