當歸頭與尾阿魏酸代謝模式研究初探?

楊 杰，張 瑜，萬 斌，范光忠，彭啟倫

(1.畢節醫學高等?？茖W校，貴州 畢節 551700； 2. 重慶醫藥高等?？茖W校，重慶 401331； 3. 重慶市中醫院，重慶 401331)

當歸作為“血中之圣藥”，不同藥用部位的功效明顯不同，但是不同藥用部位臨床療效差異的科學依據，尚待深入揭示。我們認為，當歸頭與尾功效差異源于次生代謝產物含量的差異，次生代謝產物含量差異源于酶含量與活性差異，而酶活性差異的根本原因是相關基因群的差異表達?；谠撗芯克悸?，由于當歸頭與尾阿魏酸含量差異被相關文獻數據證實，并結合課題組前期研究基礎，因此本文以當歸主要活性成分阿魏酸的代謝調控為切入點，深入探討當歸不同藥用部位藥效成分代謝調控的生物學機制。

1 當歸頭、歸身、歸尾功效不同臨床運用考究

當歸不同部位入藥的功效差異被廣泛闡述，尤以李東恒“頭止血而上行，身養血而中守，梢破血而下流，全活血而不走”之描述最為精辟。明代著名醫家李時珍指出：“治上用頭，治中用身，治下用尾，通治全用”，對當歸不同部位功效差異做出了重要論斷，后世醫家對此有所發揮。如治療中風后遺癥的補陽還五湯(《醫林改錯》)以歸尾活血，有祛瘀而不傷血之妙；仙方活命飲(《校注婦人良方》)用歸尾解毒化瘀；血府逐瘀湯配以歸尾益氣活血，通竅明目；犀角地黃湯以歸尾破血逐邪，俾瘀血破而邪熱透[1-4]。因此，當歸不同藥用部位的功效差異，具有重要的臨床意義。

嚴輝等[2]應用中藥方劑數據庫挖掘當歸不同入藥部位藥性特點及其適應癥的變化規律，發現歸尾主要應用于活血(52.2%)，歸頭因臨床應用方少而功效取向性不明顯；當歸頭與尾功效差異主要表現為活血功效，而活血差異源于活血藥效成分含量的差異，如阿魏酸、藁本內酯等。阿魏酸是當歸主要水溶性活性成分，常作為當歸質量鑒定的標志性化合物，具有抑制血小板聚集、抗血栓及心臟保護等藥理活性[5-7]。因此，當歸頭與尾功效差異與主要水溶性活性成分阿魏酸含量差異密切相關。

2 當歸不同部位、不同生長期的藥效成分譜存在明顯差異

2.1 當歸不同部位藥效成分譜差異懸殊

已知當歸藥效成分包括揮發油成分、水溶性成分、微量元素等類型近100種。當歸頭與尾功效差異源于藥效成分譜差異。吳國霞等[8]采用HPLC-MS分析全當歸、當歸頭、當歸身及當歸尾所含化學成分，并定性鑒定出色氨酸、綠原酸、阿魏酸等8種當歸藥用成分，其相對含量在當歸不同藥用部位中存在顯著差異。裴建云等[9]應用GC-MS聯合技術檢測，然后采用正交投影法分別定性鑒定出67種當歸揮發油化學成分，其含量比較差異有統計學意義。吳國霞、楊秀娟等[10]采用HPLC及分光光度法測定阿魏酸含量，建立基于灰色關聯度模型的當歸不同藥用部位的質量評價模式，并發現當歸尾相對關聯度為0.576，高于當歸身和當歸頭樣品。上述研究采用不同分析方法，從不同角度證實當歸頭與尾藥效成分譜存在較大差異。

2.2 當歸藥效成分譜在不同生長時點存在明顯差異

當歸屬傘形科多年生草本植物，其藥效成分的形成與當歸生長期密切關聯。楊應文等[11]應用1H-NMR法研究當歸多糖、阿魏酸和藁本內酯等3種當歸活性成分隨生長過程的相對含量動態變化，發現第1年變化比較平穩，在第2年和第3年變化比較快速。肖宇奇等[12-13]采用HPLC法分析不同生長期當歸化學成分的動態變化，發現在傳統的采收期水溶性成分阿魏酸含有量最高，而Z-藁本內酯等揮發油成分的含有量并不比其他生長期高，提示當歸次生代謝產物的積累與生長周期相關。上述成果為進一步揭示當歸阿魏酸代謝模式、提高藥材品質提供了有力依據。

