BAPTA-AM通過抑制炎癥和氧化損傷改善脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷

俞巧麗，莫澤君，宋必衛

（1.浙江醫院藥劑科，浙江 杭州 310007；2.浙江大學醫學院附屬第二醫院藥劑科，浙江 杭州 310009；3.浙江工業大學藥學院藥理學科，浙江 杭州 310014）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由嚴重感染、創傷、酸中毒、腸缺血和輸血等引起的肺部炎癥性疾病[1]，臨床表現為呼吸窘迫和難治性低血氧[2]，具有極高的死亡率[3]。肺泡上皮緊密排列著肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞，肺泡Ⅱ型上皮細胞能分泌表面活性物質降低表面張力，使肺泡保持開放，促進氣體交換[4]。ALI早期表現為肺泡毛細血管內皮細胞與肺泡上皮細胞損傷，肺泡屏障通透性增高，中性粒細胞大量積累并釋放炎癥介質，誘導炎癥和氧化損傷[4-6]。目前ALI的臨床治療主要有機械通氣、液體通氣和體外膜氧合技術等[7-9]，尚無有效的藥物治療方案。大量研究表明，抑制炎癥[10]和氧化損傷[11]可改善ALI，因此具有抗炎和抗氧化損傷作用的化合物具有良好的治療ALI前景。

1，2-雙（2-氨基苯氧基）-乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸〔1，2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N，N，N’，N’-tetraacetic acid，BAPTA-AM〕是一種Ca2+螯合劑，能在細胞內被酶解生成BAPTA，已被證明可以保護神經元，抑制細胞氧化應激和凋亡[12-14]，目前國內外尚未見BAPTA-AM抗肺損傷方面的報道。BAPTA-AM在水中溶解度低，本研究使用納米顆粒作為脂質體載體，通過乙醚注射法制備BAPTAAM納米脂質體（BAPTA-AM nano-liposome，BAPTA-AML）。納米脂質體可保護BAPTA-AM的穩定性，并能選擇性地在靶組織積累，提高藥物療效，減輕藥物的不良作用[14]。鑒于減輕炎癥和氧化損傷的ALI治療有重要意義，本研究使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和缺糖缺氧復糖復氧（oxygen-glucose deprivation/recovery，OGD/R）建立小鼠和A549細胞ALI模型，探索BAPTA-AM的抗ALI作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑和主要儀器

A549細胞購自美國ATCC細胞庫，接種RPMI-1640（含10%胎牛血清）培養液，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

清潔級健康雄性ICR小鼠，體質量20～22 g，購自浙江省醫學科學院動物中心，許可證號：SCXK（浙）-2014-0001。實驗小鼠于實驗室條件飼養：恒溫20～24℃，自由飲水，標準飼料喂食，光照周期12 h照明與12 h黑暗交替進行。待小鼠適應環境（約7 d）后，禁食12 h，進行實驗。

BAPTA-AM和BAPTA-AML購自合肥恒星科技開發有限公司，噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自上海吉諾醫藥生物技術有限公司；LPS購自西亞試劑；羅丹明123（rhodamine 123，Rh 123）購自南京凱基生物技術有限公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；地塞米松（dexamethasone，Dex）磷酸鈉注射液購自天津金耀藥業有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

NU-5510E CO2培養箱（Thermo，美國），熒光顯微鏡（尼康，日本），Synergy HI多功能酶標儀（BioTek，美國），LDZ5-2高速冷凍離心機（Heraeus，德國），HM325輪轉式石蠟切片機（MICROM，德國）。

1.2 建立缺糖缺氧復糖復氧細胞模型及分組處理

取對數生長期A549細胞，以每孔1×104細胞接種于96孔板，分為正常對照組（含10%FBS的RPMI-1640）、OGD/R模型組（先用無糖RPMI-1640培養液，于持續通入氮氣1 h的37℃培養箱中缺氧培養12 h；之后使用含2 g·L-1葡萄糖的RPMI-1640培養液并在正常含氧量培養箱內繼續培養6 h）；BAPTA-AM 0.005，0.05，0.5和5 nmol·L-1組加相應濃度BAPTA-AM培養30 min后同模型組方法進行培養。

MTT法檢測96孔板中A549細胞存活，收集細胞培養液按試劑盒說明書檢測LDH活性，裂解細胞按試劑盒說明書檢測NO和MDA含量及SOD活性。

1.3 Rh123染色法檢測線粒體膜電位

收集細胞后以每孔5×104細胞接種于24孔板，分組處理同1.2，培養結束后棄培養液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，加含Rh123 10 mg·L-1的無酚紅RPMI-1640培養液，37℃孵育30 min，PBS清洗后加適量無酚紅RPMI-1640培養液，熒光顯微鏡下觀察、拍照，多功能酶標儀檢測96孔板中熒光值（激發波長：507 nm，發射波長：527 nm）。Rh123為膜電位敏感的親脂性陽離子熒光染料，能選擇性地在活細胞線粒體內聚集，發出黃綠色熒光，其強度可間接反映線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，Δψ）的高低。

