豬精液冷凍保存技術的研究進展

劉韶娜，趙智勇，張 斌，相德才，趙彥光

（云南省畜牧獸醫科學院，云南 昆明 650224）

1 豬精液冷凍保存技術的進程

隨著人工授精技術的推廣和應用，豬的精液保存技術也逐漸發展，并日益受到關注。1787 年，意大利科學家Spallazani 首次對人和馬的精液在-17 ℃下進行冷凍保存并發現有少數精子存活[1]，Luget和 Hodepp 研究發現-192 ℃條件下人的精子冷凍保存后仍舊有少數精子存活[2]，從而打開了精子冷凍保存的新篇章。1949 年，英國科學家Polge 等發現，甘油對牛的精子冷凍保存具有一定的保護作用，1970年第一次報導有人使用凍融后豬精液進行人工輸精獲得83%受精卵，成功使用凍精進行人工授精的仔豬生產，更加充分地證實了豬精子凍融后仍具有受精能力的觀點[3-4]。我國從20 世紀70 年代開始液氮凍精技術的研究，20 世紀90 年代開始凍精技術逐漸開始由顆粒型轉變為細管型[5]。近年來的研究顯示豬精子冷凍保存精子存活率可達0.5 以上[6-8]。陳明明等研究優化精子基礎稀釋液、甘油濃度和解凍條件發現-80 ℃條件下，精子冷凍后活力可達到0.57[9]。查星琴[10]等對版納微型豬近交系種公豬精液冷凍保存條件研究發現2%和3%的甘油對豬的精液均有良好的保護作用，而50 ℃ 6 s 和40 ℃ 6 s 的水浴解凍條件下精子活力、質膜完整率和頂體完整率均最高。隨著科技的不斷進步，豬的精液冷凍保存技術也越來越先進，在豬的生產中也得到了越來越多的使用。精液冷凍保存技術在奶牛生產中得到了全面的應用，但在豬的繁殖和品種改良方面運用率還較低，還需進一步研究[11]。因此，本研究擬從豬精液冷凍保存技術影響因素和存在問題等方面進行綜述，為豬的精子冷凍保存技術研究提供理論依據、為進一步提高豬的精子冷凍保存技術，提高種豬生產性能而提供理論支持。

2 豬精液冷凍保存技術的影響因素

豬的精液冷凍保存一般采用顆粒保存、細管保存和扁平塑料袋保存3 種，生產實際最常用的是細管保存。精液冷凍保存的流程為：精液的質量檢測、精液冷凍和精液解凍3 步。

2.1 精液的質量檢測

精液的檢測一般通過外觀和顯微鏡檢測兩方面。外觀檢測一般通過顏色、氣味、采精量和質地等幾方面綜合檢測。一般豬的精液呈現出乳白色或者淺灰色，質地均勻無水乳分離現象，氣味為略微腥味無腥臭或者惡臭味，一次容量為300 ～500 mL[5]。

精子的顯微觀察包括活率、密度和形態[11-12]。精子活率通常采用十級評分法評定，一般提前37 ℃預熱，用BST 液稀釋后，在400×倒置顯微鏡下觀察。豬的精子密度一般為2 ～3 億/mL，通常使用血細胞計數法來估算，一般通過稀釋后在40×顯微鏡下觀察[13]。形態觀察則通過頂體完整率和精子畸形率來評定。一般精子畸形率應該低于18%[14]。

