Ezrin的生物學功能及其對腫瘤轉移的影響研究進展

丁語石，余蘇云，王 蔚，黃 帥，李曉曼，陳文星,2，王愛云,2，陸 茵,2，吳媛媛

(南京中醫藥大學 1. 藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2. 江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

Ezrin是細胞骨架的組織者，在機體中分布廣泛，并且其在細胞結構中特殊的定位就好比一個“腳手架”，可以通過組合出膜蛋白-Ezrin-細胞骨架蛋白復合體，參與許多細胞的生物學過程。在腫瘤細胞中，Ezrin的表達、磷酸化水平和亞細胞定位與腫瘤轉移密切相關，大量的實驗數據表明，Ezrin可以通過多種途徑影響腫瘤轉移的不同階段。本文就Ezrin的生物學功能以及其在腫瘤轉移過程中的最新研究進展進行綜述。

1 Ezrin的結構與分布

ERM家族蛋白是細胞質膜與細胞骨架之間的關鍵連接蛋白，在協調跨膜蛋白、膜磷脂和細胞骨架之間的相互作用，以及維持細胞結構完整性中發揮著重要的作用[1]。因此，ERM蛋白參與許多生理以及病理學狀態下的細胞生命活動調節，如細胞遷移、細胞增殖、細胞黏附、細胞骨架重塑以及腫瘤細胞的轉移侵襲等。

Ezrin是ERM蛋白家族中最早被發現的，ERM在進化過程中高度保守，所以該家族的所有成員之間具有相同的FERM(F for 4.1 protein，E for ezrin，R for radixin and M for moesin)結構域(位于氨基端)和F-肌動蛋白結合位點(位于羧基端)[2]。Ezrin的羧基端(C-ERMAD)包含肌動蛋白的結合位點，可以與氨基端(N-ERMAD)的FERM結構域或肌動蛋白結合[3]。Ezrin的FERM結構域可以與許多膜蛋白直接連接，也可以通過銜接蛋白EBP50(ERM binding protein 50)間接與其他膜蛋白連接，進而間接地與細胞質膜連接。正是由于Ezrin可以直接或間接與其他蛋白相互作用，這為其后續發揮生理功能，影響腫瘤轉移提供了生物學基礎。Ezrin存在開放(激活狀態下)與關閉(未激活狀態下)兩種蛋白構象，在未被激活時，Ezrin的C-ERMAD可以與它本身或者其他ERM家族成員的FERM結構域結合，形成單體或同/異源二聚體，使得肌動蛋白以及其他膜受體結合位點被包裹在內部而不能發揮功能[2]。Ezrin的FERM結構域在與細胞質膜上磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)結合后會改變構象(激活狀態)，暴露出其C-ERMAD的蘇氨酸、酪氨酸等磷酸化位點，并發揮其相應生理學功能。Ezrin通常分布在正常細胞中微絨毛、偽足、細胞有絲分裂溝，以及正在發生阿米巴運動的細胞前沿這些肌動蛋白集中的區域，而在不同的腫瘤細胞中，Ezrin以及磷酸化的埃茲蛋白(p-Ezrin)的分布則有很大的差異，在某些高轉移性腫瘤，如胰腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、結腸癌、子宮內膜癌中，Ezrin異常的高表達且磷酸化水平上升，但在食管鱗狀細胞癌中低表達。值得注意的是，與不能發生遠端轉移的食管上皮細胞癌SHEEIMM相比，能發生遠端轉移的SHEEMT細胞Ezrin蛋白表達水平更高。在發生轉移的胃癌細胞MKN-1中，Ezrin在細胞質膜與胞質中均有分布，而在未轉移的MKN-1細胞中，Ezrin主要定位于胞質中。

