金銀花純花固態發酵酒風味特征及活性功能成分分析

馬 宇，黃永光,*，唐東亞，潘承金

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州花酒酒業有限公司，貴州 鎮遠 557700）

金銀花又名雙花、銀花、忍冬花，是我國傳統的中藥材之一[1]，屬于國家重點管理以及國務院確定的名貴藥材之一[2]。研究發現金銀花中主要含有綠原酸、肌醇、皂貳、揮發油、黃酮類等藥理成分，其中以綠原酸的含量最高。大量研究表明綠原酸對心血管有保護作用[3]，對胃癌及結腸癌的發生具有預防及抑制作用[4]，對降血脂[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、調節免疫系統[8]等均有顯著效果。以原生態純花為原料，利用現代發酵調控技術開發花酒產品，不但可以實現對純天然資源的高效利用，而且也可以將純花中的活性功能成分進行生物性高效提取，轉移到酒類食品中，滿足消費者對酒類健康產品的營養與保健功效的消費需求。

花酒的制作方式主要有浸泡、發酵和蒸餾[9-10]，也可多種工藝交互應用[11]，縱觀現有的花酒產品類型，以浸泡、浸提工藝生產的花酒居多。浸泡、浸提生產工藝是藥酒、花卉酒等功能營養型酒生產采用的一種普遍工藝方法。利用浸泡工藝主要是將花卉中的有效成分和獨特香味通過浸提轉移到酒中，賦予其養生功效，再經過過濾、澄清得到較為穩定的花酒產品，其工藝原理為醇溶、浸提，花卉中有效成分的提取受浸提媒介、溫度、時間等影響，一般提取效率較差，同時還無法實現對甲醇等安全性指標的有效防控[12]。發酵和蒸餾工藝在花酒制作中較少，多采用糧食加鮮花的方式進行花酒的釀造，由于原料上離不開糧食所以酒中甲醇無法避免；其次是酒精加鮮花發酵液方式，該生產方式在一定程度上也會降低鮮花的營養與藥理保健成分。縱觀現有資料報道，花酒釀造仍然沒有一種有效的方法實現對食用花卉中有效活性、風味和營養成分的提取與富集。

本實驗主要采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）聯用方法對金銀花純花固態發酵釀造花酒的風味進行研究，并測定其活性成分及相應的理化指標，以研究純化固態發酵酒的特征風味及其風味形成機理、酒體中的主要風味成分對酒體風味風格特征的影響機制，為探索花卉釀造資源的利用和產品開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花酒（乙醇體積分數42%）于貴州花酒酒業有限公司2015年7月生產。釀造工藝：采用特制小曲為發酵劑，對純花固態發酵進行調控，采用1 000 kg大型陶壇為發酵設備，發酵時間30 d，基酒經長期貯存后勾兌而成（釀造技術專利號ZL 201210015038.7）。

正構烷烴混合標準品（C7～C40）、2-辛醇（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；石油醚、甲醇、蘆丁標準品 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC 7890-5975 MSD GC-MS聯用儀、1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；2000型蒸發光散射檢測器美國Alltech公司；SB2200超聲波清洗器 上海超聲儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 理化指標的測定

甲醇、氰化物（按氫氰酸計）：GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》；鉛：GB 5009.12—2010《食品中鉛的測定》第一法；總砷：GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》第一法；汞：GB 5009.17—2014 《食品中總汞及有機汞的測定》第一法；錫：GB 5009.16—2014《食品中錫的測定》第一法；山梨酸：GB/T 5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》第二法；亞硫酸鹽（以二氧化硫計）：GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測定》第一法；乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二鈉鈣計）：SN/T 1018—2001《出口食品罐頭中乙二胺四乙酸含量檢驗方法》；鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯：GB/T 21911—2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》。

1.3.2 感官評定

根據文獻[13]方法，選取10 人進行金銀花酒整體風味輪廓的感官評定，品評人員包括研究白酒風味化學的8 名研究生和具有10 a以上白酒品評經驗的2 名老師（省級評委、國家一級品酒師）。經培訓練習后，感官品評人員對金銀花酒樣品的香氣，如花香、甜香（蜂蜜/焦糖）、水果香、發酵香（酒香）、糧香（小麥/麥芽）、草本/青生、曲香和酯香等香氣的感官強度進行評定，評定分數范圍為0～5，0 分為未聞到，5分為聞到的香氣最強。取20 mL酒樣于白酒品評專用杯中，于（20±1）℃進行感官評定，取所得分值結果的平均值作風味蜘蛛網圖。

