金銀花純花固態(tài)發(fā)酵酒風(fēng)味特征及活性功能成分分析

馬 宇，黃永光,*，唐東亞，潘承金

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州花酒酒業(yè)有限公司，貴州 鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700）

金銀花又名雙花、銀花、忍冬花，是我國傳統(tǒng)的中藥材之一[1]，屬于國家重點(diǎn)管理以及國務(wù)院確定的名貴藥材之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)金銀花中主要含有綠原酸、肌醇、皂貳、揮發(fā)油、黃酮類等藥理成分，其中以綠原酸的含量最高。大量研究表明綠原酸對心血管有保護(hù)作用[3]，對胃癌及結(jié)腸癌的發(fā)生具有預(yù)防及抑制作用[4]，對降血脂[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[8]等均有顯著效果。以原生態(tài)純花為原料，利用現(xiàn)代發(fā)酵調(diào)控技術(shù)開發(fā)花酒產(chǎn)品，不但可以實(shí)現(xiàn)對純天然資源的高效利用，而且也可以將純花中的活性功能成分進(jìn)行生物性高效提取，轉(zhuǎn)移到酒類食品中，滿足消費(fèi)者對酒類健康產(chǎn)品的營養(yǎng)與保健功效的消費(fèi)需求。

花酒的制作方式主要有浸泡、發(fā)酵和蒸餾[9-10]，也可多種工藝交互應(yīng)用[11]，縱觀現(xiàn)有的花酒產(chǎn)品類型，以浸泡、浸提工藝生產(chǎn)的花酒居多。浸泡、浸提生產(chǎn)工藝是藥酒、花卉酒等功能營養(yǎng)型酒生產(chǎn)采用的一種普遍工藝方法。利用浸泡工藝主要是將花卉中的有效成分和獨(dú)特香味通過浸提轉(zhuǎn)移到酒中，賦予其養(yǎng)生功效，再經(jīng)過過濾、澄清得到較為穩(wěn)定的花酒產(chǎn)品，其工藝原理為醇溶、浸提，花卉中有效成分的提取受浸提媒介、溫度、時間等影響，一般提取效率較差，同時還無法實(shí)現(xiàn)對甲醇等安全性指標(biāo)的有效防控[12]。發(fā)酵和蒸餾工藝在花酒制作中較少，多采用糧食加鮮花的方式進(jìn)行花酒的釀造，由于原料上離不開糧食所以酒中甲醇無法避免；其次是酒精加鮮花發(fā)酵液方式，該生產(chǎn)方式在一定程度上也會降低鮮花的營養(yǎng)與藥理保健成分。縱觀現(xiàn)有資料報道，花酒釀造仍然沒有一種有效的方法實(shí)現(xiàn)對食用花卉中有效活性、風(fēng)味和營養(yǎng)成分的提取與富集。

本實(shí)驗主要采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）聯(lián)用方法對金銀花純花固態(tài)發(fā)酵釀造花酒的風(fēng)味進(jìn)行研究，并測定其活性成分及相應(yīng)的理化指標(biāo)，以研究純化固態(tài)發(fā)酵酒的特征風(fēng)味及其風(fēng)味形成機(jī)理、酒體中的主要風(fēng)味成分對酒體風(fēng)味風(fēng)格特征的影響機(jī)制，為探索花卉釀造資源的利用和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)42%）于貴州花酒酒業(yè)有限公司2015年7月生產(chǎn)。釀造工藝：采用特制小曲為發(fā)酵劑，對純花固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行調(diào)控，采用1 000 kg大型陶壇為發(fā)酵設(shè)備，發(fā)酵時間30 d，基酒經(jīng)長期貯存后勾兌而成（釀造技術(shù)專利號ZL 201210015038.7）。

正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C7～C40）、2-辛醇（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；石油醚、甲醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 7890-5975 MSD GC-MS聯(lián)用儀、1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；2000型蒸發(fā)光散射檢測器美國Alltech公司；SB2200超聲波清洗器 上海超聲儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測定