1.4 lCR小鼠ALl模型的制備及處理分組

健康ICR小鼠隨機分成6組，每組8只：正常對照組、ALI模型組（尾靜脈注射LPS 10 mg·kg-1）、Dex組（尾靜脈先后注射LPS 10 mg·kg-1和Dex 5 mg·kg-1）和BAPTA-AML 25，50和100 μg·kg-1治療組（尾靜脈先后注射LPS 10 mg·kg-1和BAPTAAML 25，50或100 μg·kg-1）。正常對照組和ALI模型組注射同等容積的生理鹽水，實驗過程中各組小鼠均自由飲水，小鼠最后一次尾靜脈注射6 h后，摘眼球取血，室溫靜置30 min，于1000×g離心10 min制備血清。

1.5 肺系數計算

取血后，小鼠快速處死取整肺，預冷PBS漂洗3次，吸干表面水分，稱取整肺質量。新鮮左肺下葉稱重后于60°C烘箱烘烤48 h至恒重，稱量干重，計算肺組織濕干（lung wet/dry，W/D）比。肺系數=肺質量/體質量×100%。肺組織濕干比=肺濕重/肺干重。

1.6 試劑盒檢測小鼠血清LDH活性，ELlSA檢測小鼠血清TNF- α和lL-6的含量

按說明書測定小鼠血清LDH活性，使用ELISA檢測小鼠血清TNF-α和IL-6含量。

1.7 試劑盒檢測小鼠肺組織MPO和SOD活性及MDA的含量

右肺稱重后按質量體積比1∶9加所需體積的預冷PBS，充分勻漿，4℃，1000×g離心20 min，取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，按說明書檢測MPO和SOD的活性及MDA的含量。MPO是中性粒細胞功能和激活的標志，本研究使用MPO活性反映小鼠肺組織中中性粒細胞的積累變化。

1.8 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察小鼠肺組織的病理變化

左肺上葉經4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織的病理變化，隨機選取10個視野，采用Smith等[15]方法進行病理評分（表1）。重點評價：①肺充血及肺出血；②肺泡水腫；③肺泡及炎癥細胞浸潤；④肺泡間隔增厚及透明膜形成等。

Tab.1 Score of lung pathology in mice with acute lung injury（ALl）

1.9 統計學分析

實驗結果數據用±s表示，采用GraphPad Prism 7.0處理及分析實驗數據，采用單因素方差分析法檢測均數差異顯著性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BAPTA-AM改善OGD/R導致的A549細胞損傷

MTT結果（圖1A）顯示，與正常對照組相比，細胞經缺糖缺氧培養12 h，復氧復糖培養6 h后，OGD/R模型組細胞存活率下降（P＜0.05），細胞培養液中LDH活性升高（P＜0.05）（圖1B），細胞中MDA和NO含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）（圖1C-D）；與OGD/R模型組相比，BAPTAAM 0.05，0.5和5 nmol·L-1組細胞存活率升高（P＜0.05），培養液中LDH活性降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），而BAPTA-AM 0.005 nmol·L-1組與模型組相比無顯著性差異；而不同濃度的BAPTAAM組都能降低細胞內MDA和NO含量（P＜0.05），圖1C和D顯示，BAPTA-AM具有良好的抗氧化損傷能力。實驗結果表明，BAPTA-AM改善細胞損傷、抗氧化應激作用，在0.5 nmol·L-1時效果最佳，濃度增大反而作用有所減弱。

2.2 BAPTA-AM降低OGD/R導致的線粒體膜電位

Fig.1 Effect of BAPTA-AM pretreatment on A549 cells injured by oxygen-glucose deprivation/recovery（OGD/R）.A549 cells were cultured in the absence of serum and glucose in RPMI-1640，exposed to 95%N2and 5%CO2for 12 h.Then，the culture medium was replaced with RPMI-1640 containing normal glucose and 10%（V/V）fetal bovine serum under 5%CO2and normoxic condition for 6 h as OGD/R.BAPTA-AM 0.005，0.05，0.5 and 5 nmol·L-1was added to the cell cultures 30 min prior to ODG/R.A：survival rate of A549 cells detected by MTT assay；B：activity of lactic dehydrogenase（LDH）in culture medium of A549 cells；C：malondialdehyde（MDA），nitric oxide（NO）level；D：activity of superoxide dismutase（SOD）in A549 cells.±s，n=6，＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

