P2X7受體參與疼痛調節機制的研究進展

陸 帆， 傅燕璐， 高銀平，劉榮君， 陳曉薇

(寧波大學醫學院, 浙江省病理生理學技術研究重點實驗室, 寧波行為學重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

疼痛是一種不舒服的感覺和情緒體驗，疼痛是病患尋求醫療幫助最主要的原因之一，疼痛給個人、家庭以及社會帶來巨大的經濟負擔。疼痛的發病機制較為復雜，探究疼痛發病的分子機制，對有效鎮痛藥物的發現有指導意義。目前臨床上疼痛緩解手段有限，因此，新型鎮痛手段的發現將給整個社會帶來巨大福祉。

P2X7受體是配體門控離子型嘌呤能P2X受體的一個亞型, 最早由Keller發現，Rassendren等人首次從大鼠cDNA文庫中克隆出P2X7受體的全長cDNAs。現階段研究表明[1], P2X7受體能通過多種外周及中樞機制參與疼痛的產生和維持，以及嗎啡耐受的過程。本文總結近年來P2X7受體在疼痛相關的臨床及基礎研究中的作用，并深入P2X7受體參與疼痛的調節過程的可能機制。

1 P2X7受體

1.1 P2X7受體的結構與分布P2X7受體基因位于染色體12q24.31位點附近，含有13個外顯子，編碼595個氨基酸組成的多肽鏈。P2X7受體與P2X受體其他亞型有40%左右的同源性，與P2X4受體同源性達48.6%。P2X7受體氨基端N-和羧基端C-在均在胞內。P2X7受體N-端有395個高度保守的氨基酸序列，該末端與P2X7受體作為離子通道的選擇性以及受體與細胞外調蛋白激酶的相互作用相關。P2X7受體C-端較其他P2X受體長，與其他受體無同源性，該末端參與P2X7受體大部分功能，如透化細胞膜。P2X7受體具有兩個跨膜結構域，TM1區和TM2區。P2X7受體TM2區存在β-折疊，被認為與P2X7受體孔隙形成相關。

P2X7受體mRNA廣泛分布于多種組織，如胸腺、脾臟、肺、脊髓和大腦，主要表達于造血譜系細胞，包括單核細胞、巨噬細胞和小膠質細胞等。過去關于神經元中是否有P2X7受體表達存在爭議，近年來得益于更成熟的原位雜交技術，研究人員發現，大鼠大腦不同區域均存在P2X7受體mRNA。電生理學和藥理學技術發現，P2X7受體在神經元中的表達并且在突觸傳遞中的發揮作用。

1.2 P2X7 受體激動劑和拮抗劑P2X7受體受ATP及其衍生物激活。其中，BzATP的激動效能最高，而MeSATP、 α-meATP和β-meATP也可以部分激活P2X7受體。P2X7受體拮抗劑種類較多，包括二價陽離子(如Ca2+、Mg2+和Cu2+)、有機陽離子calmidazolium、P2X7受體單克隆抗體、天然化學藥物如白屈菜紅堿和新型化合物等。近年來，合成的新型分子以其高競爭性及高特異性被基礎研究者廣泛使用。目前常用的P2X7受體拮抗劑有以下幾種，(1) P2受體通用拮抗劑：P2受體通用拮抗劑磷酸吡哆醛 (pyridoxal 5-phosphatemonohydrate，PPADS) 和蘇拉明及其類似物NF279可部分拮抗P2X7受體。亮藍G (brilliant blue G，BBG) 及其類似物對P2X7受體具有較高的拮抗效能。高濃度氧化ATP (oxidized ATP，oxATP) 長時間施用不可逆拮抗P2X7受體；(2) KN-62：喹啉衍生物KN-62對人P2X7受體有很好的抑制效果，但對大鼠P2X7受體離子電流影響不大；(3) 氰基胍衍生物：Abbott Laboratories公司合成的氰基胍類衍生物被證明是具有較高拮抗效能的P2X7受體拮抗劑，如A-740003和A-438079。18～40 nmol·L-1的A-740003即可抑制人和大鼠的P2X7受體。二代氰基胍衍生物A-438079以更好的選擇性和更高的親和力拮抗人和大鼠P2X7受體；(4) GSK類化合物：Glaxo公司開發的GSK類化合物在表達人重組P2X7R的HEK293細胞中對P2X7R具有拮抗作用。

