野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶慢病毒表達載體的構建及其驗證

萬祿明，李素波，贠志敏，張 雪，高紅偉，宮 鋒，檀英霞

（軍事科學院軍事醫學研究院衛生勤務與血液研究所，北京 100850）

1975年，Magnus等[1]在大鼠肝中發現了一種可以降解硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的內切糖苷酶，隨后其被命名為乙酰肝素酶（heparanase，HPA）。之后研究人員在人胎盤滋養層細胞、內皮細胞、血小板、白細胞、肥大細胞、黑素瘤和多種腫瘤細胞和組織中陸續發現有HPA的表達[2-9]。1999年，3個研究小組分別從人血小板、胎盤和黑素瘤中克隆出HPA基因[10-12]。HPA是目前已發現的哺乳動物體內唯一可以降解HS蛋白聚糖上HS側鏈的內切糖苷酶，通過降解HS，HPA促進細胞外基質和細胞基底膜結構的降解和重塑[13-14]。

HPA在惡性腫瘤發生和發展中的酶活性作用已經被廣泛深入地研究[15]，其在乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、腦部腫瘤、頭頸部腫瘤、骨尤文氏肉瘤、胃癌、前列腺癌、腎癌、結腸癌、膀胱癌、多發性骨髓瘤和B淋巴細胞瘤等多種惡性腫瘤中的表達顯著增多[16-18]。普遍觀點認為，HPA的高表達與腫瘤患者的不良預后明顯相關，其主要通過降解HS而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。

關于HPA的非酶活性，雖然其受體仍未確定，但有報道HPA可以通過非酶活性發揮作用。例如，將HPA的酶活性位點（Glu225和Glu343）由谷氨酸突變為丙氨酸后，HPA可以通過激活Akt相關通路促進內皮細胞的黏附和遷移[19]。此外，在結腸癌和膠質瘤細胞中，無酶活性的HPA也可以通過促進Akt和Src的磷酸化，導致血管內皮生長因子A的上調[20-21]。

為了更好地研究HPA的病理生理功能，尤其是深入探討其酶活性作用和非酶活性作用，本研究采用基因工程的手段構建了野生型和E225/343A突變型的HPA慢病毒表達載體，利用人紅白血病細胞系HEL對其進行了生物學驗證，為更好地研究HPA在體內的病理生理功能尤其是深入探討其酶活性作用和非酶活性作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

DMEM和1640培養基，美國Hyclone公司；胎牛血清，上海吉泰依科賽公司；感受態細胞DH5α來自北京全式金生物公司；DNA分子質量標準物，美國Thermo Scientific公司；瓊脂糖，北京賽百盛基因技術有限公司；CloneExpressTMⅡ一步法克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技公司；Taq酶和dNTP，美國Clontech公司；限制性內切酶，美國NEB公司；質粒抽提試劑盒，美國Promega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，北京天根公司；小鼠抗人HPA單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，美國proteintech公司；HRP標記的抗小鼠IgG抗體（二抗），美國CST公司；檢測多配體蛋白聚糖1的ELISA試劑盒來自武漢博士德公司；小鼠抗人的HS單克隆抗體（抗-10E4表位），英國amsbio公司；大鼠抗小鼠的PE偶聯IgM（二抗），美國Ebioscience公司；lipo293TM轉染試劑，碧云天公司；聚凝胺，北京索萊寶公司；嘌呤霉素，大連美侖公司。PCR儀來自美國AppliedBiosystems公司；電泳儀、轉膜儀和凝膠成像儀來自美國Bio-Rad公司；細菌搖床來自美國Thermo Scientific公司；高速離心機來自德國Sigma公司；細菌培養箱來自上海一恒公司；流式細胞儀來自美國BD公司；ELISA洗板機來自美國BioTEK公司。

1.2 細胞、質粒和模板

HEK-293T細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養；HEL細胞系購自上海酶研生物科技有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養基中培養。過表達慢病毒質粒載體GV358來自上海吉凱基因化學技術有限公司，其元件順序為Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin，酶切位點為AgeI/AgeI。輔助包裝質粒psPAX2和pMD2.G保存于本實驗室。基因擴增模板由上海吉凱基因化學技術有限公司提供：在NCBI的Genebank數據庫中搜索人乙酰肝素酶（HPSE）的mRNA序列，其序列號為NM_006665，按照基因的CDS序列，設計全長引物，利用重疊延伸PCR方法形成模版DNA，然后將PCR產物轉化克隆至pEGFP-N1質粒載體中。