線粒體膜電位結果（圖2）顯示，OGD/R模型組細胞線粒體膜完整性被破壞，黃綠色熒光強度降低（P＜0.05）。BAPTA-AM 0.05，0.5和5 nmol·L-1組細胞線粒體黃綠色熒光強度升高（P＜0.05），提示BAPTA-AM處理顯著改善線粒體對Rh123的攝取能力，穩定Δψ，維持膜功能，有效保護線粒體；而BAPTA-AM 0.005 nmol·L-1組與模型組相比無顯著性差異。

2.3 BAPTA-AML對ALl模型小鼠肺系數及肺W/D比的影響

Fig.2 Effect of BAPTA-AM on mitochondrial membrane potential of A549 cells injured by OGD/R and detected by fluorescence microscope.See Fig.1 for the cell treatment.A：fluorescence images of rhodamine123 staining detected by fluorescence microscope；B：quantitative analysis of fluorescence intensity in A.RFU：relative fluorescence unit.±s，n=6，＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05 compared with model group.

Fig.3 Effect of BAPTA-AM nanoliposome（BAPTAAML）on lung coefficient（A）and lung wet/dry（W/D）ratio（B）in ALl model mice induced by lipopolysaccharide（LPS）.BAPTA-AML 25，50，100 μg·kg-1or dexamethasone（Dex）5 mg·kg-1was given through tail intravenous injection（iv）after LPS（10 mg·kg-1，iv）administration.After 6 h，the mice in each group were euthanized，and lung tissues and blood were harvested immediately.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05 compared with model group.

與正常對照組比，模型組小鼠肺系數及肺W/D比升高（P＜0.05），不同濃度BAPTA-AML組以上指標顯著降低（圖3A，B）；Dex 5 mg·kg-1組肺W/D比和肺系數降低（P＜0.05），給藥組與陽性對照組比較無統計學差異。

2.4 BAPTA-AML對ALl模型小鼠肺組織MDA含量和SOD活性及血清LDH活性的影響

結果（圖4）顯示，與正常對照組比，模型組小鼠血清LDH活性升高（P＜0.05），肺組織MDA含量上升（P＜0.05）和SOD活性降低（P＜0.05），Dex 5 mg·kg-1和BAPTA-AML 25，50，100 μg·kg-1可逆轉上述作用（P＜0.05）；其中BAPTA-AML 25和50 μg·kg-1降低血清LDH水平和肺組織MDA含量的作用優于Dex 5 mg·kg-1組（P＜0.05），且BAPTA-AM各劑量升高SOD活性的作用優于Dex 5 mg·kg-1（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of BAPTA-AML on oxidative stress factors MDA（A）and SOD（B）in lung tissue，and LDH activity（C）in serum of ALl model mice.See Fig.3 for the mouse treatment.x±s，n=8.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05 compared with model group；△P＜0.05，compared with Dex 5 mg·kg-1group.

2.5 BAPTA-AML對ALl模型小鼠肺組織炎癥因子的影響

結果（圖5）顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠MPO活性、TNF-α和IL-6含量升高（P＜0.05）；與模型組比，Dex和不同濃度BAPTA-AML組以上指標降低（P＜0.05）；且BAPTA-AML 50 μg·kg-1組降低MPO活性和TNF-α含量的效果優于陽性對照Dex5mg·kg-1（P＜0.05），BAPTA-AML25和50μg·kg-1降低IL-6含量的作用高于陽性對照Dex 5 mg·kg-1（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of BAPTA-AML on myeloperoxidase（MPO）activity（A）in lung tissue and TNF- α（B），lL-6（C）levels in serum of ALl model mice.See Fig.3 for the mouse treatment.x ± s，n=8. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；△P＜0.05，compared with Dex 5 mg·kg-1group.

2.6 BAPTA-AML對ALl小鼠肺組織病理變化的影響

HE染色（圖6A）及肺損傷評分（圖6B）結果顯示，正常對照組肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡壁薄；而模型組肺泡結構嚴重破環，肺泡腔明顯縮小，部分肺泡腔融合，肺組織內有大量散在的淋巴細胞和紅細胞，肺間隔增厚，炎癥細胞浸潤，肺損傷評分明顯高于正常對照組（P＜0.05）；BAPTA-AML 50 μg·kg-1治療組肺組織損傷明顯減輕，結構趨于正常，肺間隔較模型組變薄，肺泡腔融合消失，僅少量淋巴細胞和紅細胞滲出，少見炎癥浸潤，肺損傷評分較模型組降低（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of BAPTA-AML on histopathology in lung tissues in ALl model mice by HE staining.See Fig.3 for the mouse treatment.A：HE staining.B：score of lung injury pathology in A.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.The lung structure manifested pathological changes induced by LPS，which included structure despite a few lymphocytes or a little red blood cell exudation.Arrows show alveolar cavity shrinking，thickening alveolar septum，inflammatory cell infiltration and the formation of hyaline membranes.