2 Ezrin的生物學功能

Ezrin不僅僅是細胞骨架的組織者，它也參與許多細胞信號傳導過程。Ezrin的C-ERMAD具有Thr567、Th235、Tyr353、Ser66等磷酸化位點。這些磷酸化位點可以被許多不同的信號通路調節，在激活并磷酸化后發揮不同的生理功能。Ezrin與其磷酸化形式在形成特殊的膜結構(如微絨毛、板狀偽足、絲狀偽足等)，維持細胞形態，調節細胞運動，調控某些膜蛋白的胞內運輸中扮演重要角色。

2.1 Ezrin參與形成微絨毛結構Ezrin在機體中的分布十分廣泛，并且其在細胞結構中具有特殊的定位，可以組合出膜蛋白-Ezrin-細胞骨架蛋白復合體，通過綁定F-actin肌動蛋白進行骨架的拆裝，調節細胞的骨架結構，并發揮各種生理功能。Ezrin與一些細胞表面黏附分子，如CD44、E-cadherin、ICAM-1等結合，可以將細胞外基質與F-actin細胞骨架“橋接”起來，調節細胞的形態與遷移。例如，上皮細胞的微絨毛形成就需要Ezrin的局部激活，這是一個十分復雜的過程。Ezrin在與PIP2結合后，其構象發生改變，隨后淋巴細胞定向激酶(lymphocyte oriented kinase，LOK)的氨基端結構域可以進入距離共有序列40個殘基處的位置，使部分蘇氨酸殘基磷酸化，進而使得LOK的羧基端準確楔入Ezrin的C-ERMAD與FERM結構域之間的區域，激活Ezrin的T567磷酸化位點，最終促進細胞骨架的定向趨化，形成微絨毛結構[4]，可見Ezrin對于細胞質膜形態的調控是非常精密的。

2.2 Ezrin參與調控機體水平衡Ezrin可以通過細胞骨架網絡的動態調控，參與水通道蛋白-2(water channel aquaporin-2，AQP2)的運輸和分布。AQP2是一種在集合管主細胞中表達的，維持機體水平衡的重要水通道蛋白，可以響應加壓素，進而在細胞質膜上聚集，提高細胞的水通透性。Ezrin與AQP2在集合管主細胞中共定位，研究發現[5]，在加壓素作用下，Ezrin和AQP2可以分別從細胞質區域和近頂端區域重新共定位到MDCK細胞的頂端，說明Ezrin可以通過N-ERMAD的FERM結構域，與AQP2的羧基端直接作用，來增強AQP2的內吞，減少AQP2在細胞質膜上的分布。Ezrin與AQP2的直接相互作用提示動態的肌動蛋白細胞骨架網絡參與了AQP2的運輸，可以間接影響細胞的水通透性。

2.3 Ezrin參與調控B細胞免疫應答B細胞的形態以及B細胞抗原受體(B cell receptors，BCRs)的擴散對于BCR信號傳導至關重要。Ezrin的去磷酸化可以通過調控絲狀偽足的形成，改變B細胞的形態。不僅如此，與肌動蛋白細胞骨架在細胞形態穩態中的作用類似，Ezrin還可以與肌動蛋白形成緊密的網絡連接，限制BCRs的運動，并減緩其擴散速率。研究發現[6]，Rictor(mTORC2的重要組成部分)調控BCR信號轉導是通過Ezrin介導的，Rictor的缺失會導致Ezrin去磷酸化失調，使得Ezrin與肌動蛋白聚集增加，形成致密網絡，限制BCRs的移動與聚集，進而影響BCR信號傳導，抑制感染期間的B細胞免疫應答。由此可見，Ezrin在正常細胞的生物學功能調控中是不可或缺的。

3 Ezrin與腫瘤轉移的關系

近年來，大量的實驗結果已經證實，Ezrin與許多腫瘤的發生、發展存在密切的聯系。考慮到Ezrin的亞細胞定位，以及其“腳手架”般的功能，許多研究工作都在嘗試揭開Ezrin在腫瘤轉移過程中的神秘面紗，不單單影響腫瘤細胞的轉移的某一階段，大量的實驗數據表明，Ezrin可以通過多種途徑影響腫瘤轉移的不同階段。