2.2 精液的稀釋液和冷凍保護液

豬的精液稀釋液主要成分包括：低密度脂蛋白、膽固醇、冷凍保存劑、多糖、抗氧化劑和緩沖液等[10,15-19]。當精液溫度低于0 ℃后，會形成冰晶，細胞外產生冰晶，使得稀釋液的滲透壓發生變化，促使細胞產生滲透脅迫，而冷凍保護劑可以提高滲透壓，使細胞通過滲透脫水，防止冰晶的產生，從而保護精子[20]。在冷凍稀釋液中添加芝麻酚和番茄紅素均能提高精液冷凍質量，能夠提高解凍后的精液品質，而黃芩素則能在精液解凍過程中起保護作用[21]。糖類為非滲透性保護劑，常用作稀釋液成分的有葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇等，能夠提供能量維持代謝，如葡萄糖能夠通過精子的質膜，利用糖酵解或三羧酸循環而給精子提供一定的能量[21]。姜澤研究發現添加2 mg/mL 的甘露醇能顯著提高冷凍后精子的質膜完整率，可以緩解低溫對精子活率、質膜及頂體完整性的損傷，減少精子凋亡基因的表達量，緩解精子的凋亡程度，從而提高受精率[21]。馬紅通過在民豬精液冷凍稀釋液中添加0.15 mol/L 的海藻糖后發現均能提高精子活率、線粒體膜電位、頂體完整率和質膜完整率[17]。此外，各種單糖和多糖類，如葡萄糖、黃芪多糖、紅景天多糖等均對精子冷凍有保護作用[23-27]。冷凍保護劑類常用的有甘油，卵黃等。其中甘油是目前豬的精液冷凍保存中最常見的成分之一[19]。卵黃在冷凍保護中主要有效成分為低密度脂蛋白，通過其粘附在精子的細胞膜上，在低溫刺激的時候形成一種凝膠化狀態的物質，同時精子膜上的部分磷脂被取代，降低精子膜溫度的轉變；可以與蛋白發生特異性結合，以此來阻止精子膜磷脂和膽固醇的外流，不同來源的卵黃由于各成分比例不同而保護的效果有差異。曹立鵬等發現添加9%鴿蛋來源的低密度脂蛋白對豬精子冷凍保存具有保護作用，解凍后精子活力特征顯著高于其他組[26]。HU 等發現添加9%雞蛋來源的低密度脂蛋白能顯著提高豬精液冷凍保存的質量[27]。Bathgate則認為雞蛋和鴨蛋來源的低密度脂蛋白對豬精子冷凍保存效果要優于鵪鶉蛋[28]。抗氧化劑類主要分兩種，一類是酶類抗氧化劑，如：谷胱甘肽過氧化物酶和SOD 等；一類是非酶類抗氧化劑，如：谷胱甘肽、維生素C、維生素E、青花素等。抗氧化劑的主要作用是通過與精子呼吸代謝產物-活性氧結合，降低精子細胞膜的不飽和脂肪酸氧化，保護了精子結構的完整性[29]。孫燕青研究發現40 ug/mL 的葡萄籽原青花素能顯著降低豬冷凍精液解凍后的畸形率，并顯著提高精子活率和線粒體活性[30]。李世佳通過白藜蘆醇對人的冷凍精子影響研究發現，白藜蘆醇能降低冷凍損傷，改善冷凍后的精子質量和功能[31]。霍敏則認為輔酶Q 可以提高冷凍后的絨山羊精子質量[32]。

豬的精液冷凍劑型常見的有顆粒凍精、細管凍精和扁平塑料袋凍精。顆粒凍精常用一次稀釋法制得，即將精液與稀釋液按一定比例稀釋后直接冷凍。扁平塑料袋精液常用兩次稀釋法制得，即將精液與第一稀釋液按比例混合后，再與第二稀釋液按比例混合后冷凍。細管保存一般分為0.25 mL 和0.50 mL，薛琦[33]研究豬精液冷凍保存后認為，-80 ℃冷凍保存時，兩者無顯著差異，-196 ℃冷凍保存時，0.50 mL細管凍精的冷凍效果明顯優于0.25 mL。細管凍精也是實際生產中使用頻率最高的一種凍精劑型，其具有冷卻迅速，不易污染、使用方便和受胎率高的特點。

