粉唑醇在草莓生長和加工過程中對映體選擇性降解行為規律

劉 娜，潘興魯，楊慶喜，張 雙，紀明山，張志宏,*

（1.沈陽農業大學園藝學院，遼寧省草莓育種與優質栽培重點實驗室，遼寧 沈陽 110866；2.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193；3.沈陽農業大學植物保護學院，遼寧 沈陽 110866）

草莓，被譽為“水果皇后”，不僅味道酸甜可口，水果芳香濃郁，而且還含有大量的營養價值及VC，是人們最喜愛的水果之一。除了直接食用外，目前以草莓為原料還有許多副產品，如草莓醬、草莓酒等。經過加工后的草莓酒，其氨基酸、糖、維生素和礦物質等含量較為豐富[1-3]。因此，草莓酒也受到了人們越來越多的喜愛。然而，草莓在生長季節中容易受到病原菌的侵害，草莓白粉病是草莓重要病害之一，發病嚴重時，病葉率在45%以上，病果率在50%以上，嚴重影響了草莓的產量及品質[4]。粉唑醇作為三唑類殺菌劑之一，具有廣譜殺菌活性，較強內吸性，在植物體內可由根部向頂部傳導，是防治草莓白粉病的特效藥劑之一[5]。然而，有研究表明粉唑醇對小鼠具有致畸性，對兔子的發育也具有阻礙性導致骨化延遲[6]。因此，有必要研究粉唑醇在草莓及其副產品草莓酒上的環境降解行為。

圖1 粉唑醇對映體結構Fig. 1 Chemical structures of flutriafol enantiomers

粉唑醇（圖1）是手性化合物，具有一個手性C原子中心，含有兩個對映體。目前市面上銷售的粉唑醇試劑是外消旋體，因此人們把它當成一個化合物去研究，主要集中研究外消旋體粉唑醇的殘留分析方法及其環境行為，然而Shen Zhigang等[7]研究發現在不同性別的兔子體內，R-粉唑醇和S-粉唑醇出現了選擇性消解行為。Zhang Qing等[8]研究表明在葡萄植株內是（－）-R-粉唑醇優先降解，而（+）-S-粉唑醇相對累積，存在較明顯的對映體選擇性降解現象。同時，Zhang Qing等[9]發現（－）-R-粉唑醇對蚯蚓和斜生柵藻的毒性是（+）-S-粉唑醇的2.17～3.52 倍。傳統的手性農藥安全風險評估通常不區分對映體之間的差異，往往導致手性農藥的風險評估結果不可靠，給人類健康和環境安全帶來了諸多隱患。然而手性農藥在進入生態環境后，不同對映體之間對靶標生物的生物活性、非靶標生物的生態毒性以及在動物和植物的富集行為往往存在顯著的差異[10]。因此，從對映體角度來研究粉唑醇在設施草莓中的對映體選擇性消解及草莓酒加工過程中的降解行為至關重要。本研究利用超高效合相色譜-串聯質譜（ultra performance convergence chromatography-tandem mass spectrometry，UPCC-MS/MS）對粉唑醇進行手性拆分，從田間到餐桌，對草莓樣品進行加工并分析兩個對映體的殘留量變化。研究結果闡明手性農藥粉唑醇在草莓上的殘留動態、對映體降解和代謝規律，明確手性農藥高毒對映體在草莓加工過程中的變化規律，提出手性農藥在草莓加工過程中風險控制關鍵點，為企業優化加工工藝、生產更為健康的食品提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

外消旋體粉唑醇（純度98.2%，其中兩種光學異構體單體比例均為1∶1） 上海市農藥研究所有限公司；12.5%粉唑醇懸浮劑 美興農藥業中國有限公司；分散凈化劑N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA，40 μm）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）天津博納艾杰爾科技有限公司；甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、正丁醇（均為色譜純） 美國Thermo Fisher International公司；乙腈、氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；超純水由美國Milli-Q純水器制備。

1.2 儀器與設備

超高效合相色譜系統（配有ACQUITY UPCC二元溶劑管理器、柱溫箱管理器、合相管理器、樣品管理器及Waters 515 補償泵）、三重四極桿Xevo?-TQD質譜檢測器 美國Waters公司；手性色譜柱Chiralpak IA-3（4.6 mm×150 mm，3 μm） 日本Daicel公司；CO2、N2（純度均不小于99.999%） 北京?？圃龑嵱脷怏w有限責任公司；G501A型電子天平 江蘇常熟衡器廠；TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 上海恒勤儀器設備有限公司；RE-2000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Filter Unit濾膜（0.22 μm） 天津博納艾杰爾科技有限公司；醫用無菌注射器 上海治宇醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