3.1 Ezrin對腫瘤細胞運動性的影響細胞運動是機體發育、上皮分化以及免疫反應中的必需過程，同時也是腫瘤細胞侵襲期間的必需過程，腫瘤細胞的運動能力直接影響其轉移特性。腫瘤細胞采用不同侵入性運動模式，通過改變細胞骨架組織，適應組織環境和基質特性，其中包括基于肌動蛋白的突起和膜動力學提供的運動能力進行細胞形狀的改變。腫瘤細胞可以通過細胞質膜起泡(belbbing)運動，進行快速的單細胞移動，輔助其轉移。腫瘤細胞在低整合素黏附條件下，會發生內吞死亡(entosis)，導致癌細胞非整倍性(aneuploidy)，從而促進腫瘤進展。據報道[7]，肌動蛋白介導的MRTF-SRF軸可以激活Ezrin的轉錄，增加其在細胞皮質中的含量，促進肌動蛋白的重新組裝，以輔助單細胞的起泡收縮運動。通過這一途徑可以促進腫瘤細胞間的起泡內吞，進而促進腫瘤轉移過程。

3.2 Ezrin與膜蛋白相互作用對腫瘤細胞轉移的影響許多與腫瘤密切相關的膜蛋白可以與Ezrin的FERM結構域的連接，讓Ezrin成為腫瘤轉移的“幫兇”。平足蛋白(podoplanin)是一種細胞膜表面黏蛋白樣小蛋白，其與腫瘤轉移密切相關，平足蛋白要想發揮其生物學功能就必須與其他蛋白發生相互作用。平足蛋白可以通過Ezrin與肌動蛋白細胞骨架連接，有研究發現，在鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)中，Ezrin可以輔助平足蛋白環的組裝，促進絲狀偽足的形成，促進SCC13細胞的轉移入侵[8]。CD44作為一種細胞膜表面的多功能糖蛋白，盡管它可以調節淋巴細胞活化，但它也參與腫瘤的惡性轉變和轉移過程。CD44主要作為透明質酸的受體，并與其他配體相互作用，如骨橋蛋白、膠原蛋白、基質金屬蛋白酶等。除此之外，CD44還可以通過與Ezrin結合改變細胞的形態，進而促進腫瘤細胞的黏附與轉移。據報道[9]，在肝癌細胞中，膽固醇可以促進細胞質膜上脂筏的形成，這讓CD44能更多地固定到脂筏上，并使得其與Ezrin相互作用減少，最終導致肺部轉移結節減少。還有研究發現，潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)的過表達可以上調NP69細胞的Ezrin磷酸化水平，促進Ezrin在細胞膜處聚集，并與F-actin和CD44結合，促進鼻咽癌細胞轉移侵襲[10]。鈣結合蛋白家族的成員A7(Annexin 7)主要定位于細胞質中，使用shRNA將淋巴轉移性強的小鼠肝癌細胞Hca-F中A7敲減，可以降低其轉移侵襲能力。有研究發現[11]，在A7高表達的Hca-F中，Ezrin的表達受到抑制，并且主要定位于胞質中，這提示A7可能通過與F-actin激動蛋白結合，影響Ezrin的膜定位，進而影響Ezrin對于細胞遷移侵襲能力的作用。