2 P2X7受體與疼痛

根據持續時間，疼痛可以分為急性痛和慢性痛。急性疼痛是指短期存在的疼痛，慢性痛一般指超過正常愈合時間3個月的疼痛。當機體受到傷害(如機械、熱和化學)刺激，疼痛信號沿著A-δ/C纖維從外周傳輸到脊髓，介導感覺神經元釋放ATP，提高背根神經節 (dorsal root ganglion，DRG) 神經元興奮性。ATP激活P2X受體刺激細胞興奮性，增加興奮性氨基酸的釋放，引發一系列傷害性反應，最終可導致細胞凋亡。一些P2受體通用拮抗劑如PPADS和蘇拉明在動物模型上被證明緩解多種類型疼痛。隨著特異性更高的拮抗劑以及抗體的開發，更多的研究表明，P2X3受體、P2X4受體和P2X7受體均不同程度參與調控神經元的興奮性，在疼痛信號傳導中發揮作用。

P2X7基因(P2rX7)顯示高頻率的單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism，SNP)。Sorge等[2]利用全基因組連鎖分析，發現攜帶P451L突變的小鼠比表達P2rX7野生型等位基因的小鼠不容易出現痛覺過敏，提出編碼序列的突變會影響疼痛敏感性。Ursu等[3]的研究發現，P2rX7基因中一些SNP與糖尿病神經性疼痛患者群體中的疼痛敏感性相關，尤其是SNP (rs208294) 和SNP (rs1718119)[3]。東京都醫科大學的研究人員招募了355名受試患者，通過對P2rX7受體基因SNP與疼痛敏感性以及麻醉藥物芬太尼的鎮痛作用聯合分析，發現天然的冷痛敏感性和芬太尼的鎮痛作用與P2rX7中的SNP (rs1718125) 和其單倍型高度相關。Kambur等[4]發現P2rX7SNP (rs7958311) 與接受乳腺癌手術的患者的疼痛強度和耐受性相關。P2rX7SNP與疼痛敏感性的關系暗示了P2X7受體在疼痛中的作用。

2.1 P2X7受體與炎性疼痛炎性痛是指由外周組織損傷而引起炎癥反應時所發生的疼痛。疼痛研究中，常用的炎性痛模型主要有完全弗氏佐劑 (complete freund’s adjuvant，CFA)模型、角叉菜膠炎癥模型和福爾馬林致痛模型。Chessell等[5]發現，在P2X7R基因敲除鼠中，足底給與CFA不能引起小鼠的痛覺過敏。Fulgenzi及其同事也發現類似的現象：P2X7R基因的缺失使得膠原蛋白誘導關節炎模型小鼠以及乙酸誘導的內臟痛模型小鼠沒有表現出痛覺過敏現象[6]。

關節注射CFA明顯降低大鼠傷害感受閾值，增加大鼠后爪神經纖維和血管中P2X7受體的表達，而P2X7受體拮抗劑A-740003施用顯著降低CFA誘導的關節炎模型鼠的炎性疼痛，減少發炎部位P2X7受體的表達。足底注射福爾馬林1 h內會觸發小鼠兩個階段的疼痛行為，第一階段為福爾馬林注射后5 min內，第二階段為福爾馬林注射后20～40 min，研究表明福爾馬林介導的中樞敏化發生在第二階段。A740003和A-438079減少福爾馬林疼痛模型第二階段的自發傷害性行為，暗示P2X7受體參與疼痛的中樞敏化。除了福爾馬林，A438079還緩解由CFA、蜂毒和角叉菜膠等致炎物質誘導的疼痛行為。Itoh等[7]發現，BBG有效緩解芥子油引起的炎性疼痛。GSK314181A的施用劑量依賴性降低角叉菜膠誘導的機械超敏反應，并減輕足爪腫脹[8]。與A438079類似，P2X7受體拮抗劑 oxATP對CFA、角叉菜膠、膠原蛋白、脂多糖和芥子油等誘導的炎性疼痛有較好的抑制效果[6,9,10]。

