MKP-1在PTSD樣大鼠海馬組織中表達(dá)改變

邢文龍，劉超猛，王梅子，朱志慧， 張桂青

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是經(jīng)歷異乎尋常的災(zāi)難性創(chuàng)傷事件所造成，以延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在為特點(diǎn)的身心障礙。在最新出版的DSM-5中將核心癥狀修改為：與創(chuàng)傷事件有關(guān)的創(chuàng)傷性體驗(yàn)重現(xiàn)、持續(xù)性回避與創(chuàng)傷事件有關(guān)的刺激、認(rèn)知與心境方面消極改變和警覺(jué)性增高或反應(yīng)性明顯改變，在創(chuàng)傷后開(kāi)始出現(xiàn)或加重[1]，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)生各種表現(xiàn)的具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)是一種雙特異性蛋白磷酸酶，可以使蘇氨酸或酪氨酸殘基去磷酸化，負(fù)向調(diào)控MAPK信號(hào)通路，從而參與了神經(jīng)元及突觸可塑性、神經(jīng)元功能和存活等方面的調(diào)節(jié)[2]。同時(shí)，近期也有研究顯示，MKP-1在抑郁中是一種負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，在抑郁模型的大鼠海馬組織中明顯上升[3]，而且通過(guò)注射升高海馬組織中的MKP-1后，大鼠會(huì)出現(xiàn)抑郁樣行為[4]。然而在PTSD患者中也會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知與心境等方面的消極表現(xiàn)，這是否也與海馬組織中的MKP-1的表達(dá)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)旨在研究PTSD樣大鼠海馬組織MKP-1 mRNA及蛋白表達(dá)與大鼠的行為學(xué)改變和認(rèn)知改變之間的關(guān)系，以進(jìn)一步探討PTSD的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，由新疆疾病控制動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)嚴(yán)格按照石河子大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)定，光照時(shí)間控制在12/12 h ，溫度(21±2)℃，適應(yīng)環(huán)境7 d。

1.2主要試劑山羊多克隆抗MKP-1抗體(英國(guó)abcam公司)；兔抗山羊二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo-fermentas 公司)。

1.3模型制備按照隨機(jī)數(shù)表法將SD大鼠分為Control組、PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組(每組n=6)。PTSD組均采用2005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的SPS模型[5]進(jìn)行造模,依次通過(guò)連續(xù)束縛2 h、強(qiáng)迫游泳、乙醚麻醉3個(gè)步驟進(jìn)行模型制備，造模完成后7 d內(nèi)盡量避免打擾。

1.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)于造模后第8、10、14、21天,分別對(duì)PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組和Control同一時(shí)間段進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。曠場(chǎng)箱為(900 mm×900 mm×500 mm)，箱底部劃分25個(gè)16 mm×16 mm格子，將其置于安靜的環(huán)境中，避免光線直射，通過(guò)紅外攝像機(jī)，記錄大鼠5 min的運(yùn)動(dòng)軌跡，水平得分(也稱為自主運(yùn)動(dòng))，定義為大鼠水平穿越的方格數(shù)，規(guī)定大鼠3個(gè)或4個(gè)爪進(jìn)入同一記為1分；垂直得分(也稱為探索行為)，定義為以2個(gè)后爪支撐身體，2個(gè)前爪離開(kāi)底面，每離開(kāi)一次就記為1分[6]。通過(guò)觀察大鼠的站立次數(shù)、跨格次數(shù)評(píng)判大鼠的行為學(xué)指標(biāo)。

1.5水迷宮實(shí)驗(yàn)分別于9、11、15、22 d對(duì)PTSD 1 d組、PTSD 3 d組、PTSD 7 d組、PTSD 14 d組和Control組進(jìn)行連續(xù)5 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)量各組的空間探索能力；在實(shí)驗(yàn)后的第6 天撤掉Morris水迷宮水下站臺(tái)，測(cè)定大鼠的空間記憶能力。

1.6定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)大鼠海馬組織MKP-1的mRNA水平① 分別于刺激后第15、17、21和28 天，將SD大鼠麻醉后采用斷頭取腦，取出大鼠大腦，迅速剝離獲取海馬組織；② 用TRIzol 法提取海馬組織的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000)測(cè)量總RNA的濃度與純度，當(dāng)260 nm/280 nm在 1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；③ MKP-1基因引物設(shè)計(jì)、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序列為：上游引物：5’-AAGATATGCTCGACGCCTTG-3’,下游引物：5’-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3’；β-actin上游引物：5’-CAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’，下游引物：5’-CGGTGTCCCTTCTGAGTGTT-3’；④ 采用熒光定量PCR試劑盒在64孔 ABI Prism7300 序列檢測(cè)系統(tǒng) (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參基因與目的基因各重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)3個(gè)陰性對(duì)照，建立總體積為20 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min(1個(gè)循環(huán))；95 ℃，5 s ；60 ℃， 30 s(40個(gè)循環(huán))，循環(huán)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s后得到溶解曲線。

