2-吲哚啉酮衍生物預防給藥對放射性肺纖維化模型小鼠的防護作用

李婉瑩，高慧英，劉金芳2，，高 瑞，陳 慧，詹軼群，楊曉明3，，李長燕

（1.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；2.北京正旦國際科技有限公司，北京 102206；3.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850；4.軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，北京 102206）

肺是照射敏感器官[1]，照射對肺造成的損傷為進展性的，分為2個階段。前一階段是放射性肺炎，主要表現為照射造成的DNA斷裂損傷，Ⅰ型肺泡上皮細胞直接死亡，氧自由基增多，炎癥細胞和炎癥因子浸潤等[2-4]。后一階段是放射性肺纖維化（radiation pulmonary fibrosis，RPF），這一階段至今仍被認為是不可逆轉的[3]。在臨床上，大量肺癌患者，尤其是非小細胞性肺癌患者需要采用放射治療，通常會伴隨肺部放射性損傷[1，5]。除此之外，暴露于照射環境也會造成肺部急、慢性損傷[5]。RPF為不可逆過程，現有治療如糖皮質激素治療、氧療和抗肺纖維化藥物（吡非尼酮、尼達尼布）等僅能延緩或改善癥狀[4，6-7]，嚴重制約了肺癌患者放療效果，降低患者生存率。如何減輕放射對肺造成的損傷，提高患者生存質量，是亟待解決的臨床問題。2-吲哚啉酮衍生物〔3-（3-pyridylmethylidene）-2-indolinone，PMID〕是基于核因子類紅細胞2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nfr2）/Keap1通路篩選出的小分子化合物（C14H10N2O，相對分子質量為222.24），為無定型結晶黃色粉末，具有抗氧化的作用[8-9]。本研究采用小鼠全胸單次放射的方法制備RPF模型，并設置給藥組和對照組，在長期觀察后通過肺功能檢測和病理學等方法對小鼠肺纖維化程度進行分析，進而評估PMID對RPF的防護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和主要儀器

6～8周齡C57BL/6J雌性小鼠72只，SPF級，購于北京維通利華（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0006，平均體質量約為（18.7±0.8）g。

PMID（軍事醫學研究院輻射醫學研究所合成），批號為20160901，純度99.22%；吡非尼酮（pirfenidone，PFD）（大連美侖生物有限公司）；Masson三色染色試劑盒（貨號G1340，北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛、羧甲纖維素鈉（CMC-Na）、戊巴比妥鈉和生理鹽水注射液（石家莊四藥有限公司）；兔抗Ⅰ型膠原蛋白（alpha 2 chain of typeⅠcollagen，COL1A2）抗體（貨號A5786，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；兔二步法檢測試劑盒（貨號PV-9001）和DAB顯色液（貨號ZLI-9017）（北京中杉金橋有限責任公司）。

AniRes2005動物肺功能分析系統（北京貝蘭博科技有限公司），NanoZoomer 2.0-HT（日本濱松），Olympus IX71顯微鏡，Co60照射源（軍事醫學研究院）。

1.2 小鼠放射性肺纖維化模型的制備及處理

72只6～8周齡C57/6J雌性小鼠隨機取60只進行造模，其中12只為正常對照。造模前禁食12 h，用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉劑量為0.6 mg·kg-1，麻醉后將小鼠固定，使其胸部基本位于同一水平，暴露其兩腋下至胸骨劍突部位，照射部位面積約2 cm×2 cm，其余部位鉛磚屏蔽，采用Co60經前胸單次照射，照射劑量為17.5 Gy，照射劑量率為104.53 cGy·min-1。

造模后，隨機分為模型對照組（0.5%CMC-Na）、PMID7.5，15.0和30.0mg·kg-1組及PFD15.0mg·kg-1組。實驗前1周ig給藥，每天2次，間隔6 h，連續給藥2周。同時設立正常對照組（0.5%CMC-Na），以上小鼠均飼養于軍事醫學研究院動物飼養中心屏障環境中，實驗室飼養設施合格證號：SYXK（軍）-2007-004。

1.3 肺功能檢測

用力肺活量（forced vital capacity，FVC）和肺動態順應性（pulmonary dynamic compliance，Cydn）是評估肺纖維化的2個經典肺功能指標。照射后26周，1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉劑量為0.75 mg·kg-1，麻醉后切開小鼠喉部正中，鈍性分離至氣管暴露，在第3～4軟骨環處做T型切口，插入氣管插管后用縫合線在氣管外打結固定，與體描箱氣路相連后關閉體描箱，采集數據。