2.3 精液的冷凍

豬的精子對溫度的下降速度非常敏感，溫度的變化會影響部分蛋白的功能。當溫度不高于15 ℃的時候，就會造成對精子的質膜損傷，精子細胞內容物向外流失，精子活率開始下降[34]。Althouse 則認為豬的精子臨界溫度是12 ℃[35]。當溫度不高于5 ℃的時候，則影響Ca2+穩定狀態、頂體及膜脂質完整性[36]，同時精子細胞膜上脂質分離，釋放膽固醇，影響脂質和蛋白質間的相互作用[37]。所有的這些變化會影響某些蛋白質的功能。精子的冷凍保存一般是指-196 ℃的超低溫液氮保存，在此溫度條件下，精子進入玻璃化溫度區，即精子膜兩側的液體同時固化為玻璃樣固體，水分子形成堅硬均質的冰結，精子膜能維持正常構造，細胞不會脫水，所有細胞活動都會完全停止，因此理論上講超低溫冷凍精液可以無限期保存。0 ～-60 ℃是有害冰晶區，精子處于冰晶區的時間長短與冰晶大小成正比，對精子的損害也成正比，豬的精子冷凍過程中應該縮短在冰晶區的時間。

精液的冷凍方法一般包括程序冷凍法和液氮熏蒸法。程序冷凍法是通過控制液氮氣化的速率來控制降溫的速率，能夠監控到溫度的變化，但對儀器要求較高。液氮熏蒸法則是直接投放于液氮當中，迅速制冷，對儀器要求較低，操作簡單，但降溫速率不可控制。吳衍等研究發現程序冷凍法處理犬精液后精子質膜完整率和頂體完整率較高，冷凍效果優于液氮熏蒸法[38]，這是由于液氮熏蒸法依靠冷凍支架及細管離液氮面的距離來控制降溫速率的，其受到影響因素大[39]。

2.4 冷凍精子的解凍

冷凍精子的解凍溫度一般分為0 ～5 ℃、30 ～40 ℃（一般為37 ℃）和50 ～70 ℃。不同的溫度對應的解凍時間也不一致。鄭筱峰通過研究姜曲海豬冷凍精液的解凍條件發現，液氮中取出的冷凍精液37 ℃水浴后精子質量明顯優于放置室溫后37 ℃水浴[40]。高小莉則認為50 ℃為雞的冷凍精液解凍的最佳溫度[41]。凌培鳳發現豬冷凍精液的最佳解凍溫度為37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。解凍時升溫速度過快則造成精子內外滲透壓不一致，能損壞細胞膜，而升溫速度過慢細胞外液已形成冰晶。

冷凍精子的解凍方式分為干法解凍和濕法解凍。干法解凍是將解凍后的精子放入二氧化碳培養箱中撫育，濕法解凍是指將精子放到恒溫水浴鍋中。如果凍精封口不嚴，濕法解凍則會造成一定的應激。

3 豬精液冷凍保存技術存在的問題

3.1 對冷凍精液的設備要求

對于豬精液冷凍效果較好的程序冷凍法要求儀器能控制液氮的噴出量，從而控制精子冷凍的降溫速率，但其價格昂貴，不能普及到豬場的實際應用上。

3.2 操作要求嚴格

冷凍精液的質量與其冷凍解凍的速率精密度成正比，尤其解凍的時間上要精確到秒，這對操作人員的操作水平要求極高，操作人員的技術水平與解凍后精子的質量成正比。

3.3 影響因素復雜

精液質量、稀釋液成分，冷凍方式，解凍溫度和時間及不同物種對冷凍精液的質量影響顯著，目前還未有統一的標準。王雪晗發現冷凍時液氮面熏蒸高度距離3 cm，熏蒸時間9 min，解凍時38 ℃水浴20 s，精子的質量較好[15]。王捷發現冷凍精液稀釋液中添加2.0 μmol/L 番茄紅素、0.2 g/L 芝麻酚和0.04 g/L 黃芩素的對解凍后精子質量效果較好，添加0.2g/L 芝麻酚和2.0 μmol/L 番茄紅素以及0.2 g/L 芝麻酚和2.5 μmol/L 番茄紅素能提高解凍后精子抗氧化能力[22]。凌培鳳發現同一冷凍液的豬冷凍精液的最佳解凍溫度為37 ℃ 30 s 和65 ℃ 5 s[42]。

4 小結

目前有關豬的精液冷凍保存技術的研究較多，較多的研究在于不同條件對精液冷凍保存影響結果，但關于影響的機制研究較少，對影響機制的研究有助于從根本上提高精液冷凍保存技術，為畜牧業優良品種推廣及種質資源保存做出貢獻。