4 種蛋白酶水解雙孢蘑菇效果比較及風味蛋白酶水解工藝優(yōu)化

常詩潔，高 娟，方東路，湯 靜，楊方美，安辛欣，趙立艷，胡秋輝*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、蘑菇、雙孢菇，隸屬于擔子菌門、擔子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬[1]，是世界性栽培和消費的菇類之一。雙孢蘑菇子實體具有高蛋白、低脂肪的特點，而且含有豐富的多糖、礦物質(zhì)元素、核苷酸、膳食纖維等[2-3]。雙孢蘑菇不但具有營養(yǎng)保健價值，而且具有特殊的風味，深受廣大消費者的喜愛。為充分利用雙孢蘑菇中的滋味物質(zhì)，可將其加工成雙孢蘑菇調(diào)味品，與傳統(tǒng)調(diào)味品相比，可以大大減少日常生活中鹽類、味精類調(diào)味品的使用，作為天然調(diào)味品的植物性來源，滋味豐富獨特并且健康營養(yǎng)。因此，雙孢蘑菇調(diào)味品的加工研究引起人們的關注，如劉曉艷等[4]以雙孢蘑菇等4 種食用菌為主要原料，研究功能型復合食用菌調(diào)味品的開發(fā)工藝，但近年來對于食用菌調(diào)味品的研究采用的原料多為香菇[5]，雙孢蘑菇調(diào)味品的研究仍較少。

食用菌味道鮮美，含有豐富的鮮味氨基酸、核苷酸類、可溶性糖、醇類、有機酸等多種小分子水溶性物質(zhì)[6]，研究證明鮮味氨基酸及核苷酸具有一定的協(xié)同增鮮作用[7]。游離氨基酸是食用菌中重要的鮮味活性成分，食用菌中所含的氨基酸有25%～35%處于游離狀態(tài)[8]。氨基酸種類、含量、組成不同，造就了不同食用菌的獨特鮮香滋味[9]。目前市面上一些粗加工的產(chǎn)品，如干品、罐頭等，雖然生產(chǎn)工藝比較簡單，但其呈香呈味物質(zhì)成分并不能夠完全地被提取利用，造成了其中風味物質(zhì)的浪費。食用菌鮮味物質(zhì)的提取有很多方法，傳統(tǒng)方法一般為熱水浸提，在實際生產(chǎn)過程中，其提取效率較低、能耗大，現(xiàn)今生物酶解技術作為一種新型的制備工藝，已廣泛應用于食用菌的加工處理中，通過蛋白酶進行酶解處理，雙孢蘑菇細胞壁中的蛋白質(zhì)得以降解，使得其細胞內(nèi)部的風味物質(zhì)溶出，且能將溶出的大分子蛋白降解成各種呈味的多肽或氨基酸，使其風味更佳。周超等[10]采用酶解技術對茶褐牛肝菌進行酶解，在最佳酶解條件下，酶解液中肽質(zhì)量濃度高達9.27 mg/mL，酶解液為淺褐色，透明性良好，菌香濃郁，鮮味突出；趙立娜等[11]對雙孢蘑菇進行蛋白酶酶解，酶解液再通過美拉德反應可制備成具有食用菌特有濃郁芳香味的呈味基料，并且味道鮮美適口、醇厚。因此，為提高雙孢蘑菇中呈味氨基酸的提取利用，其酶解處理的研究成為重點。

本研究以水解液的可溶性固形物、游離氨基酸濃度、色差、滋味為指標，對4 種不同的蛋白酶酶解處理效果進行對比研究，篩選雙孢蘑菇酶解處理的最佳蛋白酶，并以水解液游離氨基酸濃度為指標，結合單因素及正交試驗方法研究最佳蛋白酶的最優(yōu)水解工藝，由最佳工藝制備所得的雙孢蘑菇水解液可為雙孢蘑菇調(diào)味品的生產(chǎn)提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 天潤吳記高效生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；中性蛋白酶（酶活力50 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力100 000 U/g）、復合蛋白酶（酶活力100 000 U/g）、風味蛋白酶（酶活力30 000 U/g）北京索萊寶科技有限公司；純堿、檸檬酸（均為食品級） 山東優(yōu)索化工科技有限公司；總氨基酸（T-AA）含量測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20/EL20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CM-5分光測色計 柯尼卡美能達控股株式會社；WYT型手持式折光儀 上海滬粵明科學儀器有限公司、L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；味覺指紋分析儀 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