3 當歸阿魏酸代謝調控與酶活性密切相關

阿魏酸是桂皮酸的衍生物，以水溶態、脂溶態和束縛態等3種狀態存在。水溶態阿魏酸存在于植物細胞質中，與單糖、多胺等小分子物質結合呈易溶態；脂溶態阿魏酸與甾醇等脂溶性物質結合，主要存在于植物表面蠟質層中；束縛態阿魏酸以酯或醚的形式，與多糖、木質素等細胞壁物質相結合。阿魏酸是廣泛存在于植物界的一種酚酸，在當歸、川芎等中藥材中含量豐富，在咖啡、谷殼、玉米皮之中也含量較高。阿魏酸為當歸、川芎等中藥材的主要活性成分，中國藥典將其作為這些藥材質量評價的主要指標。

阿魏酸廣泛用于藥品、食品、化妝品，對其次生代謝產物的調控機制研究，具有重要的學術意義與應用指導作用。PB路徑是阿魏酸、木質素、桂皮酸、查耳酮等藥效成分合成與降解的主要網絡。與阿魏酸代謝密切相關的PB子路徑主要有2條：由苯丙氨酸經苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、桂皮酸-4-羥化酶(C4H)合成咖啡酸和阿魏酸，阿魏酸又可經阿魏酸-5-羥化酶(F5H)代謝成5-羥阿魏酸[14-15]；阿魏酸經4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)、桂皮酰-輔酶A還原酶(CCR)等作用，生成松伯醛和松伯醇，最終生成木質素[15-17]。第一條路徑可生成咖啡酸和阿魏酸等活性物質，咖啡酸具有抗炎和免疫調節作用，阿魏酸具有抗血栓等作用；第二條路徑產生松伯醛、木質素等無藥理活性物質。應用分子生物學技術，可抑制PB路徑下游的阿魏酸分解酶，使阿魏酸超量積累而又不增加木質素(灰分)含量，進而提高當歸、川芎等藥用價值。

4 當歸頭與尾轉錄組研究處于起步階段

4.1 當歸的基因組研究可追溯到當歸品種的分子鑒定

2003年，張西玲等[18]通過測序技術建立甘肅當歸種子rRNA基因圖譜，揭開了基因水平研究當歸品質及分子藥效作用序幕。于光等[19]用cDNA-AFLP等技術分析岷歸花蕾與發芽枝條頂端分生組織中的差異表達基因，發現DNA結合轉錄因子、山梨醇-6-磷酸脫氫酶等參與岷歸抽薹的分子調控。閻夢穎等[20]利用DNA條形碼trnL-F以及ropC1序列對當歸及其混偽品進行鑒別。

4.2 當歸頭與尾差異表達基因已初步揭示

本課題組[21-22]率先采用Illumina HiSeq 2000高通量測序平臺，對岷縣當歸采收期之歸頭與歸尾完成轉錄組學比較研究，獲取了63585個當歸功能基因序列(unigenes),并發現當歸頭與尾基因表達存在明顯差異。通過與UniProt蛋白數據庫進行blastx比對，發現已注釋的當歸基因序列主要分布于目前研究較深入的葡萄、毛果楊、大豆、苜蓿、擬南芥等7種重要經濟作物中，為闡明栽培當歸的起源物種提供了理論依據。本研究識別了與當歸重要藥效物質(阿魏酸、當歸多糖、當歸總黃酮等)生物合成相關的基因序列，初步揭示了與當歸補血、活血物質及部分代謝路徑調控相關的基因序列。該階段性研究成果表明，Illumina HiSeq 2000等轉錄組測序技術，可用于探測諸如當歸等基因組研究缺乏物種的功能基因及其網絡調控模式[21-25]。

4.3 當歸不同部位阿魏酸代謝及PB路徑基因群呈時空表達性

本課題組研究了采收期當歸根的轉錄組特性，發現當歸根的差異表達基因與PB路徑相關，生物信息學分析發現，采收期當歸根部表達的127、69、70個unigenes分別映射到PB生物合成、N-聚糖生物合成、黃酮類生物合成等路徑，可能參與阿魏酸、當歸多糖、當歸總黃酮的生物合成及代謝調控[21-22]。雒軍等[25]發現，PAL酶的編碼基因在當歸葉片中的表達量是當歸根部的7.5倍，并對當歸COMT酶編碼基因序列進行了生物信息學分析[26]。溫隨超等[27]發現，4CL酶編碼基因在當歸幼苗中的表達具有明顯的時空表達性。雖有起步，但當歸眾多PB路徑關鍵酶的基因結構與功能特征仍不清楚，PB等路徑在長達5個月的當歸成藥期的動態表達模式與調控規律亟待闡明；歸頭、歸尾與當歸地上等部分的PB路徑基因群動態表達與調控模式，及其與藥效成分的動態積累模式交互作用機制有待揭示。

