小檗堿表觀遺傳藥理作用研究進展

張舒晨，高 斌，尚文斌，2

（1.南京中醫藥大學代謝病中醫研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬醫院內分泌科，江蘇 南京 210029）

表觀遺傳學是指在不改變原始DNA序列的情況下，通過多種修飾影響基因和蛋白活性并產生可遺傳的性狀。這些修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾（甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等）及非編碼RNA等[2]。這些修飾通過改變染色質局部結構，影響DNA復制、RNA轉錄、DNA損傷修復與重組、蛋白表達及活性等許多過程，影響眾多疾病如癌癥[3]、糖尿病及其并發癥[4]和心血管疾病[5]等發生發展。表觀遺傳學改變在諸多生理病理中發揮了重要的作用[1]。

小檗堿為清熱解毒藥黃連的有效成分。多年來的臨床和實驗藥理學研究表明，小檗堿具有抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物、調節糖脂代謝、保護心血管和免疫抑制等多種藥理作用，對癌癥、腸道感染性疾病、糖尿病、心血管疾病和阿爾茨海默病等具有防治作用[6-7]，其應用前景廣闊。近年來研究發現，小檗堿能夠通過改變表觀遺傳修飾過程發揮藥理作用，對小檗堿在表觀修飾層面的深入研究有助于闡明其藥理作用的新靶點和新機制。

1 調控DNA甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是從S-腺苷甲硫胺酸上轉移一個甲基至啟動子中富含CpG序列區域的胞嘧啶的5號位[8]，這個過程被DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMT）所催化。DNA甲基化最主要的功能是改變基因表達，總的來說，在基因表達區甲基化程度越高，基因的表達將會下降[2]。

DNA甲基化在腫瘤發生過程中常見，許多促癌基因由于甲基化降低而被激活，抑癌基因被高甲基化而沉默[9]。非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并發癥在分子生物學水平也可檢測到大量涉及糖代謝、炎癥和氧化應激等通路上DNA甲基化改變[10-11]。目前研究表明，針對不同疾病或同一疾病不同治療機制，小檗堿既可以提高特定區域DNA甲基化，又可以促進特定區域DNA去甲基化。

1.1 DNA甲基化作用

小檗堿可以提高促癌基因啟動子區域的甲基化水平以抑制其表達。組成型雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）可以調控肝糖異生，并促進肝癌發生。在過表達CAR的HepG2細胞上給予5～25 μmol·L-1不等的小檗堿后，可以檢測到細胞內總的DNA甲基化程度增強，其中CAR及其靶基因細胞色素P450酶家族的CYP2B6和CYP3A4基因啟動子區的甲基化水平升高，因此CAR和P450表達被抑制，其他抗腫瘤表現可見細胞凋亡增多、細胞周期停滯、活性氧生成減少，同時還可以提高代謝酶的穩定性，延緩肝癌的發生[12]。

1.2 DNA去甲基化作用

小檗堿的抗癌機制不僅表現在能夠抑制促癌基因表達，而且還能通過抑制DNMT的表達及活性，降低抑癌基因啟動子區域的甲基化程度，使抑癌基因表達增多，發揮抗癌效應。DNMT包含3種酶，其中DNMT1起到維持甲基化的作用，其異常表達對癌癥發展有重要影響[13]，DNMT1的失活會誘導轉錄因子P53蛋白的磷酸化以激活下游DNA損傷通路，促使癌細胞凋亡從而防止癌變。因此DNMT1是一個潛在的良好的癌癥治療靶點[14]。應用小檗堿干預人腫瘤細胞，細胞內DNMT1和DNMET3B基因表達及蛋白水平顯著下降，由此帶來全細胞尤其是P53及其下游與細胞凋亡相關基因的啟動子區域甲基化程度降低，從而激活P53依賴的細胞凋亡過程發揮抗癌作用[15-16]。還有在人卵巢癌細胞SKOV3中應用小檗堿的研究，發現小檗堿可以降低錯配修復基因hMLH1啟動子的高甲基化狀態，上調其表達，抑制卵巢癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，同時小檗堿與順鉑聯合應用對卵巢癌細胞有較強的協同抗癌作用[17]。

小檗堿治療代謝性疾病中DNA甲基化的異常，主要是通過恢復代謝通路中的關鍵基因的表達，促進糖和脂類的利用與轉化，緩解肝變性。現有研究證明，小檗堿可以恢復異常的L型丙酮酸激酶（L-pyruvate kinase，L-PK）和微粒體甘油三酯轉運蛋白（microsomal triglycerides transfer protein，MTTP）甲基化。在NAFLD模型的SD大鼠中檢測到由于LPK基因啟動子區域DNA甲基化程度升高因而在肝的表達降低，L-PK對細胞增殖、葡萄糖利用和甘油三酯代謝有顯著的促進作用。口服小檗堿可通過L-PK啟動子去甲基化恢復L-PK的表達，促進代謝[18]。MTTP是一種主要分布于肝細胞、腸上皮細胞中的脂質轉移蛋白，其在甘油三酯轉運及極低密度脂蛋白組裝和分泌中發揮著重要作用，并與血脂障礙和肝脂肪變性等疾病的發生發展關系密切[19]。在高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導的NAFLD小鼠肝中，MTTP啟動子的甲基化水平明顯升高，其表達被抑制；小檗堿可以逆轉基因表達的下調，并抑制由于HFD導致的MTTP啟動子甲基化的增加，從而增加肝甘油三酯的輸出，改善HFD誘導的脂肪肝[20]。

