新藥非臨床安全藥理學研究進展

郭健敏，許彥芳，馬玉奎，胡曉敏，黃芳華，扈正桃，宮麗崑，姜德建，張立將，張雪峰，蔡 青，湯納平，宗 英，蘇筱琳，張文強，陸 兢，趙 斌，聶 昕，蒙飛彪，楊 威，王三龍，陸國才，汪巨峰

（1.廣東萊恩醫藥研究院有限公司，廣東 廣州 510990；2.河北醫科大學藥理教研室，河北 石家莊，050017；3.山東省藥學科學院新藥評價中心，山東 濟南 250100；4.國家藥品監督管理局藥品審評中心，北京 100022；5.成都華西海圻醫藥科技有限公司，四川 成都 610041；6.中國科學院上海藥物研究所藥物安全評價研究中心，上海 201203；7.湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙 410331；8.浙江省醫學科學院安全性評價研究中心，浙江 杭州 310053；9.江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司，江蘇 南京211800；10.康龍化成（北京）新藥技術股份有限公司，北京 100176；11.上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 200120；12.蘇州華測生物技術有限公司，江蘇 蘇州 215300；13.美國DSI公司，上海 201203；14.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心，北京 100176）

安全藥理學（safety pharmacology）作為新藥研發的一個重要組成部分，主要是評價和預測藥物在臨床試驗前的毒副作用，探討藥物劑量≥治療劑量時，潛在的不期望出現的對生理功能的不良反應。通過不斷出現的新技術和新方法進行自我更新，適應藥物安全性評價的要求，其結果也會不斷促進藥物研發和安全性評價。對于各個系統和器官的安全藥理評價并不是一個獨立的過程。隨著技術的革新，多個系統或器官可以在一個試驗中同時進行評價。例如，遙測系統的發展使得一個安全藥理試驗既可以檢測心血管功能，也可以檢測呼吸系統功能，同時與攝像系統合用后還可以評價新藥對部分中樞神經系統（central nervous system，CNS）的影響。由于新藥的特點，有些安全藥理實驗不易或者不必獨立進行，而是整合到毒理試驗中，使從實驗動物采集到的數據最大化，如生物技術藥。但是與毒理實驗的整合也要考慮實驗設計和技術操作等因素。

目前，新藥的安全藥理學評價主要集中在非臨床階段，但需要將臨床試驗中出現的不良反應以及藥物上市后人群出現的不良反應與非臨床實驗結果進行比對整合，這樣以轉化醫學為背景的安全藥理策略必然會促進藥物研發，增強非臨床安全藥理數據的有效性，為藥物研發的各個階段的決定提供有力的證據。未來的安全藥理學將依賴于藥物的開發、科學和技術的進步及管理上的挑戰。隨著分子生物學和生物技術等的進步，新的藥物作用靶點不斷被發現。有些全新的靶點，應用當前技術可能或不能檢測出有害效應的風險。故在藥物的研發過程中，安全藥理學面臨新的挑戰，是在用非臨床研究模型評價新藥時，如何研究和建立新的安全風險檢測方法和手段，以識別可能對人類產生的安全風險。本文從指導原則到新技術、新方法，全面綜述新藥非臨床安全藥理學的研究進展。

1 安全藥理學相關指導原則

美國、歐盟和日本，擁有較成熟和完善的藥品監督體系和制藥產業，該三方于1990年發起成立了ICH（International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use）。2015年10月，ICH全稱更名為“International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use（國際人用藥品注冊技術協調會）”，其發布的技術指南已經成為國際藥品注冊領域的核心規則制訂機制。

2017年6月，我國國家食品藥品監督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）成為ICH正式成員。2018年6月當選為ICH管理委員會成員。中國將逐步適應并于2020年5月1日起全面實施ICH的各級指導原則。

1.1 lCH對安全藥理學研究的總體要求

安全藥理學作為新藥非臨床安全性評價系統中一項重要組成部分，一直受到各國藥品監督管理部門和新藥研發人員的重視和關注。1997年7月，ICH發布了《M3：支持藥物進行臨床試驗和上市的非臨床安全性研究指導原則》和《S6：生物技術藥物的非臨床安全性評價》。ICH M3中指出，安全藥理學研究包括對重要生命功能的評估，如心血管系統、CNS和呼吸系統。ICH S6提出，安全藥理學研究應采用合適的動物模型，考察藥物對生理功能潛在的非預期作用。M3和S6均要求，在非臨床安全性評價中必須進行安全藥理學研究，用于支持藥物的人體臨床研究[1-2]。

2000年11月，ICH正式發布了《S7A：人用藥物安全藥理學研究指導原則》。該指導原則統一和規范了安全藥理學研究的定義、目的、試驗設計、試驗內容和相應的技術方法，在全世界范圍內促進了新藥安全藥理學這一學科的形成和發展[3]。

2014年5月，CFDA緊跟國際前沿，基本參照ICH S7A要求，頒布了《藥物安全藥理學研究技術指導原則》，旨在進一步提升我國安全藥理學的研究規范和技術要求[4]。