4.4 當歸活性成分代謝及其調控基因研究有待于進一步探索

參與阿魏酸等近100種當歸活性成分合成與分解的酶及其基因結構與功能研究，仍處于起步階段[21-22]。轉錄組學所獲得的大量unigenes仍欠缺完整的基因全長序列信息，藥效相關次生代謝產物的基因調控及其調控機制尚待闡釋，代謝相關基因與環境脅迫性、藥材道地性之間的關聯性仍需深入研究。僅就轉錄組學研究而論，本課題組的研究亦不十分完整。眾所周知，岷縣當歸成藥期分為莖生長期、根膨大期和采收期等3個生長時期；在長達5個月的藥效成分積累之中，當歸頭與尾連續發生復雜而精巧的轉錄組學變化，各時期均對阿魏酸等藥效成分代謝產生重要影響。

5 RNA-seq、RACE等轉錄組學技術有助于當歸現代化研究

5.1 RNA-seq等技術快速引入中醫藥研究，并不斷取得重要成果

轉錄組學是一門在整體水平上研究基因轉錄及其調控規律的學科，是研究細胞表型和功能的重要手段?；贗llumina HiSeq 2000等高通量測序平臺的轉錄組測序(RNA-seq)賦予了生命科學研究人員超強的覆蓋度和靈敏性，能夠更加準確、快速地提供更多的生物體轉錄信息,在中醫藥領域的應用日益廣泛[21-27]。陳士林等[28-31]采用高通量測序技術，對人參、西洋參、三七、柴胡、天麻、東北紅豆杉、銀杏、喜樹、丹參等主要藥用植物完成大規模轉錄組研究，發現200多個參與生物堿、萜類、黃酮、酚酸類骨架合成相關的酶基因，及2000多個參與上述化合物骨架修飾的修飾酶候選基因。孫同玉等[23]從高通量測序得到的unigenes基因注釋信息中，挖掘出與赤霉素代謝相關基因PqGA2ox的編碼區序列，有助于深入西洋參種子解除休眠的分子機制。張紹鵬等[32]對珍稀藥用植物珠子參藥用部位進行轉錄組測序,確定其與三萜皂苷合成代謝相關的候選基因，對于闡明人參皂苷合成方式提供了重要的研究基礎。通過轉錄組測序來挖掘藥用植物特有生物合成關鍵酶的基因，解析其生物合成機制，已成為當前中藥材功能基因研究的發展趨勢之一。

5.2 RACE技術是較為可靠的獲取基因編碼區序列的實用技術

運用RNA-seq 等獲得的unigenes通常是小于700 bp的基因片段，而非完整的基因編碼序列。欲從轉錄組研究結果之中獲得完整的基因編碼序列，通?？蛇x擇以下策略：將轉錄組的unigene與數據庫中該物種EST序列組裝(電子克隆)；對于已完成基因組測序的物種，如擬南芥和水稻，可直接將感興趣的unigene與參考基因組進行比對，以獲取該基因的全部信息，進一步分析其可能的轉錄本序列；采用cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE)，可有效地延伸unigene所缺的5′端或3′端序列。前兩種方法實施的前提是，所研究對象的基因組學信息豐富的物種。但是，當歸、人參等絕大多數藥用植物屬于非模式物種，基因組與核酸序列信息較少，電子克隆或直接比對的方法并不適用，RACE技術則是較為可靠的獲取藥用植物完整的基因編碼區序列的實用技術。

5.3 采用RACE技術研究中藥活性成分代謝基因業已取得部分成果

RACE是一種從低豐度轉錄本中快速擴增cDNA的5′和3′端的有效方法，由3個連續的酶促反應步驟(反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增)完成，以其簡單、快速、成功率高、廉價等優勢而日益受到重視[33]。如劉榮華等[34]采用RACE技術從苦蕎中獲得C4H基因cDNA克??；劉建福等[35]將RT-PCR和RACE相結合，對姜黃PAL基因全長進行克隆，為闡明姜黃次生代謝產物的生物合成機制、改善該藥材品質提供了科學依據。

6 結束語

藥用植物次生代謝物種類繁多、代謝途徑復雜、相關基因序列與功能信息非常缺乏。但是充分應用RNA-seq、RACE等轉錄組學相關技術，有助于捕捉其轉錄學特征，闡釋藥效成分代謝調控網絡，鑒定代謝產物生物合成的新基因，從分子遺傳學層面對參與生長發育和次生代謝基因進行系統研究，進一步闡釋藥效成分形成的分子機制。