2 調控蛋白乙酰化

組蛋白和各類轉錄因子上賴氨酸乙酰化是常見而重要的的蛋白質翻譯后修飾，由組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferases，HAT）和組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylases，HDAC）共調控此過程的動態平衡[2]。在高等生物中，HDAC可分為4類，即依賴鋅離子發揮作用的Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ類HDAC（HDAC 1～11）和依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的Ⅲ類HDAC，又稱為Sirtuins家族（SIRT 1～7）[21]。HDAC既可以在染色質水平上通過對組蛋白的去乙酰化而穩定核小體結構，抑制基因轉錄，也可以通過對轉錄因子等非組蛋白進行去乙酰化而中和HAT作用，并能促進HAT與沉默因子的結合而發揮抑制作用[22]。

由于HDAC與HAT表達水平顯著改變，導致全細胞乙酰化水平的動態平衡被打破，各種轉錄因子能與促癌基因特異性結合，激活基因的轉錄促使癌癥的發生。同樣，在代謝性疾病中通路上關鍵酶的乙酰化狀態也被改變，并可與DNA甲基化修飾協同或拮抗，對各信息分子產生沉默或激活作用，影響各代謝過程。小檗堿可以通過抑制HDAC和促進Sirtuins恢復乙酰化動態平衡，對HAT的調控研究尚且不足。

2.1 促進蛋白乙酰化

現有研究結果表明，小檗堿可能通過抑制HDAC的表達及活性改變腫瘤細胞內乙酰化水平發揮抗腫瘤作用。在人肺癌細胞A549中小檗堿通過抑制總HDAC，尤其是Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ類HDAC的活性，使得組蛋白乙酰化程度急劇上升，并觸發亞G0/G1細胞周期進展階段的正向調控，抑制A549細胞生長[23]。將小檗堿給予HeLa細胞檢測到HDAC1和HDAC2表達明顯下降，通過分子模擬對接顯示小檗堿在HDAC1和HDAC2上可能存在結合位點。在多種血液腫瘤細胞系中小檗堿的刺激提高了組蛋白乙酰化水平，這與CREBBP和EP300的表達上調和HDAC8的表達輕度下調等有關[24]。數據庫分析結果顯示，小檗堿可能抑制HDAC和AKT通路蛋白合成，誘導內質網應激和自噬，并顯示小檗堿可以誘導細胞核內HDAC6的底物α-小管蛋白的乙酰化，阻礙HDAC6與其結合發揮功能，而非直接抑制HDAC活性[25]。此外，小檗堿和泛HDAC抑制劑SAHA共同作用，通過提高染色質特定區域組蛋白乙酰化，從而調控細胞凋亡及分化相關蛋白的表達和穩定性，協同抑制細胞增殖和誘導細胞周期停滯[25]。

上文所述的L-PK在NAFLD大鼠肝中的表達降低不但受到基因啟動子區域的DNA高甲基化影響，與L-PK基因周圍組蛋白乙酰化的降低也有關。口服小檗堿可通過L-PK啟動子去甲基化并同時升高L-PK周圍組蛋白H3和H4乙酰化來恢復L-PK的表達，改善糖尿病糖脂代謝紊亂[18]。

2.2 促進蛋白去乙酰化

Ⅲ類HDAC中的SIRT1參與了包括基因轉錄、能量代謝以及細胞衰老過程的調節等許多生理過程，連接了代謝和炎癥等多通路的交互。大量研究表明，小檗堿可以促進SIRT1的表達，因此可以產生改善代謝、抗炎、保護心血管等多種效應。

在肥胖和糖尿病模型動物中SIRT1的表達下降，并且在SIRT1基因敲除小鼠中會出現胰島素抵抗和糖脂代謝異常。小檗堿通過調節SIRT1及其下游過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α以激活AMPK和AKT通路，從而增加胰島素敏感性；同時激活的SIRT1還可以去乙酰化肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1），激活AMPK通路，最終改善胰島素抵抗[26]。小檗堿對SIRT1的上調還可以抑制氧化應激所致的肝細胞凋亡，誘導細胞自噬，誘導產生成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21），以此增加肝胰島素敏感性及維持體內葡萄糖穩態，刺激能量消耗，改善肝脂肪變性[27]。