1.2 lCH對于非臨床評價QT間期延長的特別要求

1.2.1 S7B

藥物延長心電圖QT間期引發心律失常，特別是致命性的尖端扭轉性室性心動過速（Torsades de Pointes，TdP）的風險已被新藥研發行業廣泛認知。2005年5月，ICH正式頒布《S7B：人用藥物延遲心室復極化（QT間期延長）潛在作用的非臨床評價指導原則》[5]。該指導原則主要提供了關于藥物QT間期的非臨床研究及綜合風險評估策略，制定心室復極化延遲和QT間期延長研究方案，是關于心臟非臨床安全性評價的框架性指南。鑒于藥物對快激活延遲整流鉀電流〔IKr，其通道由human Ether-a-go-go related gene（hERG）編碼〕的抑制作用是藥物引發人QT間期延長的主要機制，所以S7B中體外試驗主要推薦采用原代心肌細胞或表達hERG通道的人源細胞來評價藥物對IKr的影響。同期，ICH還發布了與S7B相關的臨床試驗指南《E14：非抗心律失常藥致QT/QTc間期延長及潛在致心律失常作用的臨床評價指導原則》[6]，規范了在臨床研究中如何確定新藥的心臟安全性。S7B和E14中關于非臨床和臨床研究評價的結合，有助于促進人們對新藥致心律失常的風險作出整體性的判斷。

2014年5月，CFDA基本參照ICH S7B要求，頒布了《藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術指導原則》[7]，保證了我國藥品監管部門對安全藥理學研究要求的國際一致性。

1.2.2 E14/S7B Q&A及其修訂

近年來，以hERG鉀通道阻斷和QT/QTc延長為核心的評估策略逐漸暴露出其局限性。與此同時，借助各種電生理、分子生物學以及光成像等技術手段，人們對心律失常機制認識不斷深入。為此，美國FDA在2014年提出了綜合性離體致心律失常風險評估策略（Comprehensivein vitroProarrhythmia Assay，CiPA），推動了ICH E14/S7B的修訂。新的CiPA主要根據藥物對多通道的影響由計算機模擬系統預測致心律失常的風險高低。CiPA建議研究內容包括3部分：第1部分是在體外（可利用表達克隆的人各種離子通道蛋白的細胞系）評價藥物對心肌Na+、K+（包括IKr，IKs和IK1）和Ca2+等多種離子通道的影響；第2部分是計算機模擬系統預測藥物對上述各種通道的作用將如何影響心肌細胞動作電位（action potential，AP）；第3部分是在人源干細胞分化心肌細胞（human embryonic stem cells derived cardiomyocytes，hSC-CM）上驗證藥物對電生理的影響[8-10]。

2018年11月，ICH大會正式核準成立E14/S7B實施工作組（Implementation working group，IWG）來修訂E14/S7B Q&A，其分別于2018年11月11-17日在美國夏洛特會議和2019年6月3-6日的荷蘭阿姆斯特丹會議上，制定了相關技術文件草案。美國夏洛特會議主要內容為CiPA：計算機模擬技術、離子通道技術、數據的分析方法及標準化，細胞的來源、對照、參考化合物和人源干細胞在CiPA中的作用，人誘導多能心肌干細胞的方法學驗證，及人體心肌細胞模型預測心律失常等。荷蘭阿姆斯特丹會議主要內容：體外試驗的回顧及試驗方法、數據質量的一致性、心律失常模型、風險評估的Q&A及決策樹、大分子藥物進行QT研究的方法、E14風險評估的Q&A-低生物利用度/高心率藥物的風險評估及綜合分險評估等[8-9]。

根據ICH IWG會議精神，E14/S7B Q&A的具體內容將主要包括：①離體實驗/數據收集、分析及解釋規范；②S7B核心組合在體試驗的考慮；③計算機模型、離體及在體試驗等促心律失常模型的原理，以及在體實驗設計的標準化及敏感性、濃度-QT分析；④結合S7B和E14進行綜合風險評估的實例回顧；⑤對心律有影響的藥物、不能進行TQT研究的抗腫瘤藥物的要求；⑥大分子藥物的考慮：確定不需要進行QT評估的“大分子”的閾值等；⑦心電圖指標數據：臨床和非臨床生物學指標，回顧性、前瞻性分析，數據來源、分析與解釋；⑧建立決策樹等。ICH后續將進行征求意見的審議并修訂E14/S7B的Q&A。修訂工作具體分2個階段完成：①階段1：主要明確如何將體外（in vitro）、計算機模型（in silico）和體內（in vivo）試驗標準化和應用的問答；并考慮這些推薦方法對臨床評價的影響（當E14臨床評價方法有疑問時），如臨床QT評估受心率變化影響、臨床不能檢測超治療濃度、無安慰劑組等。②階段2：主要包括對S7B和E14創建預測算法或模型結果的Q&A，標準化的試驗方法（計算機模型和體外人肌細胞研究中，提供實驗條件、數據質量和報告標準），預測心律失常模型的指標，提供心電圖和（或）不良事件數據的臨床試驗設計和解釋信息，使用人心肌細胞評估藥物的電生理效應，心律失常模型及心電圖生物標志物數據，詳細定義可能不需要QT重點臨床評估的低/或無風險測試項目，并對需要額外數據的建議等方面進行確定。E14/S7B Q&A修訂工作目前尚處于階段1，計劃2020年6月完成對階段2討論稿的審議，并確定最終Q&A的發布時間表[8-10]。

2 中樞神經系統安全藥理學研究

2.1 體內外評價模型

近年來，隨著對藥物神經系統毒性的越發重視，CNS安全藥理的早期篩查也越來越受到重視，其中以細胞培養/組織培養等實驗方法為基礎，利用生物化學、分子學、電生理學、形態學檢驗以及各種組學技術對毒物暴露致神經系統結構或功能損傷的體外評價系統得到了很好的發展。如細胞模型，除了常用的LUHMES和PC12細胞，誘導性多能干細胞近年來已被廣泛用于神經疾病發病機制和神經發育毒性的研究，神經干細胞模型則能通過藥物對神經干細胞體外生長發育指標的影響來評價其可能存在的神經毒性等[11-14]。