Clark等[10]認為P2X7受體是通過靶向小膠質細胞釋放IL-1β在疼痛中發揮作用，而多種P2X7受體拮抗劑(A-740003、A-438079和oxATP)的施用均能抑制IL-1β的釋放。有意思的是，鞘內注射A740003或者PANX1抑制劑甘珀酸抑制了足底注射辣椒素誘導的急性傷害感受[11]。最新研究表明，碘乙酸單鈉(MIA)誘導的關節炎大鼠模型模型中，脊髓小膠質細胞中P2X7受體上調，P2X7受體驅動PANX1通道激活，介導促炎細胞因子IL-1β的釋放，拮抗或敲除脊髓小膠質細胞P2X7受體或者阻斷PANX1均有緩解MIA誘導的機械性痛覺過敏[12]。

2.2 P2X7受體與神經病理痛神經病理性痛是指外周神經病變所致的疼痛，目前常用的神經病理痛模型有：坐骨神經慢性壓迫模型 (chronic constriction injury，CCI)，坐骨神經分支選擇損傷模型 (spared nerve injury，SNI)，坐骨神經半結扎模型 (partial sciatic nerve injury，PNL) 和脊神經選擇結扎模型(spinal nerve ligation，SNL)。Chessell 和Fulgenzi的研究發現SNI和SNL無法引起P2X7受體缺失鼠痛覺過敏[5, 6]。PNL手術后，P2X7受體缺陷型小鼠出現痛覺過敏，但該組小鼠痛閾較野生型小鼠高，說明P2X7受體可能部分參與PNL介導的神經病理痛。

P2X7受體拮抗劑A-740003減輕了CCI和長春新堿誘導的神經病誘痛，抑制IL-1β的釋放。A-438079減弱了SNL、CCI和長春新堿引發的神經性疼痛，并且，A-438079的施用還降低了由SNL誘發的脊髓神經元的異常自發放電[13]。鞘內注射A438079，還減輕三叉神經橫斷后小鼠的痛覺過敏并逆轉TNF-α表達水平的增加。與炎性疼痛的結果類似，oxATP的施用緩解了SNL后小鼠的痛覺過敏[6]。亞急性BBG治療完全阻斷了硝酸甘油誘導的偏頭痛模型鼠的痛覺過敏。

小膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統中，以往研究認為，小膠質細胞活化輸出疼痛信號，從而參與神經病理痛。當出現神經損傷時，脊髓背角小膠質細胞中P2X7受體表達增加。通過抑制脊髓背角小膠質細胞中的P2X7受體有效抑制小膠質細胞的活化。

2.3 P2X7受體與癌痛疼痛是癌癥患者的常見癥狀，據統計，59%的癌癥患者會感到疼痛，其中超過三分之一的患者為中度甚至重度疼痛，然而目前50%～80%的癌癥疼痛沒有得到有效的控制。

Zhao等[14]認為P2X7受體在癌癥疼痛中發揮作用，他們的研究發現，P2X7受體缺失的骨癌模型小鼠沒有出現骨癌誘導的疼痛行為。Huang等[15]用BBG有效緩解了骨癌大鼠模型中的疼痛感。Falk等[16]用A839977緩解骨癌痛模型動物早期和晚期疼痛行為。Yang等[17]發現，骨癌模型大鼠模型脊髓小膠質細胞P2X7受體，磷酸化p38 MAPK和IL-18水平均增加，而抑制脊髓P2X7R/p38/IL-18通路減少了骨癌晚期的疼痛行為。阻斷P2X7受體不止可以減少癌癥疼痛，還可以有效抑制腫瘤生長。P2X7受體拮抗劑AZ-10606120引起明顯的腫瘤消退，oxATP顯著抑制B16黑色素瘤小鼠中的腫瘤生長。然而也有研究表明BBG或P2X7R shRNA顯著促進腫瘤生長。因此，P2X7受體很可能參與癌癥介導的疼痛調制過程，但是P2X7受體在腫瘤生長中的作用還需進一步研究。