外消旋標準溶液配制：用色譜純乙腈配成100 mg/L，在逐級稀釋至0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的標準工作液，置4 ℃貯存備用。

1.3.2 樣品前處理

將草莓樣品打碎，稱取10.0 g（草莓酒10 mL）置于50 mL離心管中，加入10.0 mL分析純乙腈，渦旋3 min，加入1 g NaCl，4 g無水MgSO4，再渦旋1 min，然后離心5 min，取上清液1.5 mL加入到2.5 mL離心管中（內含40 mg PSA+10 mg GCB+150 mg 無水硫酸鎂），再渦旋1 min，然后離心5 min，上清液過0.22 μm有機系濾膜至進樣小瓶待測。

1.3.3 粉唑醇在草莓上的添加回收實驗

稱取10.0 g草莓空白樣品（10 mL草莓酒空白樣品）置于50 mL離心管中，各加入一定量的粉唑醇外消旋體標準溶液，添加量為0.01、0.11 mg/kg和1 mg/kg。同時設置空白對照，每個水平5 個重復，連續3 d做重復實驗。計算回收率及相對標準偏差。

1.3.4 儀器測定條件

色譜條件：利用Chiralpak IA-3手性柱，柱溫30 ℃，CO2-甲醇（91∶9，V/V）作為流動相，流速為2.2 mL/min，515補償泵的流速為0.45 mL/min，背壓為2 200 psi。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用ESI+多重反應監測（multiple reaction mode，MRM）模式，毛細管電壓為3.5 kV，離子源溫度為150 ℃。以高純氮（純度99.999%）作為錐孔氣和去溶劑氣，去溶劑溫度500 ℃，錐孔氣流速50 L/h，去溶劑氣流速900 L/h，碰撞氣為高純氬氣（純度99.999%），T檢測池內碰撞氣壓力為2×10-3mbar；錐孔電壓為24 V，母離子為m/z 302.2，定量離子為m/z 70.05，定性離子為m/z 123.04，碰撞電壓分別為27 V和35 V。

1.3.5 粉唑醇對映體洗脫順序的確定

利用制備色譜串聯旋光檢測器獲得粉唑醇的兩個光學純單體，即（－）-粉唑醇和（+）-粉唑醇。然后把單體用1.3.4節分離條件進UPCC-MS/MS檢測，得出2個峰。結合參考文獻報道的粉唑醇對映體的絕對構型與旋光性的關系[11]。

1.3.6 EF值計算

手性化合物對映體之間的選擇性變化指標通常用對映體分數（enantiomeric fraction，EF）值表示[12]，計算公式為：

EF值的大小在0～1之間，EF為0.5說明兩個對映體降解速率相同，沒有對映體之間的選擇性。當EF小于0.5時，表明（+）-S-粉唑醇的對映體優先降解，（－）-R-粉唑醇的殘留量高；當EF大于0.5時，表明（－）-R-粉唑醇的對映體優先降解，（+）-S-粉唑醇的殘留量高。樣品中化合物對映體的EF值偏離外消旋體標樣的EF值越遠，表明該化合物的對映體在樣品中立體選擇性行為越明顯。

1.3.7 田間實驗及加工設計

草莓上農藥殘留消解動態實驗：選取沈陽農業大學設施溫室大棚栽培草莓，設置空白實驗區，消解實驗區，每小區設施藥面積30 m2，3 次重復。在草莓生長至一半大小時開始施藥，施藥劑量90 mL/畝（最高推薦劑量60 mL/畝的1.5 倍），施藥1 次，分別間隔2 h和1、3、5、7、10、15、21、28 d取樣。

草莓上農藥殘留加工實驗：每小區設施藥面積30 m2，3 次重復。在草莓距成熟采摘期前3 d開始施藥，施藥劑量300 mL/畝（最高推薦劑量60 mL/畝的5 倍），施藥1 次，3 d后取樣，回實驗室立即加工[13]。

草莓酒加工流程[14-15]：草莓鮮果→?清洗；未清洗→勻漿→加入果膠酶、偏重亞硫酸鉀及酵母→扣蓋發酵，每天攪拌2 次，并取樣（第8天時停止攪拌）→第10天時澄清，將酒渣過濾，澄清液接出，換瓶裝→草莓酒成品，靜置，每天取樣。