ICH S7A要求的哺乳動物體內CNS評價測試方法主要包括Irwin或功能觀察組合（functional observational bakery，FOB）實驗，一般以小鼠或大鼠為測試系統。隨著近年來生物技術藥物持續的研發熱潮，非人靈長類動物作為許多抗體或蛋白類藥物的藥理相關實驗動物種屬，是非臨床安全性評價中的重要實驗動物，對于猴為唯一藥理學相關種屬的藥物，猴FOB實驗在評價藥物對CNS的潛在作用時具有重要意義。Gauvin等[11]于2008年報道了猴FOB試驗方法，至今多個國際和國內合同研究組織（contract research organization，CRO）在其基礎上建立了自己的猴FOB實驗系統。由于非人靈長類動物的藥效或毒性反應易受到社會變量的影響，為此群居條件下所獲得的數據更為接近人類精神神經行為和疾病過程。而應用視頻跟蹤系統獲得圖像后定量分析神經系統指標變化，將獲得更為準確的評估結果，為此是否能利用人工智能學習技術進一步發展對試驗中的視頻結果（如動物行為學變化，甚至是面部特征變化）進行記錄和評價等成為該領域的拓展方向。

2.2 計算毒理學與人工智能技術在綜合評估的應用

“21世紀毒性測試和風險評估的愿景”旨在通過定量的體外到體內外推（quantitativein vitroin vivoextrapolation，QIVIVE）增加人類相關體外模型系統的使用[15]，以減少、完善并最終取代動物模型的使用。在20世紀之初，神經網絡模型已被報道用于化合物神經系統毒性的高通量早期篩查，隨后越來越多的計算模型被應用到安全風險的預測和評估中，得到快速發展和應用。用建模和仿真來實現毒理評估的轉化，能夠觀察到這些毒性效應的相關濃度從體外到體內的情況。例如，分布生物動力學建模可以從體外細胞測定系統中測試化合物的合成，可以預測游離培養基的濃度和細胞內濃度。相應的理化性質（如logPow、pKa和溶解度）和化合物設立體外測定的條件（如細胞類型、細胞數和培養基組成），均被認為是與推動體外到體內定量的轉化毒理學終點密切相關。基于全身的生理學藥代/生理學毒代動力學（physiologically based pharmacokinetic/physiologically based toxicokinetic，PBPK/PBTK）建模和仿真是可以預測人體對化合物的全身和組織暴露的非臨床動物模型。因此，PBPK/PBTK模型不僅可以告知體外毒代動力學到體內的轉化，也有助于從動物到人類的種屬間的轉化。整合這2個模型方法，體外確定的有效濃度可以被校正為與體內相關的驅動濃度，然后，通過反向劑量法將其轉換為人等效劑量下的血漿濃度或目標組織濃度，通過模擬可以預測被鑒定為有害的體外PBTK模型。Bal-Price等[15-16]應用不良結局路徑（adverse outcome pathway，AOP）概念，對已知對于CNS和周圍神經系統的正常功能至關重要的多種細胞和分子過程進行了總結，由于CNS和周圍神經系統的生物學和功能復雜性，在化學暴露導致神經系統不良結局的途徑之間建立起因果關系和定量關系一直具有挑戰，而這種作用機制明確的綜合測試和評估方法（IATA）可能具有開發前景。

2.3 核心組合安全藥理實驗

CNS核心組合實驗是一些常規的標準化的快速測試，這些測試通常也可在藥物研發的早期階段被用于測試先導化合物是否有潛在的CNS風險。這類早期測試通常在大鼠上進行。ICH S7A主要建議的核心組合實驗包括臨床觀察、自發活動和運動協調。日本指導原則的第一級研究中除了S7A的建議外，還包括了驚厥閾值、與安眠藥的相互作用和疼痛閾值的測定。ICH SA7中建議這類核心組合實驗均應參照藥物非臨床研究質量管理規范（Good Laboratory Practice，GLP）法規執行。

實際上，類似Irwin和FOB實驗這種利用標準化方式對藥物進行系統地觀察的方法原則上可以使用于其他動物種類（甚至可以用于人）。而ICH S7A中也提到可以使用功能組合實驗作為CNS核心組合實驗[17-18]。

2.4 補充和追加安全藥理實驗

這類研究的范圍涉及更廣泛，通常會涵蓋認知功能（學習、記憶和注意力）、腦電圖（electroencephalogram，EEG）和藥物依賴/濫用測試。由于這類研究的復雜性，目前還無法將其標準化，故未要求其必須遵循GLP，但必須按照國際公認的科學的方法進行。

2.5 EEG研究

電生理學范圍廣泛，涵蓋從體外研究如細胞內和細胞外到整個動物的體內研究如EEG。EEG研究本身是一個非常寬泛的概念，涉及到大腦電活動的各個方面，從頭蓋骨外的表層記錄到腦內的深度電極記錄（自發性生物電位）。而作為追加的CNS安全藥理研究，EEG研究主要涉及清醒自由活動動物的定量EEG（quantitative EEG，qEEG）和睡眠/覺醒周期[19]。