3.3 Ezrin的異常表達、磷酸化以及亞細胞定位對腫瘤轉移的影響很多研究都提示，Ezrin的表達、磷酸化以及異常的亞細胞分布與許多惡性腫瘤密切相關，但Ezrin的具體調控過程卻較少報道。

3.3.1Ezrin的異常表達以及磷酸化對腫瘤轉移的影響 盡管在不同腫瘤組織中，Ezrin的mRNA水平和蛋白水平具有差異，但相較正常組織，其在多種腫瘤中仍呈現高表達態勢。有研究發現，使用Ezrin的抑制劑NSC668394可以明顯抑制小鼠骨肉瘤的肺轉移[12]，以及小鼠E0771乳腺癌細胞的淋巴結轉移[13]。在食管鱗狀細胞癌KYSE150細胞中，敲減L1細胞黏附分子(L1 cell adhesion molecule，L1-CAM)，使得Ezrin的表達減少，并且影響KYSE150的轉移侵襲。那么，調控Ezrin異常表達的上游又是什么呢？相關的研究表明[14]，L1-CAM可以通過激活Integrin β1/ERK/MAPK/API信號軸，上調Ezrin基因轉錄。還有研究指出，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)刺激過的小鼠黑色素瘤細胞B16F1的Ezrin mRNA及蛋白水平明顯上升，并且在體內實驗中，可以使肺部轉移結節增加，其機制是由于HGF/Met信號通路下游的MAPK激活轉錄因子Sp1，進而使得Ezrin的轉錄與表達上調，促進黑色素瘤細胞轉移[15]。

Ezrin的磷酸化對于其在腫瘤轉移過程中發揮功能也十分重要,許多研究發現[16]，Ezrin的磷酸化水平與腫瘤細胞的轉移侵襲能力呈正相關。Ezrin的Tyr353位點磷酸化受PI3K/Akt信號通路調控，可以影響鱗狀細胞癌的上皮間質轉化過程。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)可以激活Ezrin的Ser66磷酸化，促進其招募至近細胞質膜處，使得食管鱗狀細胞癌細胞KYSE150的絲狀偽足數量增加，長度增長，進而導致KYSE150的局部組織入侵以及淋巴轉移能力增強[17]。

3.3.2Ezrin的亞細胞定位對腫瘤轉移的影響 不僅僅Ezrin的表達與磷酸化水平與腫瘤細胞的轉移能力呈明顯正相關，許多研究還發現，Ezrin的亞細胞定位對于腫瘤轉侵襲能力影響也很大。與正常肺組織相比，非小細胞肺癌患者組織樣本的Ezrin和p-Ezrin表達明顯升高，且Ezrin與EzrinTyr353(Tyr353位點磷酸化的Ezrin)主要分布在胞質中，而EzrinThr567主要分布于細胞質膜[18]。Ezrin在高淋巴轉移性的小鼠肝癌細胞(Hca-F)中表達比轉移性低的Hca-P細胞高，并且在Hca-F細胞中，Ezrin主要定位在細胞骨架，而在Hca-P細胞中，Ezrin主要定位在細胞核中[11]。

3.4 Ezrin對于腫瘤轉移的不同階段的影響腫瘤轉移是十分復雜的過程，包括原位腫瘤細胞的去分化、入侵局部正常組織、血管或淋巴管的內滲、血行轉移、外滲出血管并在遠端組織器官形成轉移灶，以及最終定殖等過程。關于抑制Ezrin的表達或者其磷酸化水平可以抑制腫瘤細胞的轉移侵襲能力，這方面的相關研究較多，但Ezrin作用于腫瘤細胞轉移侵襲的哪一具體環節，在某一轉移環節中發揮怎樣的功能，以及如何發揮功能的相關研究仍然較少。

3.4.1Ezrin影響腫瘤轉移前微環境 腫瘤的轉移前微環境對于其轉移有著重要影響[19]，在腫瘤轉移這個復雜過程的伊始，腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblast，CAF)扮演著重要的作用。有觀點認為，CAF在輔助腫瘤細胞轉移到遠端的過程中會獲得一些能更好協助腫瘤細胞轉移到遠端部位的特征，從而轉變為轉移相關成纖維細胞(metastasis associated fibroblast，MAF)。研究發現，將CAF與BRCA1缺失的人乳腺癌細胞HCC1937的條件培養基共培養，可以使得CAF的Ezrin mRNA表達水平增加30倍，并獲得更強的輔助腫瘤細胞轉移侵襲能力[20]。