甲醇、氰化物（按氫氰酸計）：GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；鉛：GB 5009.12—2010《食品中鉛的測定》第一法；總砷：GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》第一法；汞：GB 5009.17—2014 《食品中總汞及有機(jī)汞的測定》第一法；錫：GB 5009.16—2014《食品中錫的測定》第一法；山梨酸：GB/T 5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》第二法；亞硫酸鹽（以二氧化硫計）：GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測定》第一法；乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二鈉鈣計）：SN/T 1018—2001《出口食品罐頭中乙二胺四乙酸含量檢驗方法》；鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯：GB/T 21911—2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》。

1.3.2 感官評定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法，選取10 人進(jìn)行金銀花酒整體風(fēng)味輪廓的感官評定，品評人員包括研究白酒風(fēng)味化學(xué)的8 名研究生和具有10 a以上白酒品評經(jīng)驗的2 名老師（省級評委、國家一級品酒師）。經(jīng)培訓(xùn)練習(xí)后，感官品評人員對金銀花酒樣品的香氣，如花香、甜香（蜂蜜/焦糖）、水果香、發(fā)酵香（酒香）、糧香（小麥/麥芽）、草本/青生、曲香和酯香等香氣的感官強(qiáng)度進(jìn)行評定，評定分?jǐn)?shù)范圍為0～5，0 分為未聞到，5分為聞到的香氣最強(qiáng)。取20 mL酒樣于白酒品評專用杯中，于（20±1）℃進(jìn)行感官評定，取所得分值結(jié)果的平均值作風(fēng)味蜘蛛網(wǎng)圖。

1.3.3 風(fēng)味成分分析

HS-SPME萃取：根據(jù)范文來等[14]方法，取2 mL酒樣放入15 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水，用NaCl飽和，旋緊瓶蓋，超聲萃取30 min。將頂空瓶置于水浴中于50 ℃恒溫萃取40 min，萃取完畢后將萃取頭取出，插入GC進(jìn)樣口熱解吸3 min，熱解吸溫度250 ℃。

GC條件：采用非極性與極性雙柱檢測定性。GC檢測器和進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為8 mL，不分流進(jìn)樣，氦氣作為載氣，流量2 mL/min，色譜柱初溫50 ℃維持2 min，再以6 ℃/min升溫到230 ℃，并控制此溫度15 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；全方位掃描范圍：35～350 amu。

1.3.4 活性功能成分測定

綠原酸：參照GB/T 22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》，其含量計算見式（1）：

式中：X為酒樣中綠原酸質(zhì)量濃度/（mg/L）；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線下求得進(jìn)樣液中綠原酸質(zhì)量濃度/（μg/L）；V1為溶液定容體積/L；V2為花酒試樣的體積/mL。在相同條件下重新測定其結(jié)果所得的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的10%。

蘆丁：參考白鴻[15]方法采用高效液相色譜檢測金銀花酒中的蘆丁，計算見式（2）：

式中：X為樣品中蘆丁質(zhì)量濃度/（mg/L）；S1為樣品峰面積；S2為標(biāo)準(zhǔn)液峰面積；V為樣品定容體積/L；m為樣品質(zhì)量/mg；c為標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（mg/L）。

單寧：參照NY/T 1600—2008《水果蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

定性分析：根據(jù)改進(jìn)的Kovats法[16]計算保留指數(shù)（retention index，RI）。在各組分中添加C5～C30烷烴混合標(biāo)樣，進(jìn)GC-MS分離，通過烷烴的保留時間計算未知物的RI。通過質(zhì)譜譜庫檢索與NIST 05 a.L庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對定性，定性結(jié)果通過計算其RI值、香氣描述與文獻(xiàn)報道RI值和香氣描述比對確認(rèn)，其計算見式（3）：

式中：ti為香氣物質(zhì)i的保留時間/min；tz和tz+1為緊鄰香氣物質(zhì)i前后的兩個正構(gòu)烷烴的保留時間/min；z為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法定量，通過內(nèi)標(biāo)物的峰面積和樣品中各組分的峰面積比值，計算各個組分質(zhì)量濃度，其計算見式（4）：

式中：Ci為待測組分i的質(zhì)量濃度/（mg/L）；Ws為加入內(nèi)標(biāo)s的質(zhì)量/mg；Ai和As分別為待測組分i和內(nèi)標(biāo)化合物s的峰面積；V為待測樣品的體積/L；fi為待測組分i對內(nèi)標(biāo)s的相對質(zhì)量校正因子；本實(shí)驗中各待測組分i的相對校正因子均為1。