1.3 引物設計

根據GV358質粒載體的序列信息，以pEGFPHPSE-N1質粒為模板，PCR擴增得到待與GV358質粒載體進行重組反應的野生型HPSE基因片段，擴增引物設計如下其中斜體部分為交換配對堿基，下劃線部分為酶切位點，粗體部分為表達增強序列，小寫部分為HPSE基因CDS區的擴增序列（交換配對堿基、酶切位點、表達增強序列均是GV358質粒載體上存在的序列，利于之后的重組反應；由于HPA后融合表達了3FLAG標簽，所以下游酶切位點的數目以不引起移碼突變為準）。所有引物由天一輝遠公司合成。

1.4 定點突變

為了將野生型HPA第225位和343位的谷氨酸（GAA）突變為丙氨酸（GCA），根據重疊延伸PCR的思路，設計如下幾條引物：P3：5’-CGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCCACCATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGC-3’；P4：5’-TGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGATGCAAGCAGCAACTTTGGCATTTC-3’；P5：5’-ACTAGGCAATGCACCTAACAGTTTCCTTAAGAAGG-3’；P6：5’-CTGTTAGGTGCATTGCCTAGTTCCCAAGAAATG-3’；P7：5’-CTGGTTAGGAGCAACAAGCTCTGCATATGGAGGC-3’；P8：5’-AGAGCTTGTTGCTCCTAACCAGACCTTCTTGCCAG-3’。構建流程如下：①以pEGFP-HPSE-N1為模板，以P3和P6為引物進行PCR擴增，得到710 bp的片段a；②以pEGFP-HPSE-N1為模板，以P5和P8為引物進行PCR擴增，得到376 bp的片段b；③ 以pEGFPHPSE-N1為模板，以P7和P4為引物進行PCR擴增，得到635 bp的片段c；④以a+b+c為模板，以P3和P4為引物進行PCR擴增，得到1678 bp的片段d；⑤以d為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到待與GV358質粒載體進行重組反應的HPSE（E225/343A）基因片段。

1.5 野生型和酶活缺失型HPSE慢病毒質粒載體的構建

利用AgeI內切酶對GV358質粒進行酶切，隨后對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。然后線性化質粒載體和目的基因擴增產物，在ExnaseTMⅡ重組酶的作用下進行重組反應，實現線性化質粒載體和目的基因片段的體外環化。隨后將重組產物轉化入DH5α感受態細胞，分別挑取4個單克隆，擴增后進行菌液PCR鑒定，將陽性克隆送生工公司進行測序驗證。將正確克隆菌擴大培養，提取高純度質粒。轉化子PCR鑒定引物：正向：5’-TCTTTGGAGCAGGAAACTACC-3’（針對插入片段序列）；反向：5’-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3’（針對質粒載體自有片段序列）。

1.6 慢病毒包裝

慢病毒包裝系統由吉凱基因GV358慢病毒質粒載體、psPAX2載體和pMD2.G載體3個質粒組成。GV358慢病毒質粒載體除攜帶目的基因序列外，還含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件。psPAX2載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結構蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調節gag和pol基因表達的調節因子。pMD2.G載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。

在10 cm培養皿中培養HEK-293T細胞，待細胞匯合度至80%～90%時，用lipo293TM轉染試劑共轉染 45 μg 質粒（GV358：psPAX2：pMD2.G=4∶3∶2）至HEK-293T細胞中。于感染48和72 h后收集細胞培養基，在4℃條件下，3 000×g離心15 min，然后0.45 μm過濾上清獲得病毒感染液。

1.7 穩轉細胞株構建

用新鮮培養基將生長在對數期的HEL細胞系種至6孔板中，每孔加入培養基的量為1 mL，加入濃度為10 g·L-1的聚凝胺1 μL作感染增強試劑，使其終濃度為10 mg·L-1；分別加入0，50，100，200，500和1000 μL的病毒感染液，輕輕混勻后放入37℃培養箱中培養；72 h后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達，拍照并計數5個視野內的細胞，選取GFP陽性率在80%的轉染組，換液并按1∶1000的比例加入10 g·L-1的嘌呤霉素，即在終濃度為10 mg·L-1的嘌呤霉素培養基中擴大培養。