1.7Westernblot法檢測(cè)MKP-1的蛋白表達(dá)取大鼠海馬，用研缽研碎，研磨之前用液氮冷卻研缽，在研磨過(guò)程中同時(shí)滴加液氮，充分研磨后加RIPA裂解液，提取出總蛋白。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量總蛋白的濃度，配平后取20 μg蛋白上樣，通過(guò)12%的SDS-PAGE膠電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，用血清封閉2 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃搖床孵育16 h。TBST溶液洗膜后，上二抗(1 ∶10 000)常溫孵育1 h，TBST再次沖洗后移至暗室進(jìn)行顯影。蛋白表達(dá)通過(guò)條帶的灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)格次數(shù)和直立次數(shù)比較PTSD 1 d組、PTSD 3 d組與Control組相比在進(jìn)格次數(shù)和直立次數(shù)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比，進(jìn)格次數(shù)減少，直立次數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2水迷宮定位航行能力比較大鼠在應(yīng)激后分別于9、11、14、21 d行連續(xù)5 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)，在第1～3天,PTSD 1 d、PTSD 3 d、PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比上臺(tái)潛伏時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在4、5 d，與PTSD 1 d、PTSD 3 d組與Control組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比潛伏期時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3水迷宮空間探索能力比較在水迷宮實(shí)驗(yàn)的第6天行空間探索能力比較，穿臺(tái)潛伏期和穿臺(tái)次數(shù)與Control組比較，PTSD 1 d、PTSD 3 d組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d組與Control組相比所需時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4大鼠海馬組織MKP-1mRNA水平表達(dá)PTSD 1 d(0.81±0.17)、PTSD 3 d(1.06±0.39)組與Control組(0.67±0.08)相比大鼠大腦海馬組織的MKP-1 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PTSD 7 d(2.61±0.65)、PTSD 14 d(2.54±0.76)組與Control組相比MKP-1 mRNA的表達(dá)升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5大鼠海馬組織MKP-1蛋白水平表達(dá)Western blot 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTSD 7 d組、PTSD 14 d組MKP-1蛋白表達(dá)較Control組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)直立次數(shù)和進(jìn)格次數(shù)比較

與Control組比較：*P<0.05

表2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

與Control組比較：*P<0.05

圖1 大鼠海馬組織MKP-1的表達(dá)

1：Control組；2：PTSD 1 d組；3：PTSD 3 d組；4 ：PTSD 7 d組；5：PTSD 14 d組；與Control組比較：*P<0.05

3 討論

PTSD是一種發(fā)病機(jī)制不清、病情復(fù)雜多變，治療效果不理想的一種心身障礙疾病，起初是在戰(zhàn)爭(zhēng)后的士兵中發(fā)現(xiàn)的，也成為“戰(zhàn)爭(zhēng)疲勞”，經(jīng)過(guò)對(duì)該疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷嚴(yán)重威脅個(gè)體生命的事件如恐怖襲擊、暴力犯罪和虐待、軍事戰(zhàn)斗、自然災(zāi)害、嚴(yán)重事故等創(chuàng)傷性或危及生命的事件后，也會(huì)出現(xiàn)類似表現(xiàn)。根據(jù)美國(guó)PTSD中心統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)來(lái)看，在美國(guó)PTSD的終生患病率為5%,女性多于男性，女性的患病率約為男性的兩倍，其中PTSD患者中將有30%的人會(huì)有長(zhǎng)期伴隨癥狀[7]。然而近年來(lái)，錯(cuò)綜復(fù)雜的原因引起自然災(zāi)害與人為災(zāi)難頻繁發(fā)生，這些突發(fā)事件對(duì)人體生理上的損害可能會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)痊愈，但是會(huì)對(duì)人們?cè)斐蓢?yán)重而持久的心理創(chuàng)傷。因此PTSD越來(lái)越成為社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)[1]，也成為精神病學(xué)、心身醫(yī)學(xué)和臨床心理學(xué)的研究重點(diǎn)。SPS刺激制造PTSD樣大鼠模型是目前國(guó)際公認(rèn)的最高仿真模型，已廣泛應(yīng)用于PTSD機(jī)制的研究。在本研究結(jié)果中，給予大鼠SPS刺激后PTSD 7 d組、PTSD 14 d組的曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果提示大鼠在經(jīng)受應(yīng)激后緊張度增高，自主行為減少，探索欲望下降，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示大鼠空間探索以及定位定航能力均出現(xiàn)下降的情況，這兩個(gè)結(jié)果提示大鼠在行為、記憶方面出現(xiàn)改變，這與典型的PTSD樣癥狀的特征相吻合[8]。表明本實(shí)驗(yàn)SPS刺激制作創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型是可靠的。

MKP-1屬于促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases,MKPs)家族，通過(guò)去磷酸化作用負(fù)向調(diào)控MAPK(p38、ERK1/2、JUN)的信號(hào)通路，在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡中有著重要作用[9]。Comalada et al[10]研究發(fā)現(xiàn)，MKP-1在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)的中的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、神經(jīng)元發(fā)育等多個(gè)方面。有研究表明，MKP-1使JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路失活，引起微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而影響神經(jīng)元的軸突發(fā)育[11-12]，也可通過(guò)磷酸化和泛素化對(duì)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行控制，影響海馬組織軸突的可塑性和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用(long-term potentiation，LTP)，而LTP是鞏固記憶的重要機(jī)制[13]。也有研究[14-15]顯示 MKP-1 表達(dá)上調(diào)會(huì)通過(guò)負(fù)向調(diào)控 MAPK 信號(hào)，引起 NO 生成減少造成腦血流灌注不足，加重腦組織損傷，導(dǎo)致腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。然而目前國(guó)內(nèi)對(duì)MKP-1在PTSD方面研究的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)從不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MKP-1進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，PTSD 1 d組、PTSD 3 d組中MKP-1 mRNA以及蛋白表達(dá)并無(wú)明顯改變，而在PTSD 7 d組與PTSD 14 d組的MKP-1 mRNA以及蛋白表達(dá)高于Control組，這說(shuō)明SD大鼠在受到SPS刺激后海馬組織中的MKP-1水平是動(dòng)態(tài)波動(dòng)的，出現(xiàn)的緊張度增高，自主行為減少，學(xué)習(xí)記憶能力下降等癥狀也可能與MKP-1水平升高有關(guān)。本研究中全部選用雄性SD大鼠，主要是避免雌性鼠在其性周期中因雌激素水平變化對(duì)MKP-1的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而造成結(jié)果不準(zhǔn)確。