2.6 評價新技術

腦成像、神經遞質監測和腦電監測等方面的新技術在近20年來被廣泛地運用于腦科學研究中。比如腦電監測是一個長期持續性的過程，從24 h到幾周，并且需要避免在測試過程中引入麻醉劑、應激反應等干擾因素，故植入式遙測技術在CNS研究中有著天然的技術優勢——即使用清醒自由活動的動物進行長期監測。遙測技術已被廣泛地應用于基礎腦電研究、睡眠研究和癲癇研究，輔助研究者做出了許多高質量創新研究，并取得了重大成果。

此外，還可以將遙測系統和視頻監測系統與動物行為學系統聯合使用。例如，通過優化手術方法，聯合視頻技術，建立了可長期連續監測清醒自由活動大鼠大腦皮質、海馬EEG、肌電圖和行為活動度的動物模型。該模型首次將遙控監測動物腦電圖技術和視頻技術（video-telemetric electroencephalography，Video-tEEG）結合起來，同步研究藥物對動物行為活動和EEG的影響，且動物可在清醒自由活動狀態下被長期連續監測，這為CNS藥理學和新化合物安全性評價提供了一個新的強有力的動物模型。

未來CNS安全藥理學的研究趨勢主要可體現以下幾個方面：①FOB實驗的不斷完善和標準化：與人類一樣，動物也具有社會行為，群養的動物間會形成從屬關系，不同階級的成員之間會表現出不同的社交行為。與自然界不同的是，對于在實驗室條件下飼養的動物，一般以單性別為1個群體，動物的社會行為會發生改變。因而，在FOB實驗的籠內觀察中，不再只是單純檢查動物的一般生理狀態，更應該關注藥物對于動物行為學的影響，并增加相應的觀察和描述標準，如社會行為包括玩耍、順從、威脅和攻擊。另外，隨著社會行為視頻分析手段的不斷發展，大小鼠步態分析系統、視頻追蹤、射頻識別（radio frequency identification，RFID）和行為學自動分析軟件的應用能更好地滿足行為學觀察的時間要求和指標量化，對于社會行為的描述變得更加客觀。同時FOB實驗觀察指標、評價標準和統計方法也逐漸統一。未來也會有更多的實驗動物例如食蟹猴、Beagle犬等FOB模型越來越完善，更多的應用于中樞神經系統核心組合實驗中來。②CNS追加的安全藥理學實驗技術會越來越成熟，高架十字迷宮、長時程增強效應測定及動物EEG測定等實驗技術也將會更多地用于行為、學習記憶、神經生化、視覺、聽覺和（或）電生理等指標的檢測。③隨著近年來神經生理、神經生化、神經內分泌等研究的不斷深入，新的神經毒性生物標志物如髓鞘堿性蛋白等也會逐漸應用到藥物對神經系統的影響中[11-19]。

3 心血管系統安全藥理學研究

3.1 心臟安全藥理學評價新技術

鑒于國際上心血管安全藥理方面的發展方向，正朝著新策略CiPA的方向努力。且從新藥評價技術的發展趨勢看，體外綜合評價技術，在未來的新藥評價中最終將占據主導地位。

3.1.1 體外離子通道研究

在新藥早期篩選階段，首先要進行體外hERG電流實驗。然而參與心肌動作電位復極有多種外向和內向電流。一方面，并非所有藥物引發的心律失常都來自阻斷hERG通道；另一方面，藥物可能同時影響多種離子通道，對其他通道的作用將改變hERG鉀通道阻斷帶來的風險程度，如同時抑制晚Na+電流的失活將增加風險，而同時抑制晚Na+電流或L型Ca2+電流將降低風險。據報道，大約60%具有潛在治療作用的新化合物由于明顯的hERG阻斷，在早期階段停止研發，而這些化合物不一定具有致心律失常風險。因此，新的CiPA策略要求檢測對多種離子通道的影響，CFDA頒布的《藥物QT間期延長潛在作用非臨床研究技術指導原則》亦做出同樣的要求。主要采用原代心肌細胞或異源表達細胞系評價藥物對 IKr/hERG，IKs，Ito，INa（包括晚Na+）和ICa-L等的影響[4，7]。

3.1.2 計算機模擬技術

計算機模擬毒理學，主要是通過建立定量結構活性關系計算機模型（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型來預測、闡明化學物質的毒副作用及作用機制。在心臟方面的安全性評價中，可通過計算機模擬模型，利用藥物對多個離子通道的影響來預測藥物對動作電位的影響及致TdP的風險。美國FDA正在致力于促進用于心臟安全性評價的可靠且經過驗證的計算機模型的發展[10，20]。

3.1.3 人源干細胞分化心肌細胞技術及應用

人源干細胞（包括胚胎干細胞和誘導多能干細胞）分化心肌細胞技術的出現使藥物敏感心律失常細胞模型的建立得以實現。研究表明，盡管hSCCM為不成熟的心肌細胞，這些細胞具有對藥物反應比較敏感、無種屬差別、急性或慢性孵育、高通量測定等優勢，特別是誘導多能干細胞分化的心肌細胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）無倫理問題，患者來源hiPSC-CM攜帶疾病特有的遺傳突變特征，為心律失常機制研究廣為采用。在體外培養的單層hSC-CM上可直接觀察到藥物誘發早后除極和觸發電活動，為評價藥物潛在致心律失常風險提供了良好的細胞模型。CiPA工作組成立以來的5年多時間不斷發布相關的工作進展（https：//cipaproject.org/about-cipa/），以28種臨床驗證的高、中、低3類風險致心律失常藥物為驗證藥物，系統研究了其對各種離子通道的影響、比較了其對多中心不同來源hiPSC-CM和不同記錄方式下（微電極陣列場電位記錄、電壓敏感染料記錄AP）的電生理影響。相信不久的將來CiPA工作組將建立起藥物對hiPS-CM電生理終點評價參數的實驗規范流程及系統驗證方案[10]。hiPS-CM實際應用的主要挑戰是其不成熟性，不同來源以及不同的誘導分化、培養條件等造成細胞電生理的差異性，目前對國內研發的hiPS-CM尚無系統的實驗驗證資料。