風(fēng)味輪廓分析采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花酒理化指標(biāo)

表1 金銀花酒理化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 1 Physicochemical properties of honeysuckle flower liquor

由表1可知，從金銀花固態(tài)發(fā)酵酒中均未檢出甲醇、氰化物、鉛、總砷、汞、錫、山梨酸、亞硫酸鹽、乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二鈉鈣計）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯，相關(guān)理化衛(wèi)生指標(biāo)符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.2 金銀花酒體風(fēng)味分析

2.2.1 金銀花酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

圖1 金銀花酒GC-MS圖Fig. 1 GC-MS profile of honeysuckle flower liquor

表2 金銀花酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分檢出結(jié)果Table 2 Main volatile flavor compounds identified in honeysuckle flower liquor

續(xù)表2

續(xù)表2

對金銀花酒的GC-MS圖進(jìn)行定性分析，從金銀花酒中定性定量檢測鑒定出69 種主要風(fēng)味化合物（表1），其中，酯類21 種，烴類16 種，芳香類15 種，萜烯類6 種，醇類5 種，醛類2 種，酸類2 種，醚類1 種，呋喃類1 種。

從所定性定量風(fēng)味化合物來看，花酒中數(shù)量最多的是酯類化合物，占全部檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的24%，酯類大部分來源于發(fā)酵過程中醇與酸的酯化反應(yīng)。由于酒中乙醇含量較高，通過固態(tài)發(fā)酵形成較多乙酯，使得乙酯在所生成酯中占了較大比例，其中乙酸乙酯由酵母氨基酸或糖代謝產(chǎn)生的高級醇和乙酰輔酶A反應(yīng)形成，而脂肪酸乙酯如丙酸乙酯、丁酸乙酯等則是由酵母脂肪酸代謝過程中產(chǎn)生的脂酰輔酶A醇解產(chǎn)生[24]。酯類香氣物質(zhì)主要呈水果香和花香，是花酒中種類最多的香氣物質(zhì)，共檢測到21 種。可以應(yīng)用香氣化合物的氣味活性值（odour activity value，OAV）判定其是否是酒體中重要香氣化合物，通常情況下OAV不小于1的化合物對酒體的整體香氣有貢獻(xiàn)。香氣化合物的OAV越大，說明其對整體香氣貢獻(xiàn)越大[25]。在酯類中，OAV大于1的有：辛酸乙酯（OAV=1 766），貢獻(xiàn)白蘭地似的甜香；3-甲基丁酸乙酯（OAV=176），貢獻(xiàn)果香、酯香；癸酸乙酯（OAV=58），略有刺激氣味；乙酸異戊酯（OAV=56）有愉快香蕉香味；月桂酸乙酯（OAV=26.7），貢獻(xiàn)花果香；己酸乙酯（OAV=8.7），貢獻(xiàn)菠蘿香；辛酸異戊酯（OAV=4.1），貢獻(xiàn)水果香，稀釋后呈白蘭地似酒香。

其次是芳香族化合物，芳香族化合物多數(shù)呈花香，增進(jìn)酒體香濃協(xié)調(diào)，主要來源于原料中芳香族氨基酸的分解代謝，是金銀花酒中的重要香氣物質(zhì)。在金銀花酒中共檢測到芳香族化合物16 種，占18%，芳香族化合物以苯乙醇（OAV=94.25）為主，貢獻(xiàn)了金銀花酒青草香、玫瑰花香、花粉香等典型的香氣。

再次是醇類化合物，占比為5%～9%。醇類物質(zhì)種類數(shù)量雖少，但整體濃度高，醇類物質(zhì)主要來自發(fā)酵階段有氧環(huán)境下糖類的轉(zhuǎn)化和無氧條件下氨基酸的轉(zhuǎn)化，少量的高級醇可通過酵母還原相應(yīng)的醛類物質(zhì)生成[26]。除乙醇外，2-甲基丁醇（OAV=3.5）是金銀花酒中最重要的醇類物質(zhì)，呈葡萄酒香及醇香。