1.4 數據分析

所有實驗均至少設置3 個重復。儀器數據采集及分析使用Masslynx NT v.4.1 SCN 882軟件。數據用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，鄧肯氏新復極差法進行半衰期之間的差異比較。用一級動力學方程求粉唑醇各對映體的降解半衰期，計算公式為：

式中：CT為時間T時的粉唑醇對映體的農藥殘留量/（mg/kg）；C0為施藥后的原始沉積量/（mg/kg）；K為消解系數；T為施藥后時間/d。

半衰期（T1/2）計算如下：

2 結果與分析

2.1 方法確證

2.1.1 標準曲線和基質效應

在1.3.4節條件下對粉唑醇進行手性拆分，色譜圖見圖2。高效液相色譜技術的優勢在于高分離度、高靈敏度、高分析速度和低成本。超臨界流體色譜技術以超臨界CO2為主要的流動相，具有黏度低、傳質性能好、分離效率高、綠色環保的優勢。因此UPCC技術集合了兩者的優勢，使得該技術在儀器的可操控性能、重復性、精密度等方面有很大進步。它比液相色譜所使用的液體流動相以及氣相色譜所使用的載氣有更多突出的優點，例如：CO2單獨使用或與少量共溶劑共同使用作為流動相，流體黏度小，比高效液相色譜中所使用的液體流動相擴散率更高、更有利于傳質[16-19]；與氣相色譜相比，CO2單獨作流動相可在更低的溫度下實現分離。因此，在5 min內完成了粉唑醇的手性拆分。

圖2 粉唑醇手性拆分色譜圖Fig. 2 Chromatogram showing chiral resolution of flutriafol enantiomers

粉唑醇外消旋標準溶液質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L和5.0 mg/L，對應各個對映體的標準溶液質量濃度為0.005、0.025、0.05、0.25、0.5 mg/L和2.5 mg/L。在1.3.4節條件下進行測定，以標準溶液質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標作標準曲線，結果見表1。（+）-S-粉唑醇標樣線性方程為：Y＝243 651X－251.02，R2＝0.999 3；（－）-R-粉唑醇標樣線性方程為：Y＝243 141X－317.05，R2＝0.999 1。

表1 在0.005～2.5 mg/L水平下的粉唑醇各對映體溶劑及基質標準曲線Table 1 Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration in the range at 0.005-2.5 mg/L for each enantiomer

歐盟農藥殘留分析質量控制規程中把基質效應定義為樣品中的非待測組分對待測物濃度或質量測定準確度的影響[20]?；|效應的計算方法為：

基質效應具有高變異性，很難被完全消除或者預測[21-22]。本實驗中，粉唑醇的兩個對映體在草莓及草莓酒中有明顯的基質增強效應。一般來說，基質減弱或者增強效應源自內生化合物的不完全去除，如磷脂質、糖類、脂肪酸、酚類等[23]。因此，用外標法基質標曲線校準定量樣品質量濃度更為準確。各對映體在草莓及草莓酒中的基質標曲線方程的相關系數R2均大于0.993 3。

2.1.2 準確度、精密度和靈敏度測定結果

分別在空白草莓和草莓酒樣品中添加0.01、0.1 mg/kg和1 mg/kg的粉唑醇外消旋標準溶液，每個對映體的添加量即為0.005、0.05 mg/kg和0.5 mg/kg，每檔重復5 次，用上述分析方法測定回收率，（－）-R-粉唑醇和（+）-S-粉唑醇在草莓中的平均回收率為86.21%～94.35%，變異系數為1.3%～3.2%（表2）。（－）-R-粉唑醇和（+）-S-粉唑醇在草莓酒中的平均回收率為87.61%～96.19%，變異系數為1.5%～3.5%。本實驗中，（－）-R-粉唑醇和（+）-S-粉唑醇在草莓及草莓酒中的最低檢出限為0.005 mg/kg。

表2 粉唑醇各對映體的添加回收率Table 2 Mean recoveries of flutriafol enantiomers from spiked samples

2.2 消解動態實驗結果

表3 粉唑醇對映體在草莓上的消解動態Table 3 Dissipation dynamics of flutriafol enantiomers in strawberry

粉唑醇在草莓上的田間消解動態實驗結果（表3）表明，兩個對映體在草莓上的消解均符合一級動力方程。（－）-R-粉唑醇在草莓上的消解方程為y＝1.09e－0.05023x，R2＝0.949 63；（+）-S-粉唑醇在草莓上的消解方程為y＝1.08e－0.05095x，R2＝0.962 06。（－）-R-粉唑醇在草莓上的半衰期為13.80 d，（+）-S-粉唑醇在草莓上的半衰期為13.60 d。通過顯著性差異分析半衰