1.3.3 風味成分分析

HS-SPME萃取：根據范文來等[14]方法，取2 mL酒樣放入15 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水，用NaCl飽和，旋緊瓶蓋，超聲萃取30 min。將頂空瓶置于水浴中于50 ℃恒溫萃取40 min，萃取完畢后將萃取頭取出，插入GC進樣口熱解吸3 min，熱解吸溫度250 ℃。

GC條件：采用非極性與極性雙柱檢測定性。GC檢測器和進樣口溫度為250 ℃，進樣量為8 mL，不分流進樣，氦氣作為載氣，流量2 mL/min，色譜柱初溫50 ℃維持2 min，再以6 ℃/min升溫到230 ℃，并控制此溫度15 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；全方位掃描范圍：35～350 amu。

1.3.4 活性功能成分測定

綠原酸：參照GB/T 22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》，其含量計算見式（1）：

式中：X為酒樣中綠原酸質量濃度/（mg/L）；c為標準曲線下求得進樣液中綠原酸質量濃度/（μg/L）；V1為溶液定容體積/L；V2為花酒試樣的體積/mL。在相同條件下重新測定其結果所得的絕對差值不得超過算數平均值的10%。

蘆丁：參考白鴻[15]方法采用高效液相色譜檢測金銀花酒中的蘆丁，計算見式（2）：

式中：X為樣品中蘆丁質量濃度/（mg/L）；S1為樣品峰面積；S2為標準液峰面積；V為樣品定容體積/L；m為樣品質量/mg；c為標準液質量濃度/（mg/L）。

單寧：參照NY/T 1600—2008《水果蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》。

1.4 數據及圖像處理

定性分析：根據改進的Kovats法[16]計算保留指數（retention index，RI）。在各組分中添加C5～C30烷烴混合標樣，進GC-MS分離，通過烷烴的保留時間計算未知物的RI。通過質譜譜庫檢索與NIST 05 a.L庫的標準質譜圖比對定性，定性結果通過計算其RI值、香氣描述與文獻報道RI值和香氣描述比對確認，其計算見式（3）：

式中：ti為香氣物質i的保留時間/min；tz和tz+1為緊鄰香氣物質i前后的兩個正構烷烴的保留時間/min；z為正構烷烴的碳原子數。

定量分析：采用內標法定量，通過內標物的峰面積和樣品中各組分的峰面積比值，計算各個組分質量濃度，其計算見式（4）：

式中：Ci為待測組分i的質量濃度/（mg/L）；Ws為加入內標s的質量/mg；Ai和As分別為待測組分i和內標化合物s的峰面積；V為待測樣品的體積/L；fi為待測組分i對內標s的相對質量校正因子；本實驗中各待測組分i的相對校正因子均為1。

風味輪廓分析采用Microsoft Excel 2016軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 金銀花酒理化指標

表1 金銀花酒理化指標檢測結果Table 1 Physicochemical properties of honeysuckle flower liquor

由表1可知，從金銀花固態發酵酒中均未檢出甲醇、氰化物、鉛、總砷、汞、錫、山梨酸、亞硫酸鹽、乙二胺四乙酸（以乙二胺四乙酸二鈉鈣計）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯，相關理化衛生指標符合國家相關標準規定。

2.2 金銀花酒體風味分析

2.2.1 金銀花酒中揮發性風味成分分析

圖1 金銀花酒GC-MS圖Fig. 1 GC-MS profile of honeysuckle flower liquor

表2 金銀花酒中主要揮發性風味物質成分檢出結果Table 2 Main volatile flavor compounds identified in honeysuckle flower liquor

續表2

續表2

對金銀花酒的GC-MS圖進行定性分析，從金銀花酒中定性定量檢測鑒定出69 種主要風味化合物（表1），其中，酯類21 種，烴類16 種，芳香類15 種，萜烯類6 種，醇類5 種，醛類2 種，酸類2 種，醚類1 種，呋喃類1 種。