1.4 HE染色檢測小鼠肺泡病理變化及Masson染色檢測膠原沉積

左肺浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、浸泡、包埋和切片（5 μm），對切片進行HE染色，經掃描后，根據Ashcroft肺纖維化評分標準[10-11]，在10倍鏡下以組織學特征為依據對HE片進行全片連續評分，將肺纖維水平分為0～8個等級，取平均值為該片評分并進行統計學分析，評分標準見表1。

Tab.1 Criteria for grading lung fibrosis（HE staining）

Masson染色常用于評估膠原沉積，大分子如膠原纖維被染成藍色，而小分子如肌纖維、胞漿等則被染成紅色。對小鼠肺組織切片進行Masson染色，并運用Image J軟件對藍染組織面積比例進行量化分析。

1.5 免疫組織化學檢測肺組織中Ⅰ型膠原蛋白的表達

COL1是上皮間充質轉化的標志性蛋白產物，可作為肺纖維化程度評估的重要指標，采用免疫組織化學染色的方法特異性染COL1A2檢測COL1的表達，對肺組織病理切片進行常規脫蠟處理、抗原修復、阻斷過氧化物酶處理、BSA封閉后，一抗（1∶300）工作液37℃孵育1 h，孵育對應的二抗工作液37℃，1 h后進行DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素染核后脫水封片，掃描。

1.6 RT-PCR檢測COL1A2 mRNA的表達

用RT-PCR定量檢測COL1A2mRNA的表達，從肺組織中提取總RNA，采用Thermo Scientific Revert Aid RT試劑盒進行逆轉錄后進行實時定量PCR，COL1A2引物F：ATGTGCCACTCTGACTGGAA；R：TCCATCGGTCATGCTCTCTC。使用Agilent Mx3000P qPCR System實時熒光定量PCR儀進行實時監測，采用2-△△Ct法表示待測基因mRNA相對表達水平。

1.7 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，通過GraphPad Prism 7軟件進行統計分析，組間差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠放射性肺纖維化模型的鑒定

模型組小鼠經過全胸單次照射后4～6周，照射區域毛發開始變白，持續至26周（圖1A）。解剖后可見正常對照組小鼠肺呈淡粉色，形態正常，而模型組小鼠肺則有不同程度損傷，部分有發白、萎縮的情況出現（圖1B）。照射后小鼠生存率呈2個階段性下降，在終點第27周，模型組小鼠生存率為45%，中位生存期為178 d（圖1C），照射后2周小鼠體質量呈現明顯下降，之后有所回升，照射后第26周，模型組小鼠平均體質量低于20 g，明顯低于正常對照組（P＜0.01）（圖1D和E）。評估了照射26周后小鼠肺功能情況。結果顯示模型組小鼠肺功能受到嚴重損傷，相較于正常對照組小鼠，FVC明顯下降（P＜0.01）（圖1F），Cydn也顯著下降（P＜0.01）（圖1G）。HE染色可見未照射小鼠肺泡結構完整，Masson染色未見明顯膠原沉積，而照射小鼠則出現嚴重肺病理損傷，喪失肺泡正常結構，出現大片融合現象，局部表現為完全的纖維化阻塞，Masson染色可見大片藍染區域（膠原沉積部位），說明照射小鼠肺部出現嚴重膠原累積（圖1H和I）。總之，照射后小鼠肺受到明顯損傷，呈現明顯纖維化改變，表明造模成功。

2.2 PMlD預處理可改善放射性肺纖維化小鼠的生存率和體質量下降

Fig.1 Establishment of radiation pulmonary fibrosis（RPF）mouse model.Totally 72 female C57/6J mice aged 6-8 weeks were randomly divided into two groups：the normal control group（n=12）and the model group（n=60）.The mice were fasted for 12 h before anesthesia，and the mice were anesthetized with 1%sodium pentobarbital 0.6 mg·kg-1，exposed from underarms to the sternal process of the sternum.A single dose of Co6017.5 Gy whole chest irradiation was performed with a radiation dose rate of 104.53 cGy·min-1.A：appearance of irradiated and non-irradiated mice.After irradiation，the hair in the irradiated area of the mouse turned white，and there was hair loss to different degrees；B：lung appearance of mice（left）；C：survival rate of mice（right）；D：body mass of mice；E：body mass of mice at the 26thweek after irradiation（the end stage）.±s.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；F：forced vital capacity（FVC）at the end stage；G：pulmonary dynamic compliance（Cydn）at the end stage；H：HE staining；I：Masson staining.