原料預處理（挑選、清洗、切片）→漂燙→勻漿→酶解→滅酶→過濾→取上清液待用

原料預處理：挑選菇體無腐爛、無霉變的新鮮雙孢蘑菇，流水清洗，縱向切成約0.5 cm厚的薄片。漂燙：將切片后的雙孢蘑菇于沸水中進行漂燙殺青處理，以殺死細菌及其他有害物質(zhì)，并達到滅酶目的，結束后將雙孢蘑菇撈出瀝干待用。勻漿：取護色后的雙孢蘑菇，按照料液比1∶5（g/mL）加入去離子水后進行勻漿，以達到破碎細胞結構、使其內(nèi)部風味物質(zhì)溶出的目的。酶解：采用食品級檸檬酸、純堿調(diào)節(jié)勻漿pH值，測定蛋白酶活力后，按照其底物含量加入一定活力單位的酶，保持酶解溫度恒定，在一定時間內(nèi)進行酶解。滅酶：酶解結束后將水解液在100 ℃滅酶15 min。

1.3.2 不同蛋白酶的酶解

取一定量的新鮮雙孢蘑菇，清洗、燙漂后按料液比1∶5（g/mL）加入去離子水后勻漿，分別采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶4 種酶對雙孢蘑菇進行酶解處理，各種蛋白酶的酶解條件以及水解時間見表1，按照表1條件進行酶解，加酶量均為1 000 U/g，酶解結束后，將水解液在100 ℃加熱滅酶15 min，3 500 r/min離心10 min，取適量上清液備用進行指標測定。

表1 4 種酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of four enzymes

1.3.3 指標的測定

1.3.3.1 可溶性固形物的測定

取水解液上清液滴在折光儀棱鏡的毛玻璃上，采用WYT型手持折光儀進行測定，讀取可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)，每個樣品測定3 次，結果取平均值。

1.3.3.2 色澤測定

采用全自動色差儀測定水解液的色澤，使用三色協(xié)調(diào)系統(tǒng)測定L*、a*、b*。L*表示明度，黑色為0，白色為100。坐標原點的顏色為無色（a*＝0，b*＝0）。在水平軸上，＋a*表示顏色紅，－a*表示顏色綠。在縱軸上，＋b*表示顏色黃，－b*表示顏色藍。

1.3.3.3 游離氨基酸濃度的測定

采用總氨基酸（T-AA）試劑盒參照說明書進行測定。

1.3.3.4 游離氨基酸組成的測定

采用L-8900全自動氨基酸分析儀進行測定。酶解處理后的上清液采用0.02 mol/L HCl溶液進行稀釋，過0.22 μm濾膜上機檢測。

1.3.3.5 電子舌指紋分析

取酶解處理后的上清液進行電子舌指紋分析，以無酶解處理作為對照組進行比對，每個樣品重復掃描4 次，所得數(shù)據(jù)用電子舌數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（SA402B）對樣品的鮮味、咸味、苦味、澀味、酸味、豐富性、一次回味和二次回味進行分析。

1.3.4 風味蛋白酶工藝優(yōu)化試驗

1.3.4.1 單因素試驗

取一定量的新鮮雙孢蘑菇，按料液比1∶5（g/mL）加入去離子水后勻漿，分別控制pH值、酶解溫度、加酶量和酶解時間4 個因素，酶解結束后，將水解液100 ℃加熱滅酶15 min，3 500 r/min離心10 min，取適量上清液備用進行指標測定。