除評價藥物致心律失常風險外，hiPS-CM還用于檢測藥物導致的心肌細胞損傷。已經報道多種中、高通量商業化技術平臺測定藥物對hiPS-CM的收縮影響，包括基于視頻分析、Ca2+內流、細胞阻抗分析等不同原理設計的實驗平臺。除測定收縮外，還可測定細胞存活率、線粒體膜電位、Ca2+瞬變和細胞膜通透性等多種參數，從而全面評價藥物的潛在心臟毒性風險。細胞微電子芯片技術是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細胞生理狀態的新型實時心肌細胞分析系統，其系統的核心是把微電子細胞傳感器芯片整合到表面適于細胞貼附與生長的細胞檢測板的底部或細胞浸潤遷移板的微孔膜。微電子芯片主要通過測定電阻抗來反映細胞生長、伸展、形態變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態。實時心肌細胞分析系統所具備的實時數據采集、搏動周期的短期和長期檢測優勢及系統的高通量，使這一技術非常適用于候選藥物和各種材料的非臨床心臟安全性評估。目前，該系統已經廣泛用于心肌細胞搏動、收縮和場電位等方面的研究[21-25]。

3.2 清醒動物遙測技術

目前主要有2種遙測技術：馬甲式遙測系統（Jacketed External Telemetry，JET）和全植入式遙測系統（Implanted Telemetry）。JET系統接收動物的實驗數據主要檢測ECG和體表溫度，目前多用于毒理實驗中的安全藥理數據采集；全植入式遙測實驗可以同時監測ECG、血壓、體溫、心收縮力和血液學指標等等。通過遙測技術可以采集到心率和ECG相關指標，如QRS間期、QT間期、ST段和PR間期等。由于PR間期和QT間期容易受到心率、樣本量、噪聲等的影響，根據實驗設計和應用的動物種屬以及數據質量的不同，應該選取合適的公式進行校準。一般來說，常見的校準公式有Van de Water公式、Fridericia公式和Bazett公式等。具體使用哪個公式和校準方法，還是需要根據具體的數據樣本和質量來確定。

植入血壓主要分2種：微創血壓（minimum invasive blood pressure，MIBP）和全植入血壓（implanted blood pressure）。全植入血壓是全植入的遙測系統中的一部分，主要可以測量股動脈壓或者腹主動脈壓，以及左心室壓。左心室壓力的檢測不僅可以反映血壓的變化而且還可以間接反映左心室肌收縮力的情況。因此，全植入血壓可以較為完整地評價心血管系統中的血壓和心收縮力的狀況。

MIBP植入技術是針對JET系統不能監測血壓而研究設計的。JET系統主要用來監測ECG和體表溫度而不能監測血壓等重要的心血管功能指標。最近出現的MIBP植入技術使JET不僅能夠監測ECG和體表溫度，而且可以監測藥物是否對血壓造成影響。MIBP植入技術是指通過手術將監測血壓的植入子插入動物的一側股動脈中或者腹主動脈（如果加長導管）中，然后再將植入子的頭部即發射器部分縫合在皮下肌肉中。這樣血壓信號就可以通過導管傳入植入子的發射器內，再通過信號轉換將血壓信號轉換成無線電信號并通過接收器傳入采集的電腦中。這種技術既彌補了JET系統不能采集血壓數據的缺陷，同時它與JET系統結合在一起能夠采集較為完整的心血管方面的安全藥理數據。這對將安全藥理整合到毒理實驗中的實驗方式有著重要的意義[22，26]。

3.3 心血管安全藥理追加實驗

①血流動力學檢測：對比格犬、食蟹猴和巴馬豬的血流動力學檢測方法進行優化，提出行業規范化意見。促進血流動力學實驗在相關藥物評價中的應用，全面評估藥物對心血管系統的作用特點。②規范并推廣離體血管肌張力實驗和微血管肌張力實驗在新藥評價中的應用，開展藥物對血管直接作用的評價能力建設。③離體心臟模型可以直接評價藥物對心電和心肌收縮力等的綜合作用，當前在眾多實驗室中均有應用[22，26-27]。

4 呼吸系統安全藥理學研究

4.1 呼吸功能評價

目前，非臨床安全性評價多采用清醒動物無創的方式進行呼吸功能檢測。通過無線遙測技術檢測實驗動物在清醒狀態下各項呼吸參數，不受麻醉藥物的干擾，所得數據更為真實。

常用方法包括體積描記和全身體積描記，其優點是操作簡便，缺點是檢測指標單一且數據易受動物活動和環境的影響。另外，由于動物馴化機制不完善，應激反應導致不同研究機構獲得的數據差異大、重復性差。因此，無創方式一般用于核心組合實驗及快速篩選。有創方式包括呼吸電極植入子及麻醉狀態下的氣管插管術，前者可以在清醒無干擾的情況下測量動物的呼吸但檢測指標單一，后者檢測指標豐富、靈敏度高但麻醉藥劑量及時間對呼吸功能的影響較難把握[28-29]。