照射后，各照射組小鼠出現不同程度的死亡，至27周終點期間，模型組小鼠生存率下降至45%，中位生存期為178 d；PMID 7.5 mg·kg-1組小鼠生存率下降至40%，未見改善；而PMID 15.0 mg·kg-1組、PMID 30.0 mg·kg-1組和PFD組小鼠中位生存期均＞189 d（圖2A）其中，PMID 15.0 mg·kg-1組小鼠在終點生存率為73%，較模型組生存率高28%，較PFD陽性對照組生存率高15%（圖2B）。小鼠的死亡主要集中在照射后4周內及第20周后，而在前一階段，PMID 15.0 mg·kg-1組和PMID 30.0 mg·kg-1組小鼠并未出現死亡（圖2A）。照射后1周內各組小鼠體質量出現明顯下降，并在1周后回升，25周后，模型組小鼠再次出現較明顯體質量下降（圖2C）。至27周終點，各照射組小鼠平均體質量均低于正常對照組小鼠平均體質量，各照射組中模型組平均體質量最低（圖2D）。

2.3 PMlD預處理可提高放射性肺纖維化小鼠的肺FVC和Cydn值

Fig.2 Effect of 3-（3-pyridylmethylidene）-2-indolinone（PMlD）on survival rate and body mass of RPF mice.PMID was given 1 week before the experiment,twice a day,at intervals of more than 6 h,for 2 weeks.A：survival rate of each group，staged declines happened within 4 and 20 weeks after irradiation；B：survival rate of model，PMID 15 mg·kg-1and PFD 15 mg·kg-1group；C1-C6：body mass of each group，irradiation mice showed staged declines in 1 to 25 weeks after radiation；D：body mass of each group.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.3 Effect of PMlD on lung respiratory function of RPF mice at 26 weeks after irradiation.See Fig.2 for the mouse treatment.x ± s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

肺功能檢測結果（圖3）顯示，Co60照射后26周后，與正常對照組相比，模型對照組小鼠FVC值〔（0.26±0.08）mL〕和 Cydn值〔（0.006±0.002）mL·cm-1H2O〕明顯下降（P＜0.01）；與模型對照組相比，PMID各組小鼠肺功能下降情況得到明顯改善，其中PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組小鼠FVC值分別為0.55±0.09和（0.52±0.05）mL（圖3A），Cydn值分別提升至0.019±0.004和（0.018±0.002）mL·cm-1H2O（P＜0.05）。

2.4 PMlD預處理可減輕放射性肺纖維化小鼠的肺病理損傷

HE染色結果（圖4）顯示，正常對照組小鼠肺部結構正常，肺泡間隔無增厚，血管周圍無明顯細胞浸潤。模型對照組小鼠肺泡結構遭嚴重破壞，失去正常肺泡結構，出現大面積纖維化，血管周圍有大量炎細胞浸潤，甚至有“蜂窩肺”表現。與模型對照組相比，PMID各劑量組肺損傷有一定程度緩解，PMID 15.0和30.0 mg·kg-1組肺部基本可見正常結構，肺泡壁有不同程度增厚，偶可見纖維帶或小纖維團塊。

肺組織纖維化評分結果顯示，與正常對照組肺組織纖維化評分0.84±0.19相比，模型對照組肺組織纖維化評分明顯升高，為5.99±0.69（P＜0.01）。與模型對照組相比，PMID 7.5和15.0 mg·kg-1組肺組織纖維化評分分別為2.75±0.45和2.65±0.42，明顯低于模型對照組（P＜0.01）。

2.5 PMlD預處理可降低放射性肺纖維化小鼠的肺膠原含量

正常對照組肺泡間隔幾乎無膠原沉積（13.54±3.42）%，僅小血管周圍有一定膠原沉積。模型對照組則可見大量膠原物質沉積（52.17±8.39）%（P＜0.01）。PMID各給藥組膠原沉積情況相較于模型對照組有明顯減輕，主要沉積于血管周圍沉積，肺泡壁僅有少量膠原沉積。其中，PMID 15.0 mg·kg-1組〔（15.55±3.40）%〕、30 mg·kg-1組〔（17.94%±4.70）%〕和PFD組〔（12.92±3.50）%〕藍染組織面積比例較模型對照組明顯下降（P＜0.01）（圖5）。