控制酶解溫度50 ℃、加酶量1 000 U/g、酶解時間2 h、pH值分別取5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，考察pH值對酶解效果的影響；控制pH 6.5、加酶量1 000 U/g、酶解時間2 h，而酶解溫度分別取30、40、50、60、70 ℃，考察酶解溫度對酶解效果的影響；控制pH 6.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h，而加酶量分別取500、750、1 000、1 250、1 500 U/g，考察加酶量對酶解效果的影響；控制pH 6.5、酶解溫度50 ℃、加酶量1 000 U/g，而酶解時間分別取1、1.5、2、2.5、3 h，考察酶解時間對酶解效果的影響。

1.3.4.2 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選擇pH值、酶解溫度、加酶量和酶解時間4 個因素，每個因素選取3 個水平進行L9（34）正交試驗，以水解液游離氨基酸質(zhì)量濃度為指標，對風味蛋白酶酶解工藝進行優(yōu)化。正交試驗選取的因素和水平如表2所示。

表2 正交試驗設計L9（34）因素和水平Table 2 Independent variables and their levels chosen for L9 (34) orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對雙孢蘑菇水解效果的影響

2.1.1 酶解處理對雙孢蘑菇水解液可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)、游離氨基酸濃度的影響

圖1 4 種酶解處理對雙孢蘑菇水解液可溶性固形物含量、游離氨基酸濃度的影響Fig. 1 Contents of soluble solids and free animo acids in A. bisporus hydrolysates obtained with four different proteases

與大部分植物的細胞壁不同，食用菌細胞壁由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、葡聚糖等組成[12-15]，并且這些多糖與其他成分形成復雜的網(wǎng)狀結構，導致食用菌的細胞壁結構致密，細胞內(nèi)的成分不易釋放，實驗過程中對雙孢蘑菇進行勻漿處理，對原本致密的細胞壁結構造成一定的破碎，同時，蛋白酶處理也可以增強細胞壁的通透性，對細胞內(nèi)部成分的溶出有一定的促進作用[16-17]，從而使得蛋白酶能夠作用的底物濃度大大增加。經(jīng)過不同蛋白酶酶解處理后，如圖1所示，相對于沒有進行酶解處理的對照組，4 種蛋白酶酶解后所得水解液中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)及游離氨基酸濃度均有顯著提高。其中，4 種蛋白酶水解后的可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)相近，這說明經(jīng)過酶解處理可以提高雙孢蘑菇中可溶性物質(zhì)的溶出率，然而4 種蛋白酶對細胞壁通透性的改善則區(qū)別不顯著。但從水解液的游離氨基酸濃度可以發(fā)現(xiàn)，4 種蛋白酶對于溶出物質(zhì)的降解程度具有顯著的區(qū)別。游離氨基酸濃度越高，說明蛋白質(zhì)的降解程度越高，其酶解效果越好，從圖1可以看出，酶解效果從高到低依次為風味蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶和木瓜蛋白酶。其中，中性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，是一類在中性條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶，而復合蛋白酶則是為水解蛋白質(zhì)而研制的桿菌蛋白酶復合體，其主酶是堿性蛋白酶；風味蛋白酶則包含了內(nèi)切蛋白酶與外切肽酶2 種活性，因此蛋白質(zhì)的水解較為徹底。

2.1.2 酶解處理對雙孢蘑菇水解液游離氨基酸組成的影響由于蛋白酶的種類不同，其降解蛋白質(zhì)的作用位點不同，其水解產(chǎn)物也會產(chǎn)生顯著的差異，降解后所得游離態(tài)氨基酸不僅具有各種生理功能，而且大多數(shù)氨基酸及其鹽具有甜味或苦味，少數(shù)幾種具有鮮味或酸味[18]，因此不同的游離氨基酸組成造成了食用菌不同的滋味[19]。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6 種氨基酸能夠呈現(xiàn)出特殊的鮮味[20]，其中L-谷氨酸鈉鹽是味精的主要成分，是天然氨基酸中鮮味最強的物質(zhì)，其次為天冬氨酸及其鈉鹽。甘氨酸、丙氨酸為甜味氨基酸[21-22]。