近年來，隨著肺功能檢測手段的不斷進步，用于臨床呼吸系統功能檢測的強迫振蕩肺功能測定技術（forced oscillation technique，FOT）也逐步應用于非臨床評價過程。FOT技術是將工程學強迫振蕩技術用于呼吸力學方面的測定，2007年歐洲呼吸協會提出了針對強迫振蕩技術臨床應用的技術規范，標志著該技術走向成熟期[30]。FOT技術使得氣道阻力及肺順應性的改變易于檢測，從而提高了藥物對呼吸系統毒性檢測的靈敏度。且FOT設備本身可作為呼吸機進行機械通氣，幫助實驗人員實施開胸術測量肺動脈壓，同時結合血氣檢測，可以獲得較為完整的呼吸系統追加實驗數據。總之，通過該技術，可以在吸入藥物評價、肺纖維化模型、氣道高反應性及肺動脈壓等檢測上獲得靈敏度高、一致性好、重復性佳的數據。

全身體積描記法由于對動物無束縛，其數據的穩定性上具有很大的優勢。除了常用的檢測指標，如潮氣量、呼吸頻率和每分通氣量外，還可以檢測包括吸氣和呼氣時間，吸氣和呼吸時的峰流量，呼吸暫停時間（apneic time）和呼吸暫停計數和氣道縮窄指數（enhanced pause，Penh）等。全植入式的呼吸遙測技術是將電極埋置在胸廓相應位置，在動物呼吸運動時，胸廓的體積變化引起不同電極間的電勢發生改變，從而演算得到呼吸波形，經過校準后，同樣可以測量主要呼吸參數，且只需要定期進行校準，和馬甲式遙測技術相比，手術恢復后的動物適應性更好。不過該方法需要手術且對電極的埋置位置的精確度要求較高，在操作上具有一定難度[28，31-34]。

近年來，隨著新版《藥物安全藥理學評價研究技術指導原則》的頒布，使用清醒動物進行遙測實驗已是大勢所趨。目前，國內多數實驗室已能實現生物信號遙測系統在實驗動物清醒狀態下檢測其自由活動的多種生理指標的變化，且準確性得到大幅提升，但獲得的指標仍僅限于呼吸頻率及呼吸幅度，并未對呼吸深度進行量化，且不能全面反映動物肺功能和氣道的反應性情況。近年來，隨著藥物非臨床研究質量管理規范在我國的嚴格執行，安全藥理學的研究發展也異常迅速，呼吸系統指標的檢測手段也在不斷進步。

4.2 肺功能檢測指標

目前動物實驗性呼吸系統功能研究中，常用測量指標包括潮氣量、呼吸頻率、氣道阻力、肺順應性、肺動脈壓力、呼氣容積、呼氣流速和彌散系數等，通過不同的指標反映呼吸系統功能的變化。例如，在實驗性動物哮喘實驗中，主要對動物的胸內壓、氣道流速、潮氣量、氣道阻力和肺順應性等進行研究。動物的胸內壓一般通過麻醉動物胸腔插管的方式，將帶有壓力傳感器的壓力探針刺入動物胸腔，通過壓力探針獲得動物的胸內壓。氣道流速一般是通過氣管插管的方式獲取，在動物麻醉過程中通過動物手術將流速傳感器插入動物的氣管，通過流速傳感器獲得動物的氣道流速。潮氣量一般是通過封閉體積描記箱技術，把動物放置在密封體描箱中，動物胸腔的變化對體描箱空氣會產生擠壓效果，通過對箱體內氣體的壓力或流速進行分析，即可得到動物的潮氣量。根據動物的呼吸狀態進行分類，又可分為自由呼吸和強制呼吸兩種。其中自由呼吸是指動物在自主呼吸情況下測得的肺功能指標，強制呼吸是指動物在麻醉接上呼吸機的情況下測得的肺功能指標，前者一般測得的是動態肺順應性，后者測得的是靜態肺順應性[32-33，35-36]。

5 補充安全藥理學研究

5.1 胃腸道系統

體內實驗的檢測指標主要包括胃排空和腸道推進、胃液分泌、胃蛋白酶活性等，胃排空和腸推進實驗中所用的指示劑種類繁多，如5%活性碳粉、半固體營養指示劑（明膠、羧甲纖維素鈉、糖、淀粉和著色劑等）、酚紅或伊文思藍溶液。其中半固體營養指示劑在胃腸道內運動相對較慢，可適用于有促進胃腸道運動作用的藥物評價。酚紅或伊文思藍溶液較適用于非禁食狀態下的胃排空實驗，以排除食物對實驗結果的影響。另外，[13C]辛酸呼吸法同樣可檢測胃排空功能，此方法是一種非侵入式的檢測方法，排除了麻醉，生理應激狀態對胃動力的影響。除此之外，還有報道用清醒自由活動動物模型進行胃腸慢波監測，并測試給藥后的藥物反應[37-40]。