花酒中的乙縮醛是重要的香氣化合物（OAV=301.8），為乙醛與乙醇的縮合物。據(jù)資料報道，乙縮醛也是清香型白酒最主要的縮醛類物質(zhì)[27]，這是緣于金銀花酒采用了類似小曲清香型白酒的釀造工藝。乙醛具有較強(qiáng)的刺激性口味，單體乙醛在白酒中呈新酒味，加入清香型白酒后呈類似青草的香氣，有刺激感，隨著貯存時間延長，新酒味和刺激感逐漸消失而變得柔和。乙縮醛具有柔和爽口的口感特征，如與乙醛的量比關(guān)系適宜，能增加酒的放香和消除酒體的沉悶感[28]。

萜烯類物質(zhì)為飲料酒中一類重要的功能活性物質(zhì)，大多數(shù)關(guān)于酒中萜烯類化合物的報道最早來自葡萄酒[29-30]，近年在中國白酒董酒中發(fā)現(xiàn)較多的萜烯類[31-32]。金銀花酒中存在多種萜烯類化合物，其中芳樟醇（又名沉香醇、里那醇）對金銀花酒風(fēng)味貢獻(xiàn)較大（OAV=120.3），呈濃青帶甜的木青香，資料顯示，芳樟醇正是金銀花中發(fā)揮主要藥理作用價值的物質(zhì)之一[33]，其作為一種功能活性物質(zhì)已被證明能夠減輕肺部炎癥[34]，研究曾在玫瑰香型葡萄酒中發(fā)現(xiàn)少量芳樟醇[35]，而在中國白酒為首次被檢出、報道。β-大馬酮（OAV=3 825）是金銀花酒中的最重要香氣物質(zhì)，其香氣閾值很低，沸點(diǎn)很高，雖然其在酒中的含量較少，但賦與了金銀花酒強(qiáng)烈、愉快的“花香”、“甜香”。β-大馬酮作為香氣化合物，曾在威士忌酒、朗姆酒、白蘭地酒中被檢出、報道[36-38]。在中國白酒中，β-大馬酮首次在汾酒中發(fā)現(xiàn)，在其他幾大香型（濃香型、醬香型、兼香型等香型）白酒中報道較少[39]。另外，羅勒烯、萜品油烯、α-柏木烯、反式丁香烯均被報道存在于水仙花[40]、香雪蘭[41]以及柑橘類果皮[42]等植物中，由此推測萜烯類化合物也是金銀花酒中金銀花香氣貢獻(xiàn)的關(guān)鍵物質(zhì)。

除了以上化合物，烴類化合物也占了相當(dāng)大的比例，其比例與酯類相當(dāng)。推測其可能與金銀花木質(zhì)微生物發(fā)酵的代謝產(chǎn)物有關(guān)，由于釀造花酒的原料中有糖，含碳量高，經(jīng)小曲糖化發(fā)酵后碳原子形成飽和鏈烴。目前，在其他類型的白酒中鮮見到如此數(shù)量多的烷烴類化合物報道。從化合物質(zhì)量濃度上來看，最高的烴類是十六烷、十五烷、十八烯，此類物質(zhì)曾在金銀花揮發(fā)油中被報道[20]，這些化合物對酒體整體香氣有一定貢獻(xiàn)，課題組正在進(jìn)一步開展相關(guān)的檢測和驗證。

2.2.2 金銀花酒香氣特征

圖2 金銀花酒整體香氣輪廓分析Fig. 2 Analysis of the aroma profile of honeysuckle flower liquor

由圖2可看出，整體上金銀花酒的香氣協(xié)調(diào)豐滿，以花香和甜香為主，發(fā)酵香、果香和草本香氣也占較大比例，曲香、酯香、糧香占比較小。該整體風(fēng)格主要緣于其采取特制小曲作為發(fā)酵劑，采用相似于清香型小曲白酒的釀造工藝，兼有小曲酒風(fēng)味；同時，采用純金銀花作為釀酒原料，而未加糧食，自然糧香味低，而金銀花的原料風(fēng)味較突出。在金銀花酒中OAV最高的是β-大馬酮（玫瑰芳香，糖果甜香），其次是辛酸乙酯（似白蘭地，甜香）、乙縮醛（青草香，果香）、3-甲基丁酸乙酯（果香，酯香）、芳樟醇（濃青帶甜的木青香氣）、苯乙醇（青草香，玫瑰花香，薔薇香氣，花粉味）、癸酸乙酯（果香和酒香香氣）、乙酸異戊酯（愉快的蕉香）、月桂酸乙酯（花果香，果香）、己酸乙酯（菠蘿香氣）、乙醛（甜味，果香）、羅勒烯（草香，花香，橙花油香）、辛酸異戊酯（水果香，似白蘭地酒香）、2-甲基丁醇（葡萄酒香，醇香）、反式丁香烯（丁香花香）這些化合物為金銀花酒特有香氣成分，對酒體風(fēng)格具有重要貢獻(xiàn)，其部分已被確定為清香型酒的重要香味成分[25-26,36-37]。