表3 4 種酶解處理對雙孢蘑菇水解液游離氨基酸組成的影響Table 3 Amino acid compositions of A. bisporus hydrolysates obtained with four different proteases

從表3可以看出，4 種蛋白酶處理后，各游離氨基酸及其總量都顯著提高，其中風味蛋白酶的水解效果最為顯著，其水解液中的游離氨基酸質(zhì)量濃度總計達到1 752.07 mg/L。同時，風味蛋白酶可使水解液形成獨特的風味和減少水解造成的苦味，其水解液中呈鮮味的主要氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸，且質(zhì)量濃度分別達到142.11 mg/L和220.68 mg/L。甘氨酸對食用菌呈味效果影響較大[23]，甘氨酸除了本身可以提供清香甜味以外，還能減少苦味并從食物中除去不快的滋味[24]，風味蛋白酶水解后的甘氨酸含量也顯著高于其他處理組。蘇氨酸作為脂肪族氨基酸，稍具甜味[25]，復合蛋白酶和風味蛋白酶酶解后蘇氨酸質(zhì)量濃度相對于無酶處理組反而顯著下降，特別是復合蛋白酶，其蘇氨酸質(zhì)量濃度比無酶處理組降低了56.42%，風味蛋白酶酶解后蘇氨酸質(zhì)量濃度雖然也有所下降，但其僅降低了0.11%。因此可以得出，風味蛋白酶對雙孢蘑菇的水解較為徹底，其水解液中游離氨基酸總量及呈味氨基酸質(zhì)量濃度相對于其他處理組顯著提高。

2.1.3 酶解處理對雙孢蘑菇水解液色差的影響

圖2 4 種酶解處理對雙孢蘑菇水解液色差的影響Fig. 2 Color parameters of A. bisporus hydrolysates obtained with four different proteases

酶解處理后，水解液中大分子物質(zhì)分解成游離的小分子物質(zhì)，水解液的顏色也會產(chǎn)生一定變化，同時水解液在后續(xù)的干燥及造粒工藝過程中，其最終所得的酶解粉末、顆粒顏色也會有所影響，根據(jù)實際生產(chǎn)要求，最終產(chǎn)品應避免過深的顏色。因此，實驗對4 種不同酶解處理后所得水解液的色差進行測定，從圖2可以看出，各種酶解處理均對水解液的色差值（L*、a*、b*）產(chǎn)生了影響。水解后，水解液的L*值均有顯著上升，說明其亮度顯著提高，水解液顏色變得更為明亮，其中風味蛋白酶酶解后水解液的L*值最高；從a*值可以看出，酶解處理會使得水解液的紅綠色調(diào)產(chǎn)生顯著變化，即紅色減弱，綠色加強；從b*值可以看出，中性蛋白酶及風味蛋白酶對于水解液黃藍色調(diào)的影響不顯著。因此，可以得出，風味蛋白酶可以在基本保持其水解液原本色調(diào)的基礎上，使水解液的亮度提高，水解液顏色清透明亮。