篩選約2周后，獲得GFP陽性率接近100%的各組細胞，其中穩轉空載體的對照細胞命名為HELCON，過表達野生型HPA的細胞命名為HEL-OE，過表達酶活缺失型HPA的細胞命名為HELMutant OE。

1.8 Western印跡法檢測HPA過表達效果

收集1個10 cm培養皿的細胞，用800 μL的RIPA裂解液，于冰上充分裂解，加入0.25倍體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻后于沸水中煮沸10 min使蛋白變性。隨后進行SDS-PAGE電泳2 h以分離蛋白，電轉1.5 h使蛋白轉移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉于室溫封閉2 h后，4℃條件下過夜孵育一抗（小鼠抗人HPA單克隆抗體以1∶1000稀釋、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體以1∶3000稀釋），TBST洗膜3遍后，室溫條件下以1∶3000的比例孵育二抗，TBST再次洗膜3遍后，加入ECL發光液進行顯影、拍照。最后用Bio-Rad凝膠成像軟件分析條帶積分吸光度值，以目標蛋白與內參條帶積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.9 過表達野生型/酶活缺失型HPA的HEL細胞中HPA酶活性的比較

1.9.1 流式細胞術檢測細胞表面HS表達量的變化

作為一種內切糖苷酶，HPA特異性地降解細胞表面和細胞外基質上的HS。因此，利用針對HS上共有的10E4表位抗體[22-23]，借助流式細胞術檢測細胞表面HS的表達量。等量細胞分別種至10 cm培養皿中，正常培養3 d，收取細胞，PBS洗1遍后，用100 μL的0.2%BSA重懸，加入1 μL HS抗體，室溫避光孵育15 min。PBS洗1遍后，用200 μL的0.2%BSA重懸，均分為2份，其中1份設為空白，另1份則加入大鼠抗小鼠的PE偶聯IgM二抗5 μL，室溫避光孵育15 min。PBS洗滌2遍后，用300 μL的2%多聚甲醛固定細胞，4℃避光保存，1周內流式細胞儀上樣檢測。用flowjo軟件分析數據，通過幾何平均熒光強度（Geo MFI）來表示細胞表面HS的表達量。

1.9.2 ELlSA法檢測細胞培養基中多配體蛋白聚糖1的釋放量

此外，作為細胞表面重要的HSPG，多配體蛋白聚糖1也會在HPA酶活性的作用下從細胞表面釋放[24]。等量細胞分別種至10 cm培養皿中，正常培養3 d，收取細胞培養基，300×g離心收集。根據ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測多配體蛋白聚糖1在細胞培養上清中的含量。在450 nm的條件下讀取各孔吸光度值，以標準品的濃度為橫坐標、相應的A450nm值為縱坐標，繪制標準曲線，最后根據標準曲線的公式計算出樣品的多配體蛋白聚糖1濃度。

1.10 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，所有實驗均經過3次獨立重復實驗。組間比較用非配對t檢驗。使用PrismGraphPad軟件進行數據分析和作圖，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒質粒載體的驗證

瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1A）顯示，野生型重組產物（1，2，3和4號）和酶活缺失型重組產物（5，6，7和8號）的PCR結果均為陽性。隨后的測序結果顯示，與NCBI上HPSE的CDS序列相比，1，2，3和4號重組產物的序列與HPSE基因完全一致，而5，6，7和8號重組產物在Glu225（圖1B）和Glu343（圖1C）位點上的序列均由GAA突變為GCA，實現從谷氨酸到丙氨酸的突變。

Fig.1 Construction of wild type and enzymatic activity deficiency heparanase（HPA）lentiviral expression vectors.A：PCR identification results of positive recombinant products（1→4：wild type，5→8：E225/343A mutant）；B：sequencing identification results of E225A（left：wild type，right：mutant）；C：sequencing identification results of E343A（left：wild type，right：mutant）.