2.4 P2X7受體與嗎啡耐受嗎啡是臨床上使用最廣泛的強效鎮痛劑之一。然而持續給予嗎啡后，患者對嗎啡產生耐受，具體表現為嗎啡的鎮痛效果減弱，先前的嗎啡劑量不足以抑制疼痛。

多項研究表明，P2X7受體參與嗎啡耐受的形成。慢性嗎啡暴露后大鼠脊髓小膠質細胞中P2X7 受體表達上調，鞘內給與BBG可阻斷P2X7 受體表達的增加并一定程度緩解嗎啡耐受的形成，初步表明P2X7 受體參與了嗎啡耐受的形成。Xiao等[18]靶向腹外側中腦導水管周圍灰質 (ventrolateral periaqueductal grey matter，vlPAG) 注射P2X7受體拮抗劑顯著減輕嗎啡耐受的發展。另外，Cao等[19]靶向vlPAG中P2X7受體的寡脫氧核苷酸也有類似的作用，值得注意的是，在該研究中，P2X7受體是通過激活D-絲氨酸發揮作用。另外，P2X7受體羧基端的酪氨酸Y382-384在P2X7受體參與嗎啡耐受中發揮關鍵作用，靶向作用于該位點可減弱嗎啡耐受。

3 P2X7受體參與疼痛的調制的可能機制探討

3.1 P2X7受體激活PANX1Pannexins蛋白與間隙連接蛋白innexins家族顯示出一定的同源性。Pannexins被認為是連接細胞內和細胞外的跨膜通道，目前鑒定出3種pannexin蛋白，PANX1、PANX2和PANX3，其中PANX1表達最為廣泛。最初Sylvia提供有力的證據表明ATP的釋放由P2X7受體介導，而通道蛋白拮抗劑(carbenoxolone、heptanol)抑制了Bz-ATP誘導的細胞對大分子染料Yo-pro的攝取。Lecovei等[20]進一步證明PANX1參與P2X7受體的功能，并認為P2X7受體不是作為一個獨立的通道，而是一個通道復合物發揮作用。P2X7R-PANX1復合物的下調導致骨細胞對機械負荷不敏感，增加骨骼損害的風險。P2X7R-PANX1復合物可能通過細胞內Ca2+釋放增加毛果蕓香堿誘導的癲癇發作的易感性，暗示復合物可能在體內作為M1受體介導的癲癇發作活動中的負調節劑。另外，這種復合物可能參與先天免疫的早期階段。Pelegrin等[21]觀察到，LPS介導人和小鼠巨噬細胞中P2X7R-PANX1復合物的形成，siRNA和藥理學手段抑制PANX1功能影響IL-1β的釋放，但P2X7R-PANX1復合物在疼痛中的作用尚不明確。