2.1.4 不同酶解處理電子舌分析結果

風味的分析通常采用感官評價法，但該方法易受環(huán)境條件和人體主觀意識主導[26]，影響最終結果的準確性，電子舌技術是模擬生物活體的味覺感受機理[27]，通過檢測各種味覺物質(zhì)和人工脂膜之間的靜電作用或疏水性相互作用產(chǎn)生的膜電勢變化，實現(xiàn)對各種滋味的評價，食品中已廣泛運用該技術對味覺進行表征，客觀和準確地區(qū)分不同樣品[28]，在調(diào)味基料的制備工藝中也已有應用[29]。由圖3可以直觀地看出不同處理組之間的區(qū)別，結合表4方差分析可以看出，水解液的苦味、澀味、鮮味、豐富性和咸味之間存在極顯著差異（P＜0.01），而酸味、一次回味、二次回味則差異不顯著。從圖3可以看出，各酶解處理后，水解液滋味的豐富性都顯著上升，其中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶酶解后，水解液的苦味和澀味都顯著上升，而鮮味和咸味則顯著降低，反之，風味蛋白酶酶解處理后，水解液的苦味、澀味顯著降低，鮮味和咸味則顯著升高。由于不同的酶切斷蛋白質(zhì)的位點不同，水解后生成的呈味氨基酸、短肽鏈也有所不同，因此，即使水解度較高，其風味也會有所變化。呈味肽是指對食品風味具有一定貢獻的寡肽類物質(zhì)，通常分子質(zhì)量小于5 000 u，可賦予食品微妙而細膩的風味。肽不僅可以直接呈味，而且可以與其他風味物質(zhì)相互協(xié)同，增強或改變原有的味道，也可以作為揮發(fā)性風味物質(zhì)的前體參與美拉德反應，形成特殊的芳香化合物[30-31]。苦味、澀味的形成可能是因為蛋白水解后形成了苦味肽，而風味蛋白酶則可以控制肽的苦味，其原理為通過內(nèi)切蛋白酶切斷多肽內(nèi)部的肽鍵，形成短鏈肽，其中一些含有疏水氨基酸，因而成為苦肽，使用外切酶每一次從多肽鏈的末端切斷釋放一個氨基酸，從而把苦肽徹底降解為氨基酸。

圖3 4 種酶解處理對雙孢蘑菇水解液滋味的影響Fig. 3 Taste profiles of A. bisporus hydrolysates obtained with four different proteases

2.2 風味蛋白酶酶解工藝優(yōu)化結果

由不同蛋白酶水解雙孢蘑菇實驗結果可以得出，風味蛋白酶酶解處理后，雙孢蘑菇水解液的可溶性固形物和游離氨基酸濃度均有顯著升高，水解液顏色變亮，且其滋味較好，能夠除去水解液中的苦味、澀味，并且可以顯著提高其咸味和滋味的豐富性。因此，選擇風味蛋白酶制備雙孢蘑菇水解液，并采用單因素試驗和正交試驗對風味蛋白酶的酶解條件進行優(yōu)化。

2.2.1 單因素試驗結果

圖4 不同因素對雙孢蘑菇酶解效果的影響Fig. 4 Effects of different factors on enzymatic hydrolysis of A. bisporus

從圖4A可以看出，風味蛋白酶的最適pH值為6.5，在此pH值下，雙孢蘑菇水解液的游離氨基酸濃度達到最高，同時，當pH值高于6.5時，游離氨基酸濃度呈顯著下降趨勢。因此，選擇風味蛋白酶酶解的最佳pH值范圍為6.0～7.0。

不同酶的最適溫度不同，過高或過低的溫度都會降低酶的催化效率，在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度每升高10 ℃，酶促反應速率可以相應提高1～2 倍；而過高的溫度則會造成酶被破壞，發(fā)生不可逆的變性，即降低酶促反應速率。曹承旭等[32]評價了水解溫度對風味蛋白酶活力的影響，證明在一定溫度范圍內(nèi)，水解度隨著水解溫度升高而升高，本研究結果與之類似。從圖4B可看出，當酶解溫度從30 ℃上升到50 ℃時，雙孢蘑菇水解液的游離氨基酸濃度有十分顯著的上升趨勢，但當酶解溫度超過50 ℃時游離氨基酸濃度則出現(xiàn)了下降的趨勢，此時酶活力受到抑制。因此確定風味蛋白酶的最佳酶解溫度范圍為40～60 ℃。