3 討論

A549細胞為亞三倍體肺泡基底上皮細胞，被廣泛用作肺腺癌的模型以及肺泡Ⅱ型上皮細胞的體外模型。本研究通過OGD/R處理A549細胞，結果顯示模型組細胞活力下降，LDH活性升高，產生氧化應激，促進NO釋放，提示細胞損傷模型建立成功。

生理狀態下，氧自由基不斷產生也不斷被清除，對細胞無損傷，而在一定外源因素的誘導下，細胞代謝過程中產生過多氧自由基，誘導細胞損傷。MDA是典型的脂質過氧化物，其含量的多少指示組織脂質過氧化的程度，SOD活性高低間接反映組織清除氧自由基的能力，同時測定MDA含量和SOD活性可反映肺組織氧化損傷程度。NO性質活潑，高劑量NO能降低肺表面活性物質功能，激活巨噬細胞，對肺上皮細胞產生氧化損傷[16]，并能損傷線粒體[17-18]，促使線粒體膜通透性改變，Δψ下降，釋放細胞色素c并激活胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase 3），導致細胞凋亡[19-21]。Ca2+超載亦能引起氧化應激，并能通過線粒體細胞死亡通路調控細胞凋亡[22]。BAPTA是良好的Ca2+螯合劑，其乙酰氧甲基化物BAPTA-AM易進入細胞[23]，并在細胞內水解生成BAPTA，有效絡合細胞內Ca2+，且對細胞無毒性[24]。有研究報道BAPTA-AM能保護Ca2+超載介導的Δψ崩潰，減少胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的釋放，抑制細胞凋亡[14，25]。本研究體外實驗結果表明，BAPTA-AM能提高OGD/R處理的A549細胞活力，抑制LDH活性，改善細胞氧化損傷，減少NO的合成，且BAPTA-AM能改善OGD/R誘導A549細胞的Δψ崩潰，維持線粒體膜功能，進而減少細胞凋亡，由此可見本文研究結果與研究報道一致。

本研究通過尾靜脈注射LPS建立小鼠ALI模型，從血清中可發現小鼠炎癥因子較正常對照組顯著上升，且病理切片顯示模型組小鼠肺泡結構被破壞，呈現肺水腫和炎癥細胞浸潤，提示造模成功。

ALI發生時，肺泡毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞通透性增加，造成肺泡及間充質滲透性水腫，肺水腫發生。采用肺系數和肺W/D比測定可間接反映肺組織含水量，衡量肺水腫程度。本研究體內實驗結果表明，BAPTA-AML能顯著降低LPS誘導的ALI模型小鼠肺W/D比和肺系數，改善ALI小鼠肺水腫。進一步研究顯示，BAPTA-AML能降低LDH的活性，抑制ALI小鼠氧化損傷。

ALI患者肺泡與肺間充質內積聚大量富含蛋白質及多種炎癥細胞的水腫液，促進中性粒細胞向肺間充質和肺泡腔移行[4]。激活的中性粒細胞介導活性氧的產生，刺激NF-κB表達[11，26]，釋放大量促炎因子如TNF-α和IL-6等，促進細胞凋亡[27]，進一步損傷肺泡上皮細胞屏障[4，9]。XU 等[28]和 SAKURADA等[29]報道，BAPTA-AM能減少NF-κB的激活，消除還原型輔酶Ⅱ介導的氧化應激。在肺泡Ⅱ型上皮細胞中，Ca2+作為信使參與肺泡表面活性物質的分泌，BAPTA-AM與Ca2+絡合后，內質網結合型的Ca2+被釋放，通過信號轉導，維持胞內Ca2+濃度平衡，促進肺泡表面活性物質大量分泌，改善肺損傷。肺組織MPO活性，可反映組織中中性粒細胞的含量，間接反映肺組織炎癥浸潤程度，且MPO催化反應還會生成過量的氧化物，導致氧化應激和氧化性組織損傷。本文研究結果顯示BAPTA-AML能降低LPS誘導的ALI模型小鼠MPO活性、血清TNF-α和IL-6含量，提示BAPTA-AML能減少中性粒細胞的積累，減輕肺部炎癥；且從病理切片可見BAPTAAML能減少ALI小鼠淋巴細胞和紅細胞滲出，改善肺部炎癥，減輕肺組織病理損傷，保護肺組織。

細胞實驗和體內實驗結果表明，BAPTA-AM改善ALI具有濃度或劑量依賴性，細胞實驗中0.5 nmol·L-1時效果最佳，體內實驗中50 μg·kg-1時擁有最佳效果，作用效果與給藥劑量不是成正比。

綜上所述，BAPTA-AM具有抗炎和抗氧化損傷作用，能抑制損傷細胞NO的合成，提高細胞活性，減輕ALI小鼠肺水腫，改善肺組織病理變化，具有良好的治療ALI效果，有望為ALI的臨床治療帶來新的方案。