期表明，粉唑醇兩個對映體在草莓生長過程中選擇性降解行為不顯著（P＞0.05）。同時通過EF表明，兩個對映體在設施草莓上沒有選擇性消解行為。植物體內的酶并沒有影響粉唑醇兩個對映體有選擇性降解。手性化合物對映體之間選擇性降解取決于手性環境、植物體內酶等條件的影響[24]。Zhang Hu等[25]研究發現三唑類同類殺菌劑四氟醚唑在草莓上也沒有選擇性降解行為。

2.3 草莓酒加工實驗結果

表4 粉唑醇對映體在草莓酒中的降解Table 4 Degradation of flutriafol enantiomers in strawberry wine

表5 粉唑醇對映體在草莓酒發酵過程中的消解方程和半衰期Table 5 Dissipation kinetics and half-lives of flutriafol enantiomers during strawberry wine fermentation process

粉唑醇兩個對映體在草莓酒中的降解結果（表4）表明，（+）-S-粉唑醇的殘留量低于（－）-R-粉唑醇，（+）-S-粉唑醇優先降解。草莓酒發酵的過程是10 d。在草莓酒發酵過程（10 d）中，兩個對映體的降解均符合一級動力學方程，降解結果見表5。清洗處理后（－）-R-粉唑醇在草莓酒發酵中的半衰期為38.06 d，（+）-S-粉唑醇的半衰期為29.90 d。未清洗處理，（－）-R-粉唑醇在草莓酒發酵中的半衰期為29.31 d，（+）-S-粉唑醇半衰期為22.14 d。

通過顯著性差異分析半衰期表明，粉唑醇兩個對映體在草莓酒發酵過程中選擇性降解行為顯著（P＜0.05）。草莓酒發酵是一個復雜的過程，有研究表明在主發酵期酵母菌為優勢菌群，主發酵結束后酵母菌逐漸衰亡，其他微生物開始生長，總酚和總黃酮含量在發酵前期逐漸上升，后期逐漸下降[26]。因此在草莓酒的發酵過程中，由于有酵母菌的存在，酵母菌會選擇性代謝，對手性化合物產生了選擇性降解行為。Pan Xinglu等[27]研究也發現苯酰菌胺在葡萄酒發酵過程中也存在顯著性選擇性降解行為，R-苯酰菌胺在發酵中優先降解。同時EF值小于0.5也表明（－）-R-粉唑醇殘留量高于（+）-S-粉唑醇，且（+）-S-粉唑醇優先降解。

未清洗處理的草莓酒中，平均殘留量也高于清洗處理時各對映體的濃度。兩個對映體在未清洗處理后草莓酒發酵過程中，降解半衰期要比清洗處理后半衰期短?？赡苁且驗槲⑸锢棉r藥作為N源，農藥濃度大促進了微生物繁殖，從而促進了農藥的降解，因此未清洗處理中農藥降解快。雖然兩個對映體在草莓酒中的降解速率比在草莓中的慢，但是在草莓酒殘留量符合我國對粉唑醇在草莓上的最大殘留限量規定（1 mg/kg）[28]。Lu Yuele等[29]也研究發現苯霜靈在葡萄酒中的降解要比在葡萄上的降解慢很多，苯霜靈殘留能在葡萄酒中維持很長時間。農藥噴施植物一般都直接接觸表皮，所以清洗對去除農藥殘留至關重要。清洗能適當減少農藥在植物體中的殘留[30-31]。

3 結 論

本實驗研究了粉唑醇在草莓中的對映體選擇性消解及草莓酒加工過程中的降解行為，結果表明粉唑醇對映體在草莓生長中沒有明顯的選擇性降解行為，（－）-R-粉唑醇在草莓上的半衰期為13.80 d，（+）-S-粉唑醇在草莓上的半衰期為13.60 d。而在草莓酒的發酵過程中存在明顯的選擇性降解行為，（+）-S-粉唑醇優先降解。在草莓酒發酵過程中，清洗后（－）-R-粉唑醇在草莓酒中的半衰期為38.06 d，（+）-S-粉唑醇的半衰期為29.90 d。未清洗（－）-R-粉唑醇在草莓酒發酵中的半衰期為29.31 d，（+）-S-粉唑醇半衰期為22.14 d。研究結果為未來更準確地對草莓進行風險評估提供了參考依據，提示檢驗、監督等部門在未來食品風險評估中，也應關注從對映體的角度評價手性農藥的安全性。