2.2 穩定過表達野生型和酶活缺失型HPA的HEL細胞系的建立

Western印跡結果（圖2A）顯示，HEL-OE和HEL-Mutant OE均檢測到了HPA蛋白的過表達，其中既包括分子質量為65 ku的HPA前體蛋白，也包括分子質量為50 ku的HPA成熟蛋白，此結果與預期結果相符。半定量結果（圖2B）顯示，HEL-OE細胞和HEL-Mutant OE細胞中65 ku和50 ku的HPA表達量相當。

2.3 過表達野生型和酶活缺失型HPA的HEL細胞中HPA酶活性的比較

細胞表面HS的檢測結果（圖3A和B）顯示，HEL-OE細胞表面HS表達量的幾何平均熒光強度（Geo MFI）為 160.0±8.0，較 HEL-CON 細 胞（345.0±15.2）顯著降低（P＜0.01）；而HEL-Mutant OE細胞表面HS表達量的Geo MFI則為353.0±14.0，與HEL-CON細胞表面HS的表達量相當。

Fig.2 Expression of HPA in HEL cells.A：a representative Western blotting result of the expression of HPA（pre-HPA：65 ku；mature-HPA：50 ku）；B：semi-quantitative result of A.HEL：normal cells；HEL-OE：HEL cells overexpressing wild type HPA；HEL-CON：vector control cells；HEL-Mutant OE：HEL cells overexpressing E225/343A mutant HPA.±s，n=3.

Fig.3 Validation of constructed wild type and enzymatic activity deficiency HPA lentiviral expression vectors in HEL cell line.A：a representative flow histogram for the amounts of heparan sulfate（HS）on cell surface.B：geometry mean fluorescence intensity（Geo MFI）of HS on cell surface.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HEL-CON.C：amounts of syndecan-1 in cell culture supernates.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HEL-CON.

細胞上清中多配體蛋白聚糖1的檢測結果（圖3C）顯示，HEL-OE細胞培養基中多配體蛋白聚糖1為（59.0±3.8）ng·L-1，較HEL-CON細胞培養基中的釋放量（32.2±3.9）ng·L-1明顯增多（P＜0.01），而HEL-Mutant OE細胞培養基中的釋放量為（30.9±2.9）ng·L-1，與HEL-CON細胞培養基中的釋放量相當。

3 討論

HS蛋白聚糖是廣泛存在于細胞膜和細胞外基質中的一類生物大分子，它由核心蛋白和以共價鍵方式連接在核心蛋白上的HS糖鏈構成，參與機體多種生命活動的發生、發展與調控。因此，作為哺乳動物體內唯一可以降解HS蛋白聚糖上HS側鏈的內切糖苷酶[25]，HPA在機體的生理病理活動中發揮多種重要作用。

早在2000年，Hulett等[26]就鑒定出HPA的酶活性存在于Glu225和Glu343位點，隨后Goldshmidt和 Nadir等[27-28]通過基因編輯的手段將 Glu225和Glu3432個位點的谷氨酸突變為丙氨酸（E225/343A），在不影響HPA蛋白表達的同時，成功清除了HPA的酶活性。此后，雖然研究者逐漸注意到除了酶活性作用，HPA的非酶活性作用也具有重要研究價值[19-21]，但大部分區分HPA酶活性作用和非酶活性作用的研究都是通過放射性同位素標記HS的方法來作出判定，方法繁瑣并存在安全隱患；相比之下，直接構建野生型和酶活缺失型的HPA過表達載體，可以更加便捷清晰地區分和判定HPA的酶活性作用和非酶活性作用，并有助于對HPA的酶活性作用和非酶活性作用展開系統性研究。

因此，為了更深入地研究HPA的生理病理作用，本研究以基因工程技術為基礎，借助慢病毒感染技術的優勢，成功構建了野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒表達載體。慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒為基礎發展起來的基因治療載體，它可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，可實現目的基因的長時間穩定表達，是細胞實驗的首選。本研究以pEGFP-HPSE-N1質粒為模板擴增HPA基因，用重疊延伸PCR的方法實現了HPA蛋白序列上第225位和第343位谷氨酸向丙氨酸的突變；利用無縫克隆的方法將目的基因片段與GV358慢病毒質粒載體進行拼接；隨后用PCR和進一步的測序實驗對序列進行鑒定和驗證。最后，用構建好的野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒感染HEL細胞，并利用Western印跡實驗證明了野生型和酶活缺失型HPA蛋白的正常表達，而酶活性檢測實驗也證實，相對于能夠有效切割HS的野生型HPA，酶活缺失型的HPA失去了切割細胞膜表面HS的能力。

綜上所述，本研究為深入探討HPA酶活性作用和非酶活性作用提供了慢病毒表達工具，考慮到HPA是機體唯一可以切割HS的內切糖苷酶，這一工具將有助于揭示HPA在調控細胞微環境中發揮的重要作用及其機制。