3.2 P2X7受體介導炎癥反應病理狀態下，胞外過量的ATP、酸性成纖維細胞生長因子 (acid fibroblast growth factor，FGF-1) 激活P2X7受體，P2X7受體C末端結構域內的Y 382-384通過蛋白酪氨酸激酶Src家族與PANX1形成復合物，P2X7R-PANX1復合物與IL-1β的成熟與釋放密切相關，P2X7R-PANX1復合物通過激活caspase 1/3調控PRO-IL-1β轉化為成熟的IL-1β。IL-1β激活谷氨酸受體1 (glutamate receptor-1，Glur1)參與一系列生理反應[22]，IL-1β還激活環氧化酶 (cyclooxygenase-2，COX-2) ，介導前列腺素2 (prostaglandin-2，PGE2) 的釋放，揭示了P2X7受體可能通過COX/PGE途徑參與疼痛等厭惡情緒中的調控。P2X7受體與P2X4受體顯示出較高的同源性，有研究顯示P2X4和P2X7亞基可以通過P2X7亞基的C-端相互作用，并且P2X4受體缺失影響P2X7誘導的細胞死亡和IL-1β從巨噬細胞的釋放等作用。P2X7受體還激活P38 MAPK通路介導炎癥反應以及參與疼痛調制過程[23]，P2X7受體通過介導K+和Ca2+的流動調控p38磷酸化[10]，進一步激活小膠質細胞中半胱氨酸組織蛋白酶S (Cathepsin S，CatS)的釋放以及IL-18的釋放，從而參與痛覺過敏。此外P2X7受體激活細胞外信號調節激酶 1/2 (extracellular signal-regulated kinase，Erk 1/2) 途徑，調控腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)[24]，介導細胞增殖分化等生理活動。P2X7受體激活還導致多種炎癥物質的釋放，如激活轉錄因子3 (activating transcription factor 3，ATF3) ，趨化因子 2 (C-C motif chemokine ligand 2，CCL2) ，白介素-6 (Interleukin-6，IL-6) ，中性粒細胞趨化因子-1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1，CINC-1)。也有研究人員認為示P2X7受體在角叉菜膠誘導的機械性痛覺過敏的發展中的這種重要作用是通過依賴于先前釋放的TNF-α，IL-6和CINC-1誘導初級傳入傷害感受器的間接致敏來介導的，但不是通過IL-1β[25]。

3.3 P2X7受體介導的突觸傳遞的變化Lecovei等[20]發現Src酪氨酸激酶參與P2X7受體介導的PANX1的激活，而Src激活NMDA受體是疼痛中樞敏化的關鍵步驟。初級傳入神經的高頻刺激，通過激活P2X7受體 ，釋放細胞因子，觸發了脊髓膠質細胞長時程增強(long-term potentiation，LTP)。有研究表明，神經損傷后, 小膠質細胞表面通過P2X7受體-p38途徑釋放微小囊泡即微泡 (microvesicles，MVs)。微泡一方面通過釋放IL-1β參與炎癥反應，另一方面釋放神經遞質影響突觸后膜的興奮性從而調控細胞的生命活動[15]。另外有研究發現，小膠質細胞中P2X7受體參與脊髓C-纖維誘發電位的長時程增強，而P2X7受體拮抗劑oxATP或BBG，可阻止脊髓LTP的誘導，并減輕機械性痛覺過敏。高頻刺激C-纖維通過P2X7偶聯的PANX1通道介導ATP，D-絲氨酸，谷氨酸等從膠質細胞中釋放，繼而誘導傷害性突觸的LTP。

4 總結與展望

ATP是生命體重要的能量物質，同時也是痛覺傳遞中重要的信號分子，P2受體可能成為治療疼痛的靶點。近年來大量的P2X7受體拮抗劑被合成，并且都表現出較好的藥物特性，為P2X7受體在疼痛領域得以開展奠定基礎。研究表明，P2X7受體介導炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等的釋放，拮抗P2X7受體能抑制炎癥。然而，很少有報道稱P2X7受體介導中樞神經系統炎癥反應，P2X7受體在中樞炎癥中到底發揮何種作用作用還不完全清楚。目前關于P2X7受體的研究集中在外周和脊髓水平，P2X7受體參與疼痛的研究還停留在疼痛信號傳入的低位中樞階段。以往研究表明，大腦中前扣帶回，島葉甚至海馬參與疼痛情緒調控，這些過程是否有P2X7受體的參與還鮮有報道。總之，P2X7受體在炎癥的產生和發展以及疼痛過程中起重要作用，闡明P2X7受體在疼痛信號調節過程中的作用，對于鎮痛藥物的發現以及鎮痛手段的革新具有一定的指導意義。