3.4.2Ezrin影響上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) EMT賦予腫瘤細胞能夠導致轉移，形成后續過程所需的一些特性，但其對于外滲過程后期的影響仍未得到充分研究。在EMT過程中，細胞會失去細胞間緊密接觸，E-cadherin表達增加，vimentin表達減少，呈現間充質細胞特性，從而促進腫瘤細胞的轉移侵襲。研究發現，在EGF的刺激下，Ezrin的磷酸化水平上調(Thr567和Tyr353)，激活NF-κB，使得IκBα磷酸化p65入核，進而促進骨肉瘤細胞MG63和U20S的轉移[21]。在結直腸癌SW480、SW116[22]以及舌鱗狀細胞癌SCC9、SCC25的異種移植瘤模型[16]中，可以得到相同的結論。

3.4.3Ezrin影響腫瘤細胞極性 正在發生轉移的腫瘤細胞會有不同的“極性”特征，如在已形成的原位或轉移灶部位的“頂端-基底”極性和轉移中的“前-后”極性。目前有觀點認為，Ezrin與血行轉移過程中腫瘤細胞的“極性”有關，這種所謂“極性”是細胞骨架、細胞質膜以及一些膜上受體朝某一方向的趨化和聚集形成“極點”的現象，而非研究較多的板狀偽足或絲狀偽足。研究發現[23]，單細胞狀態下，人黑色素瘤細胞SKMel2以及胰腺癌、乳腺癌患者腹水和胸腔積液中的腫瘤細胞，均表現出Ezrin與F-actin細胞骨架在細胞的“極點”聚集的現象，并且這種“極化”可以促進腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的緊密接觸，進而影響后續轉移過程。

3.4.4Ezrin影響腫瘤細胞外滲過程 腫瘤細胞在進入遠端組織的實質前，要經歷外滲過程。在外滲期間，腫瘤細胞必須對于物理不對稱外界黏附條件進行響應，這就導致肌動蛋白細胞骨架的重構以及細胞內蛋白質的不均勻或極化分布。細胞表面的足細胞標志蛋白(podocalyxin，PODXL)是間充質乳腺癌和胰腺癌細胞外滲的關鍵分子。研究表明[24]，PODXL的胞內結構域可以與Ezrin直接結合，使得外滲腫瘤細胞皮質極化，啟動其跨內皮遷移(trans-endothelial migration，TEM)過程，促進其外滲。在此過程中，Ezrin可以將腫瘤細胞由非極化的圓形形態轉變為極化的外滲形態。此外，Ezrin還可能與S100P存在某種相互作用，影響腫瘤細胞的TEM過程。有報道表明[25]，三陰性乳腺癌患者的Ezrin與S100P表達水平與預后呈明顯負相關，Ezrin siRNA可以使得MFM-223細胞TEM能力下降。

4 總結與展望

綜上所述，Ezrin不僅僅在正常細胞的生理學過程中扮演重要角色，其異常的表達水平、磷酸化以及亞細胞定位，在不同腫瘤以及腫瘤轉移的不同階段起到不可以或缺的作用。但目前針對Ezrin與腫瘤轉移的相關研究尚未聚焦到Ezrin在轉移的各個階段的具體作用，也沒有深入闡明其在腫瘤轉移過程中的具體機制。與之前研究較多的細胞阿米巴運動不同，近期的一些研究發現，腫瘤細胞在轉移過程中會出現各種各樣的“極化”現象，表現出不同的“極性”。Ezrin作為連接細胞質膜和細胞骨架的關鍵使者，其是否影響腫瘤細胞“極化”過程，不同轉移階段，其對于細胞“極性”的影響是否相同，具體機制是什么，這些問題應該是后續研究者關注的重點之一。相信隨著對Ezrin的深入研究，Ezrin在腫瘤轉移不同階段的影響機制會逐漸闡明，或許Ezrin能成為轉移相關的關鍵分子標志，為腫瘤的臨床治療提供更多途徑。