86 動脈瘤性蛛網膜下隙出血后腦血管痙攣的診斷和治療進展 陳榮彬，吳學銘，趙 亮，韓凱偉，黃承光，于明琨，侯立軍

未來胃腸道補充安全藥理學的研究趨勢主要可體現以下幾個方面：①發現并驗證能夠診斷胃腸道損傷的特異性好、靈敏度高的生物標志物會成為胃腸道系統補充的安全藥理學研究的重要發展方向。例如，瓜氨酸有可能作為分析小腸吸收功能的生物標志物等。另外，胃泌素、胃動素、膽囊收縮素、生長抑素、血管活性多肽、促胰液素以及P物質等胃腸激素水平可反映胃腸功能情況。②胃腸道功能新的檢測技術方法應用，包括超聲診斷、放射學、核素顯像、核磁共振、胃腸電圖、生物電阻抗、膠囊內鏡和腔內測壓等。盡管這些方法已在臨床應用，作為臨床診斷胃腸功能的客觀手段，但是動物試驗中應用較少。未來可針對實驗動物開發不同的檢測儀器和診斷標準，用于實驗動物胃腸道功能的測定[38-40]。

5.2 泌尿系統

藥源性腎損傷是腎毒理學研究的重要內容，并且評估藥物對腎功能的影響也是藥物非臨床評價安全藥理學的研究內容之一。體內實驗的檢測指標可包括排尿量、比重、滲透壓、pH、尿液電解質、尿蛋白質、肌酐排泄量和腎小球濾過率（菊粉）。對腎損傷近年來研究熱點主要集中在早期損傷標志物的探索，如尿N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶、血清胱抑素、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）和β2微球蛋白等。

此外，由于物種間腎藥物轉運體和代謝酶的表達和功能差異，動物實驗和人臨床試驗數據結果之間常常出現不一致的情況。因此，人類腎體外模型作為整體實驗的重要補充，得以廣泛應用。這些體外模型能夠在新藥研發早期進行較高通量的篩選，更為經濟和高效。目前使用的體外腎毒理學研究方法主要有離體腎灌流、離體腎單位灌流、腎組織切片、離體腎小球和腎小管節段模型、體外細胞模型及芯片腎（kidney-on-a-chip）等。近些年，諸如毒理基因組學和3D細胞培養等新技術的提出，也為體外模型的研究和應用開辟了新的方向。對于腎泌尿功能的檢測主要通過尿液分析和基于血清的參數的測量來評估，包括腎排泄功能、電解質和代謝物等常規檢測指標。這項研究需要讓動物在有溫控的代謝籠中收集尿液。在預定的時間間隔內，收集尿液用于尿量、電解質、尿生化指標以及代謝物的分析。此外，近期研究發現較為敏感和穩定的尿液腎損傷的標志物可用于腎功能指標的檢測，如Kim-1等蛋白類生物標志物以及微RNA等核酸類生物標志物。這些檢測方法和指標的發現為提高非臨床腎泌尿功能損傷的檢測和篩選提供了支持[41-43]。

5.2.1 誘導多能干細胞來源的人腎近曲小管細胞樣細胞

近年來，利用干細胞技術，將胚胎干細胞或用誘導性多能干細胞技術誘導分化產生腎近端小管細胞用于體外腎毒理學研究，也展現出了良好前景[44]。

5.2.2 芯片腎

基于微芯片制作技術和微流控技術的芯片腎，構建了體外的腎仿生環境，為研究藥物對腎功能的影響和損傷作用提供了嶄新的平臺。芯片腎的大小約2 cm2，芯片用微通道模仿了腎單位的近端小管到遠端小管部分，在體外重現了腎的濾過作用和重吸收作用。微通道內多種細胞共培養，包括腎上皮細胞、足細胞和血管內皮細胞等，均是基本的腎單位細胞類型，借助微流控技術模擬腎中的灌注，不僅可用來研究藥物的腎毒性，還可以通過與其他組織類型的模型連接，研究藥物暴露后的組織間的相互作用[45]。

5.3 血液系統

藥物對血液系統影響的研究目前主要是基于外周血細胞計數以及血涂片和骨髓涂片等形態學檢測來進行研究，而對于細胞功能方面的研究相對較少。對于紅細胞功能，目前應用較為廣泛且便捷的方法是采用血氣分析儀檢測血液中pH、二氧化碳飽和度以及氧氣飽和度，進而對紅細胞攜氧功能進行檢測。對于血小板功能，主要涉及血小板黏附功能檢測、血小板聚集功能檢測以及血小板釋放功能檢測。這些檢測方法也主要是在臨床血小板功能的檢測方法的基礎上進行了改良和驗證。近年來，國內外對血小板聚集功能方法研究開發比較活躍，這與血小板聚集功能在血栓形成過程中的作用密切相關，也因此受到國內外研究者的廣泛關注[46]。

5.4 肝膽系統

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）的危害性受到越來越多研究者的關注，亟需合適的體內外DILI模型，為新藥的研發、篩選、DILI的發病機制以及藥物發揮藥效的機制研究提供條件。目前可以模擬DILI的模型包括體外和體內模型，它們各有利弊，從不同的層面為DILI的研究提供基礎。DILI的體外研究模型分別介紹如下。

5.4.1 亞細胞水平模型

肝微粒體是從肝組織勻漿后得到內質網碎片所形成的小型囊泡，富含各種肝藥酶，代表肝中一個酶系統。它可以代謝各種化學藥、中草藥等各種異物小分子，代表肝代謝能力的亞細胞單位。藥物通過與肝微粒體共孵育（47），結合體外細胞學實驗，可為IDILI的體外研究提供一定的方法。