SIRT1也在炎癥反應中起到一定作用，慢性炎癥作為一種防御反應，本身是一種獨立的疾病，同時也參與了許多疾病的發生。與炎癥密切相關的轉錄因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）對機體損傷和感染的免疫和炎癥反應起主要調節作用[28]。在慢性炎癥期間，NAD+和SIRT1水平顯著降低，其P65上第310位賴氨酸乙酰化可以完全活化NF-κB的功能[29-30]，激活SIRT1可以對NF-κB/P65的去乙酰化，減輕炎癥反應[31]。經脂多糖誘導的巨噬細胞內，P65的乙酰化水平明顯上升，而給予不同濃度的小檗堿后通過SIRT1的去乙酰化作用，使得P65的乙酰化水平有一定程度的下降，并使NF-κB與DNA的結合能力減弱，從而抑制下游炎癥信號通路的活動，發揮抗炎效應[32]。

SIRT1的表達和活性下降還會導致心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓、心臟肥大和心力衰竭等的發生，這可能與引起的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NF-κB的增加和促炎途徑的激活有關。也有研究表明，SIRT1的下調會促進線粒體氧化應激的關鍵驅動因子p66Shc表達，發生持續性血管障礙[33]。小檗堿通過上調SIRT1、B淋巴細胞瘤2蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）表達以及下調BCL-2相關X蛋白（BCL-2 associated X protein，BAX）和胱天蛋白酶 3表達以發揮心臟保護作用；還降低心肌超氧化物生成和心肌炎癥標志物水平，增加心肌超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，顯著提高心梗后的心功能恢復，減少心梗面積，防止心梗損傷[34]。

3 調控組蛋白甲基化

組蛋白的甲基化修飾主要發生在H3和H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferases，HMT）催化，其調控作用取決于甲基化位點和甲基化程度，較乙酰化更為復雜而穩定，能夠影響長期表觀遺傳記憶，并常與乙酰化修飾相排斥，精密地調控著基因表達的過程[35]。

組蛋白甲基化的異常會影響細胞活動，導致多種癌癥的發生。小檗堿可以修復這種異常，但相關研究目前還不深入。在多種血液腫瘤細胞中給予一定濃度小檗堿治療后，H3K4，H3K2和H3K36等多個與基因沉默和轉錄活性有關的位點甲基化水平下降，有效促進了抑癌基因的轉錄翻譯，這與細胞內組蛋白脫甲基酶KDM6A表達上調而組蛋白甲基轉移酶WHSC1Ⅰ，WHSC1Ⅱ和SMYD3下降有關，并且有分子模擬對接結果顯示，賴氨酸-N-甲基轉移酶可能為小檗堿的潛在靶點[24]。

4 展望

國內外許多研究表明，小檗堿部分通過表觀遺傳學改變機制發揮多種藥理作用（圖1）。表觀遺傳修飾是許多疾病的重要病理機制，也是目前生物醫藥研究的熱點。

根據現有的研究結果，可以發現：①小檗堿一定程度上可以改變DNA甲基化、蛋白乙酰化和甲基化水平，從而影響下游通路發揮效應。然而小檗堿在不同分子區域對同一種表觀遺傳修飾可能會產生增強和抑制2種相反的作用，其具體規律還需進一步論證。并且現有的研究中尚未明確小檗堿確切的作用靶點，如小檗堿是否與相關修飾酶直接結合，以及完整清晰的作用途徑。②目前的研究范圍較局限，小檗堿是否通過其他表觀遺傳改變產生作用的相關研究較少；由于小檗堿可以同時改變多種修飾狀態，產生連續或疊加效應，但具體的交互調控關系等也不十分清楚。例如，DNMT1可以對去乙酰化酶類產生調控作用[36]，而小檗堿作為可能的DNMT1抑制劑，是否可以通過調控DNMT1改變HDAC表達和活性尚待證明。同樣小檗堿也是可能的HDAC抑制劑，是否可以通過調節其他表觀修飾酶的乙酰化來發揮作用也可進一步探索。③目前的研究均在細胞和動物實驗中展開，尚缺乏涉及表觀遺傳的臨床試驗的研究。如果可以改造并應用，將有可能成為治療癌癥等疾病的新藥物，因此小檗堿還有廣闊的研究前景。

圖1 小檗堿通過表觀遺傳修飾發揮藥理作用的機制.DNMT：DNA甲基轉移酶；HDAC：組蛋白脫乙酰酶；HMT：組蛋白甲基轉移酶；SIRT1：沉默信息調節因子1；AMPK：AMP依賴的蛋白激酶；AKT：蛋白激酶B；NF-κB：核因子-κB.

鑒于小檗堿具有顯著的藥理作用，臨床運用多樣且療效確切，而現有研究表觀遺傳作用機制可能是小檗堿藥理作用分子機制的重要基礎，其抑制DNMT1和HDAC的作用是明確的，在精準醫學時代，小檗堿有可能成為表觀遺傳修飾作用靶點明確的治療藥物。所以，還需進一步對其表觀遺傳藥理作用機制進行更加廣泛而深入的研究，更快更好地闡明其明確的分子機制，并拓展其臨床運用和潛在價值。