2.3 活性功能成分分析

從表3可知，金銀花酒中含有咖啡酸、蘆丁、綠原酸、木犀草苷、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、槲皮素等活性功能成分。

據(jù)報道金銀花所含化學(xué)成分有綠原酸、異綠原酸、黃酮化合物、芳樟醇和雙花醇等[2-3]。主要有效成分有揮發(fā)油：具有抑菌抗病毒作用；木犀草素：具有抗菌、消炎、改善心血管功能及解痙、祛痰、抗癌作用；酚酸類物質(zhì)：綠原酸、異綠原酸具有廣譜抗菌及抗氧化的作用。

表3 金銀花固態(tài)發(fā)酵酒活性功能成分檢測分析Table 3 Bioactive components in honeysuckle flower liquor

由表3可知，本研究樣品金銀花酒中含有大量綠原酸，質(zhì)量濃度達(dá)到40.49 mg/L，異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸也有相對較高的含量。木犀草苷和蘆丁作為黃酮類主要成分的代表，是金銀花酒中重要的微量功能活性成分。金銀花酒中有如此多的活性功能成分，是因利用鮮花直接固態(tài)發(fā)酵，提高了酒的品質(zhì)和原料中有效活性功能成分的利用率，使金銀花中的營養(yǎng)成分和藥理保健成分及其風(fēng)味等得到保留和轉(zhuǎn)移到酒體中。此類活性成分在其他種類白酒中極少，甚至鮮見報道，為金銀花純花固態(tài)發(fā)酵釀造白酒的酒體差異性、顯著性特征。

3 結(jié) 論

本研究花酒主要原材料來源于植物花卉，取代了常規(guī)花酒中的糧食成分，從原料上杜絕了甲醇的產(chǎn)生，釀制過程中不添加任何添加劑、色素和糧食，陶壇純花固態(tài)發(fā)酵。通過調(diào)節(jié)、控制發(fā)酵工藝參數(shù)，實(shí)現(xiàn)本地資源原料發(fā)酵、微生物代謝，富集乙醇及酒體中的風(fēng)味化合物和活性功能成分，再通過蒸餾，獲取金銀花基酒，基酒經(jīng)過壇藏足年貯存，勾兌成成品酒，使金銀花中的營養(yǎng)成分和活性功能成分和花的風(fēng)味等完全得到保留、利用。酒體的口感風(fēng)味具有金銀花的花香、芳香、綿甜等特點(diǎn)，產(chǎn)品淡韻留香、清爽甘冽，酒水層次豐滿，口感綿甜柔和，后味爽凈悠長，花香獨(dú)特。該釀造技術(shù)已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利，走在行業(yè)前沿。

固態(tài)純化發(fā)酵金銀花酒中重要的香氣化合物有β-大馬酮、辛酸乙酯、乙縮醛、3-甲基丁酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、乙醛、羅勒烯、辛酸異戊酯、2-甲基丁醇、反式丁香烯，其風(fēng)味與清香型白酒有一定相似性，同時具有金銀花的花香風(fēng)味特征。整體香氣輪廓圖表明，其香氣協(xié)調(diào)豐滿，以花香和甜香為主。金銀花酒中含有很高的綠原酸及黃酮類物質(zhì)含量，有一定的保健功效。檢測結(jié)果表明金銀花酒中不含甲醇等酒類產(chǎn)品監(jiān)管安全因子。酒體感官呈現(xiàn)金銀花的花香特征香氣，本研究雖然分析檢測金銀花酒中呈花香的化合物，但仍然未準(zhǔn)確定性出金銀花的特征香氣成分，需進(jìn)一步探究。