從圖4C可以看出，當加酶量從500 U/g增加到1 250 U/g時，水解液的游離氨基酸濃度明顯上升，水解度大幅增加，但當加酶量增加到1 500 U/g時，游離氨基酸濃度沒有繼續(xù)增加，這是由于當加酶量達到一定程度時，大部分底物參與反應，由于水解底物有限，即使加酶量繼續(xù)增加，水解度也無法得到提高。因此，確定的最佳加酶量范圍為1 000～1 500 U/g。

從圖4D可以看出，隨著酶解時間的延長，雙孢蘑菇水解液的氨基酸濃度逐漸增大，當酶解時間達到2.5 h后，游離氨基酸達到較高的濃度，而后隨著酶解時間的延長游離氨基酸濃度保持相對平穩(wěn)，結合實際情況，過長的生產(chǎn)時間對工業(yè)生產(chǎn)帶來不利，容易造成能耗過大、成本高的情況，因此選擇2～3 h作為風味蛋白酶的最佳酶解時間范圍。

2.2.2 正交試驗結果

根據(jù)以上單因素試驗結果，以pH值、酶解溫度、加酶量、酶解時間為因素，以水解液游離氨基酸濃度作為考察指標，選取L9（34）正交試驗，根據(jù)極差分析和方差分析的結果確定最佳的風味蛋白酶酶解工藝，其正交試驗分析結果見表5，正交試驗方差分析結果見表6。

表5 風味蛋白酶酶解L9（34）正交試驗設計及結果Table 5 L9 (34) orthogonal array design with experimental results for optimization of enzymatic hydrolysis conditions

比較表5中的4 個因素的極差R值可以發(fā)現(xiàn)各因素影響的大小依次為酶解溫度、pH值、加酶量、酶解時間，從表6可以得出，酶解溫度對風味蛋白酶酶解效果的影響達到極顯著水平，pH值對風味蛋白酶的酶解效果達到顯著水平，說明酶解溫度和pH值是影響酶解效果的關鍵因素。由正交試驗結果可以得出，最佳的風味蛋白酶酶解工藝條件組合為A3B3C2D1，即pH 6.5、酶解溫度60 ℃、加酶量1 000 U/g、酶解時間3 h，在此條件下風味蛋白酶酶解效果最佳，游離氨基酸濃度為140.27 mmol/L。

表6 風味蛋白酶酶解條件方差分析Table 6 Analysis of variance of the effect of hydrolysis conditions on free amino acid concentration

3 結 論

本實驗采用4 種不同蛋白酶對雙孢蘑菇進行酶解處理，通過對其酶解后所得水解液的可溶性固形物含量、游離氨基酸濃度、色澤及滋味特征進行研究，分析4 種酶對雙孢蘑菇酶解效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，酶解處理可以顯著提高水解液的可溶性固形物及游離氨基酸濃度。其中風味蛋白酶的水解效果最好，并且可以顯著除去水解液的苦味、澀味，保持其鮮味，并顯著提高其咸味和滋味的豐富性，在保持水解液原本色調(diào)的基礎上，可以提高其顏色的亮度，為下一步加工雙孢蘑菇調(diào)味品作基礎。因此選擇風味蛋白酶對雙孢蘑菇進行酶解處理，并進一步對風味蛋白酶的酶解工藝進行優(yōu)化。

以水解液游離氨基酸濃度為指標，對酶解時間、酶解溫度、pH值和加酶量4 個因素進行單因素試驗以及L9（34）正交試驗，結果發(fā)現(xiàn)，各因素對水解液游離氨基酸濃度影響程度大小依次為酶解溫度＞pH值＞加酶量＞酶解時間，方差分析結果表明，酶解溫度對風味蛋白酶酶解效果的影響達到極顯著水平，pH值對風味蛋白酶的酶解效果達到顯著水平。試驗最終得出風味蛋白酶最佳酶解工藝為pH 6.5、酶解溫度60 ℃、加酶量1 000 U/g、酶解時間3 h，游離氨基酸濃度為140.27 mmol/L。