從所定性定量風味化合物來看，花酒中數量最多的是酯類化合物，占全部檢出揮發性風味物質的24%，酯類大部分來源于發酵過程中醇與酸的酯化反應。由于酒中乙醇含量較高，通過固態發酵形成較多乙酯，使得乙酯在所生成酯中占了較大比例，其中乙酸乙酯由酵母氨基酸或糖代謝產生的高級醇和乙酰輔酶A反應形成，而脂肪酸乙酯如丙酸乙酯、丁酸乙酯等則是由酵母脂肪酸代謝過程中產生的脂酰輔酶A醇解產生[24]。酯類香氣物質主要呈水果香和花香，是花酒中種類最多的香氣物質，共檢測到21 種。可以應用香氣化合物的氣味活性值（odour activity value，OAV）判定其是否是酒體中重要香氣化合物，通常情況下OAV不小于1的化合物對酒體的整體香氣有貢獻。香氣化合物的OAV越大，說明其對整體香氣貢獻越大[25]。在酯類中，OAV大于1的有：辛酸乙酯（OAV=1 766），貢獻白蘭地似的甜香；3-甲基丁酸乙酯（OAV=176），貢獻果香、酯香；癸酸乙酯（OAV=58），略有刺激氣味；乙酸異戊酯（OAV=56）有愉快香蕉香味；月桂酸乙酯（OAV=26.7），貢獻花果香；己酸乙酯（OAV=8.7），貢獻菠蘿香；辛酸異戊酯（OAV=4.1），貢獻水果香，稀釋后呈白蘭地似酒香。

其次是芳香族化合物，芳香族化合物多數呈花香，增進酒體香濃協調，主要來源于原料中芳香族氨基酸的分解代謝，是金銀花酒中的重要香氣物質。在金銀花酒中共檢測到芳香族化合物16 種，占18%，芳香族化合物以苯乙醇（OAV=94.25）為主，貢獻了金銀花酒青草香、玫瑰花香、花粉香等典型的香氣。

再次是醇類化合物，占比為5%～9%。醇類物質種類數量雖少，但整體濃度高，醇類物質主要來自發酵階段有氧環境下糖類的轉化和無氧條件下氨基酸的轉化，少量的高級醇可通過酵母還原相應的醛類物質生成[26]。除乙醇外，2-甲基丁醇（OAV=3.5）是金銀花酒中最重要的醇類物質，呈葡萄酒香及醇香。

花酒中的乙縮醛是重要的香氣化合物（OAV=301.8），為乙醛與乙醇的縮合物。據資料報道，乙縮醛也是清香型白酒最主要的縮醛類物質[27]，這是緣于金銀花酒采用了類似小曲清香型白酒的釀造工藝。乙醛具有較強的刺激性口味，單體乙醛在白酒中呈新酒味，加入清香型白酒后呈類似青草的香氣，有刺激感，隨著貯存時間延長，新酒味和刺激感逐漸消失而變得柔和。乙縮醛具有柔和爽口的口感特征，如與乙醛的量比關系適宜，能增加酒的放香和消除酒體的沉悶感[28]。

萜烯類物質為飲料酒中一類重要的功能活性物質，大多數關于酒中萜烯類化合物的報道最早來自葡萄酒[29-30]，近年在中國白酒董酒中發現較多的萜烯類[31-32]。金銀花酒中存在多種萜烯類化合物，其中芳樟醇（又名沉香醇、里那醇）對金銀花酒風味貢獻較大（OAV=120.3），呈濃青帶甜的木青香，資料顯示，芳樟醇正是金銀花中發揮主要藥理作用價值的物質之一[33]，其作為一種功能活性物質已被證明能夠減輕肺部炎癥[34]，研究曾在玫瑰香型葡萄酒中發現少量芳樟醇[35]，而在中國白酒為首次被檢出、報道。β-大馬酮（OAV=3 825）是金銀花酒中的最重要香氣物質，其香氣閾值很低，沸點很高，雖然其在酒中的含量較少，但賦與了金銀花酒強烈、愉快的“花香”、“甜香”。β-大馬酮作為香氣化合物，曾在威士忌酒、朗姆酒、白蘭地酒中被檢出、報道[36-38]。在中國白酒中，β-大馬酮首次在汾酒中發現，在其他幾大香型（濃香型、醬香型、兼香型等香型）白酒中報道較少[39]。另外，羅勒烯、萜品油烯、α-柏木烯、反式丁香烯均被報道存在于水仙花[40]、香雪蘭[41]以及柑橘類果皮[42]等植物中，由此推測萜烯類化合物也是金銀花酒中金銀花香氣貢獻的關鍵物質。

除了以上化合物，烴類化合物也占了相當大的比例，其比例與酯類相當。推測其可能與金銀花木質微生物發酵的代謝產物有關，由于釀造花酒的原料中有糖，含碳量高，經小曲糖化發酵后碳原子形成飽和鏈烴。目前，在其他類型的白酒中鮮見到如此數量多的烷烴類化合物報道。從化合物質量濃度上來看，最高的烴類是十六烷、十五烷、十八烯，此類物質曾在金銀花揮發油中被報道[20]，這些化合物對酒體整體香氣有一定貢獻，課題組正在進一步開展相關的檢測和驗證。