2.6 PMlD預處理可減少放射造成的Ⅰ型膠原形成

免疫組化結果（圖6A）顯示，正常對照組小鼠肺僅氣管周圍有少量COL1A2陽性表現，而模型對照組視野內可見大量COL1A2陽性區域染色，PMID給藥組和PFD組COL1A2表達均有所下降，其中，PMID 7.5 mg·kg-1組陽性反應最弱。

Fig.4 Effect of PMlD on lung histopathological damage of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.5 Effect of PMlD on lung collagen deposition of RPF model mice at the 26thweek after irradiation by massion staining.See Fig.2 for the mouse treatment.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=12，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05 ，##P＜0.01，compared with model control group.

Fig.6 Effect of PMlD on expression of COL1A2 of RPF model mice by immunohistochemical staining（A）and RT-PCR（B）.See Fig.2 for the mouse treatment.±s，n=4，＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model control group.

RT-PCR的結果（圖6B）顯示，照射后，各組小鼠COL1A2mRNA均有升高。其中，與正常對照組相比，模型對照組COL1A2mRNA表達上升（P＜0.05）。與模型對照組相比，PMID 7.5 mg·kg-1組COL1A2mRNA表達下降（P＜0.05），與免疫組織化學染色的結果相符，說明PMID預處理可減少輻射造成的COL1形成。

3 討論

17.5 Gy Co60單次全胸照射后2周內及24周后，照射小鼠體質量下降，活動減少，嚴重者甚至出現死亡。在照射后4周，被照射小鼠開始出現照射區域皮毛變白的情況。長期觀察小鼠生存率及體質量變化，可見照射小鼠體質量始終低于正常對照組小鼠體質量，給予PMID或PFD可在一定程度上減輕小鼠的體質量下降；照射后26周，模型組小鼠死亡過半，解剖發現小鼠肺出現局部肉眼可見損傷，甚至發白、萎縮；給予小鼠不同濃度的PMID可避免照射后小鼠的早期死亡發生。侵入性肺功能檢測結果說明，給予PMID能顯著改善照射造成的小鼠肺功能下降，并且，PMID 15 mg·kg-1組無論生存率還是肺功能的改善方面，效果均優于PFD。HE染色可見，PMID預防給藥小鼠肺結構較為正常，肺泡間隔增厚情況相較于模型組有明顯減輕，病理損傷評分由模型組的5.99±0.69降至2.88±0.60，說明對其病理損傷有明顯改善。Masson染色結果也說明，給予PMID預處理能有效減少照射后小鼠肺膠原物質沉積。總之，PMID預防給藥能明顯減輕RPF小鼠肺纖維化病變，且效果優于PFD。

RPF是一種進展性肺損傷，伴有慢性炎癥和異常器官修復[4，7]，其特征包括肌成纖維細胞增生、膠原累積、肺泡間隙增厚和正常肺結構的破壞[12]。模型組小鼠中表現為HE染色片中肺正常結構損壞，肺泡間隔增高；Masson染色片中可見大量膠原纖維累積。異常修復過程會使肺失去正常結構，原有的肺泡結構和血管組織遭到破壞，影響肺正常呼吸功能，引起肺功能下降、血氧飽和度下降以及肺動脈高壓等[6]。在RPF小鼠模型中可觀察到肺纖維化關鍵指標FVC與Cydn的下降。慢性放射損傷本質上是一種異常的傷口愈合，越來越多的證據表明，損傷表型由慢性炎癥維持，導致轉化生長因子β的過度表達和激活，從而導致實質細胞耗竭和過度纖維化[13-14]。

Nrf2在纖維化病變中起到重要作用。一方面，氧化應激是RPF的主要機制之一[4，7，15-16]，Nrf2可與抗氧化反應元件結合，促進下游抗氧化酶如NADPH醌氧化還原酶和血紅素加氧酶1的表達，發揮抗氧化作用，起到保護細胞的作用[9，17]。除此之外，Nrf2可阻斷Smad2/3磷酸化，阻礙其復合物形成，從而抑制轉化生長因子β/Smad信號通路[18-20]，減少下游纖維化產物如COL1等的形成，發揮其抗纖維化作用[21-22]。本研究結果顯示，PMID發揮抗肺纖維化作用可能也與Nrf2對該通路的抑制作用有關。

綜上所述，PMID在RPF模型小鼠中表現出很好的防護作用，有望成為放射性肺纖維化的新型藥物，具有極大的臨床開發價值。