5.4.2 單層細胞培養模型

單層培養，或可稱為2D平面培養，是指將肝細胞種到預先鋪有細胞外基質如膠原、纖連蛋白或人工基底膜等平面上進行培養。單層培養的肝細胞一般都能保持肝功能幾小時到幾天。然而，單層細胞培養模型去分化現象嚴重，肝藥酶代謝能力容易變弱或消失，功能蛋白表達不完整，只適用于較短期內初步篩選可能導致肝損傷的藥物[48]。常用于單層細胞培養模型的細胞有原代肝細胞、L-02細胞系和HepG2細胞系等。

5.4.3 三明治培養模型

三明治培養，介于2D培養和復雜的3D培養之間，肝細胞被夾在2層基質膜如膠原蛋白或人工基底膜之間，可以長時間（可達數周）維持細胞活力、形態以及藥物代謝酶功能，尤其在無血清培養基中會有更多的膽小管結構形成，是研究膽汁淤積型肝損傷較好的體外模型[49-51]。但是，肝特異性的功能基因表達隨時間延長而減弱，肝細胞去分化過程不能克服。

5.4.4 3D培養模型

3D培養模型可以更加接近體內肝模型，目前，研究人員研發出了一系列3D肝細胞培養模型，且肝細胞的種類不局限于人源肝細胞和原代肝細胞。如3D多細胞球體模型，將細胞重懸在液體基質（水凝膠）中進一步聚合或采用懸浮滴注技術產生多細胞球體，球體直徑一般在50～100 μm。由原代肝細胞所形成的球體模型長時間維持細胞活力和形態，適用于慢性蓄積性致肝損傷藥物體外篩選的研究[52]。

5.4.5 肝芯片體外模型

人體器官芯片（human organs-on-chips）是一種可以在芯片上構建的器官生理微系統的技術，是近幾年快速發展起來的一門前沿科學技術。通過微流控芯片技術、細胞生物學、生物材料和工程學等多種方法手段的結合，在體外模擬構建含有多種活體細胞、功能組合界面、生物流體和機械刺激等復雜因素的組織器官微環境，更加真實地反映人體組織器官的主要結構和功能特征[52-53]。

近年來，研究者已成功構建人工肝竇芯片，通過高滲透性的內皮間隙結構將原代肝細胞與外部血竇樣區域分離，在保持肝特異性功能的同時，最大程度上接近人體內的真實形態[51]。也有研究顯示，在構建肝芯片模型時，將成纖維細胞、肝星形細胞以及人誘導性多能干細胞來源的血管內皮細胞等其他細胞及流體因素參與考慮其中，可以促進肝細胞發育、白蛋白分泌、糖原合成及藥物代謝等肝功能的發揮[52-53]。

6 體外安全藥理學展望

體外安全藥理學研究在藥物的早期研發中也具有極其重要的意義，其研究內容包括化合物對受體、酶、轉運體以及離子通道的作用。通過將體外安全藥理學研究和傳統安全藥理學研究結合起來，對臨床后期開發成功率已經顯示出了積極影響，而在藥物發現過程中，開展體外安全藥理學研究也能夠產生顯著影響，包括：①在先導化合物的合成/選擇階段鑒定出安全風險并輔助決策；②在先導化合物的優化階段指導降低安全風險；③在先導化合物優化的末期階段，結合已經獲得的治療劑量下血藥濃度，評估該暴露量下的安全風險并輔助確定候選化合物；④在非臨床和臨床開發階段協助風險管理。

體外安全藥理學的早期研究范圍主要集中在與藥物靶點密切相關的少數幾個蛋白種類，隨著科技水平和篩選技術的提高，這個范圍逐漸覆蓋到了涉及重要生理系統（心血管、呼吸以及中樞神經）的多個蛋白種類，具體蛋白種類的確定，是以存在不良反應的上市藥物為分析目標，通過研究這些藥物對不良反應關聯靶點蛋白的作用，從而確證哪些蛋白具備安全預測能力。基于阿斯利康、葛蘭素史克、輝瑞以及諾華四家跨國制藥企業的相關數據，一個最小篩選組合已經被確認，這個組合中的蛋白大部分源自G蛋白偶聯受體超家族，包括了12個亞家族中的24個蛋白，此外還有7個離子通道相關蛋白、6個胞內酶類蛋白、3個神經遞質轉運體蛋白、2個核內激素受體蛋白以及1個激酶蛋白，這44個蛋白被推薦作為化合物的體外安全藥理學早期評價組合。篩選采用的實驗方法主要包含配體結合試驗和功能評價實驗，通常情況下，這2類實驗會先后進行，從而形成互補以避免錯誤判斷。截至目前，已經有一些制藥公司中的實際案例，顯示早期體外安全藥理學研究結果直接影響甚至改變了藥物開發歷程[54-56]。

從上述內容可以看出，體外安全藥理學研究方向可以大致分為2個，一個是以ICH指導原則為主的標準化研究，以hERG通道試驗和未來可能要推行的CiPA方案為代表；另一個則是制藥公司主導的在新藥早期開發階段進行的篩選研究。其中前者將按照規劃穩步推行，后者則處于相對靈活的情形，直到相關經驗累積成熟至形成共識。逐漸在新藥發現階段開始加入體外安全藥理學研究，并根據實踐經驗逐漸形成體系。體外安全藥理學的參與程度必將越來越高。

安全藥理學在新藥研發和管理藥物批準過程中，它是一個被重新引起重視的學科，當代安全藥理學具有了全新的內容和研究范圍。它被認為是整個藥物安全性評價的重要組成項目之一，是為病理學、生物化學和毒理學評價提供補充的關鍵項目，是制藥工業在藥物研發中對藥物安全的一個新認識。