2.2.2 金銀花酒香氣特征

圖2 金銀花酒整體香氣輪廓分析Fig. 2 Analysis of the aroma profile of honeysuckle flower liquor

由圖2可看出，整體上金銀花酒的香氣協調豐滿，以花香和甜香為主，發酵香、果香和草本香氣也占較大比例，曲香、酯香、糧香占比較小。該整體風格主要緣于其采取特制小曲作為發酵劑，采用相似于清香型小曲白酒的釀造工藝，兼有小曲酒風味；同時，采用純金銀花作為釀酒原料，而未加糧食，自然糧香味低，而金銀花的原料風味較突出。在金銀花酒中OAV最高的是β-大馬酮（玫瑰芳香，糖果甜香），其次是辛酸乙酯（似白蘭地，甜香）、乙縮醛（青草香，果香）、3-甲基丁酸乙酯（果香，酯香）、芳樟醇（濃青帶甜的木青香氣）、苯乙醇（青草香，玫瑰花香，薔薇香氣，花粉味）、癸酸乙酯（果香和酒香香氣）、乙酸異戊酯（愉快的蕉香）、月桂酸乙酯（花果香，果香）、己酸乙酯（菠蘿香氣）、乙醛（甜味，果香）、羅勒烯（草香，花香，橙花油香）、辛酸異戊酯（水果香，似白蘭地酒香）、2-甲基丁醇（葡萄酒香，醇香）、反式丁香烯（丁香花香）這些化合物為金銀花酒特有香氣成分，對酒體風格具有重要貢獻，其部分已被確定為清香型酒的重要香味成分[25-26,36-37]。

2.3 活性功能成分分析

從表3可知，金銀花酒中含有咖啡酸、蘆丁、綠原酸、木犀草苷、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、槲皮素等活性功能成分。

據報道金銀花所含化學成分有綠原酸、異綠原酸、黃酮化合物、芳樟醇和雙花醇等[2-3]。主要有效成分有揮發油：具有抑菌抗病毒作用；木犀草素：具有抗菌、消炎、改善心血管功能及解痙、祛痰、抗癌作用；酚酸類物質：綠原酸、異綠原酸具有廣譜抗菌及抗氧化的作用。

表3 金銀花固態發酵酒活性功能成分檢測分析Table 3 Bioactive components in honeysuckle flower liquor

由表3可知，本研究樣品金銀花酒中含有大量綠原酸，質量濃度達到40.49 mg/L，異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸也有相對較高的含量。木犀草苷和蘆丁作為黃酮類主要成分的代表，是金銀花酒中重要的微量功能活性成分。金銀花酒中有如此多的活性功能成分，是因利用鮮花直接固態發酵，提高了酒的品質和原料中有效活性功能成分的利用率，使金銀花中的營養成分和藥理保健成分及其風味等得到保留和轉移到酒體中。此類活性成分在其他種類白酒中極少，甚至鮮見報道，為金銀花純花固態發酵釀造白酒的酒體差異性、顯著性特征。

3 結 論

本研究花酒主要原材料來源于植物花卉，取代了常規花酒中的糧食成分，從原料上杜絕了甲醇的產生，釀制過程中不添加任何添加劑、色素和糧食，陶壇純花固態發酵。通過調節、控制發酵工藝參數，實現本地資源原料發酵、微生物代謝，富集乙醇及酒體中的風味化合物和活性功能成分，再通過蒸餾，獲取金銀花基酒，基酒經過壇藏足年貯存，勾兌成成品酒，使金銀花中的營養成分和活性功能成分和花的風味等完全得到保留、利用。酒體的口感風味具有金銀花的花香、芳香、綿甜等特點，產品淡韻留香、清爽甘冽，酒水層次豐滿，口感綿甜柔和，后味爽凈悠長，花香獨特。該釀造技術已經獲得國家發明專利，走在行業前沿。

固態純化發酵金銀花酒中重要的香氣化合物有β-大馬酮、辛酸乙酯、乙縮醛、3-甲基丁酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、乙醛、羅勒烯、辛酸異戊酯、2-甲基丁醇、反式丁香烯，其風味與清香型白酒有一定相似性，同時具有金銀花的花香風味特征。整體香氣輪廓圖表明，其香氣協調豐滿，以花香和甜香為主。金銀花酒中含有很高的綠原酸及黃酮類物質含量，有一定的保健功效。檢測結果表明金銀花酒中不含甲醇等酒類產品監管安全因子。酒體感官呈現金銀花的花香特征香氣，本研究雖然分析檢測金銀花酒中呈花香的化合物，但仍然未準確定性出金銀花的特征香氣成分，需進一步探究。