腸道病毒71型感染致中樞神經系統損害的免疫發病機制①

張建華 徐 蓮 黃慧琪 潘 密 樓超楠

(紹興文理學院醫學院醫學免疫學教研室，紹興 312000)

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬成員，是一種無包膜、單股正鏈RNA病毒。自1974年Schmidt等[1]首次報道以來，EV71已在世界范圍內，尤其在亞太地區引起多次暴發流行[2]。EV71感染可引起手足口病(HFMD)，患者以5歲以下嬰幼兒多見。除EV71外，柯薩奇病毒A16(CA16)等其他腸道病毒也是引起HFMD的重要病原體，但EV71感染更易引起中樞神經系統并發癥，有較高的病死率和致殘率[3]。2008～2012年，我國大陸地區所有HFMD輕癥病例中，EV71感染占45%，重癥病例中占80%，死亡病例中占93%[4]。目前，EV71感染的發病機制仍不十分清楚，臨床上缺乏高效特異的抗病毒藥物。眾所周知，宿主免疫應答是清除病毒感染或防止再次感染的最好方式，但在抗病毒免疫應答過程中，多種免疫因素可參與組織病理損傷，可能與EV71感染所致的中樞神經系統并發癥密切相關。本文對EV71感染相關的中樞神經系統并發癥及其免疫學發病機制研究相關進展綜述如下。

1 EV71感染相關的神經系統并發癥

EV71感染引起的臨床表現通常是輕微的，呈自限性，包括HFMD與皰疹性咽峽炎。少數病例，尤其是3歲以下患兒，可引起嚴重的神經系統并發癥，極少數病例病情危重，可導致死亡，中樞神經系統感染并發心肺衰竭是主要死因[5]。因此，EV71已被公認為是繼脊髓灰質炎病毒消滅后最重要的嗜神經病毒。在EV71感染相關的神經系統并發癥中，腦干腦炎十分常見，患兒常表現為肌陣攣、眼球震顫、嘔吐、共濟失調、顫動等。偶爾可引發自主神經功能障礙，如肺出血或肺水腫(神經源性肺水腫)，起病急，進展快，病死率高達80%～90%，幸存者均有顯著的神經系統后遺癥[6]。無菌性腦膜炎也是常見的神經系統并發癥之一，患者常表現為劇烈頭痛、伴發熱、嘔吐、頸項強直等，該病預后良好，多無神經系統后遺癥[7]。EV71感染與脊髓灰質炎病毒類似，也可引起急性弛緩性麻痹，相比脊髓灰質炎，EV71所致的急性弛緩性麻痹臨床癥狀較輕，較少出現永久性肢體癱瘓后遺癥[5]。此外，吉蘭-巴雷綜合癥與橫貫性脊髓炎也是EV71感染相關的神經系統并發癥。

2 EV71致神經系統損害的免疫學發病機制

與脊髓灰質炎病毒類似，EV71主要通過糞-口途徑傳播，病毒首先在鼻咽部、胃腸道黏膜相關淋巴組織增殖后釋放入血，經過兩次病毒血癥，最終侵入靶組織，少數病毒可以突破血腦屏障或經周圍神經途徑逆向軸突輸送引起中樞神經系統感染[8]。病毒侵入神經元細胞后大量復制，直接導致組織細胞損傷，但有大量證據顯示，免疫學機制也介導了中樞神經組織的損害[9]。

2.1宿主免疫相關易感基因多態性 相同EV71基因型感染在不同宿主可出現不同程度的臨床類型，有的無臨床癥狀，有的可出現嚴重的神經系統并發癥，甚至死亡；從而推測，宿主的免疫反應可能是疾病嚴重程度的決定因素。

2.1.1模式識別受體基因 天然免疫應答水平與病毒感染的發生發展緊密相關，病毒侵入機體后，免疫細胞或宿主細胞通過模式識別受體(PRR)識別病毒相關組分，從而啟動天然免疫應答。Pang等[10]調查了三種PRR基因多態性與EV71感染疾病嚴重程度的相關性，包括Toll樣受體3(TLR3)、維甲酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)與黑色素瘤分化相關基因5(MDA5)。結果顯示，MDA5基因多態性與EV71重癥感染緊密相關。MDA5對于RNA病毒感染誘導Ⅰ型IFN的產生十分重要，已有研究證明，MDA5參與EV71 RNA介導的干擾素調節因子3(IRF3)激活與IFN-β轉錄，過表達后可以逆轉EV71感染導致的IRF3活化抑制狀態[11]。因此，MDA5基因多態性以及相應的固有免疫逃避機制值得進一步關注。最近，王春陽等[12]研究發現，EV71感染宿主細胞后可通過降低IRF9來抑制IFN-β誘導的干擾素刺激基因(ISGs)表達，從而逃避抗病毒固有免疫應答。

2.1.2人類白細胞抗原基因 人類白細胞抗原(HLA)是人體對疾病易感性的主要遺傳學成分，帶有HLA特定等位基因的人體往往與某一疾病易感性相關。已有研究表明，HLA-A33與EV71感染宿主易感性最為相關，而HLA-A2與EV71感染致心肺衰竭密切相關，推測EV71特異性細胞免疫應答水平與疾病嚴重程度存在某種關聯[13]。此外，HLA-G基因多態性也與EV71重癥感染有關。陳曉晴等[14]發現，HLA-G的14 bp插入/缺失多態性(位于第3 742 bp處存在一個長度為14 bp的插入或缺失)與EV71感染嚴重程度密切相關，EV71感染重癥病例中，14 bp-/-基因型顯著增加。HLA-G是一種重要的免疫耐受分子，可抑制多種免疫細胞功能，病毒感染后可借助HLA-G分子逃避宿主抗病毒免疫攻擊。Zheng等[15]比較了EV71感染所致腦干腦炎患者與神經源性肺水腫患者的HLA-G表達水平，發現后者的外周血單核細胞表面、血漿中HLA-G表達水平顯著升高，提示HLA-G與EV71感染的疾病嚴重程度緊密相關。

2.2體液免疫 通常認為，體液免疫狀態與EV71感染所致的神經系統并發癥沒有關聯。Chang等[16]評估了EV71感染患者病毒特異性細胞免疫和體液免疫水平與疾病嚴重程度的關聯性，發現普通病例(無神經系統并發癥)、重癥病例(較輕的神經系統并發癥)、危重病例(腦干腦炎伴神經源性肺水腫)之間中和抗體水平無顯著性差異。但是，僅僅從病毒特異性中和抗體角度否認體液免疫參與神經系統損害有失偏頗。Xie等[17]發現，重癥病例的感染急性期B細胞的數量、比例以及血清總IgG含量均顯著高于普通病例組，隨著感染進入恢復期，中和抗體滴度上升，上述指標恢復正常，說明體液免疫與EV71感染引起神經系統并發癥是有關聯的。

2.2.1EV71特異性抗體介導的神經系統自身免疫病理損傷 病毒抗原可能與宿主細胞存在共同表位，從而通過交叉反應造成自身免疫病理損傷。Jia等[18]研究發現，EV71特異性IgG與人腦組織存在交叉反應，隨后對相應抗原肽段進行定位，發現有4個肽段(分別來自VP2、VP1、2A與2C)可引發強烈的交叉反應。進一步利用EV71乳鼠感染模型證實，病毒感染可提高血腦屏障通透性，使得EV71特異性IgG進入腦組織并出現交叉反應。這些具有自身反應性的病毒抗體究竟可以結合到何處值得進一步探討。Fan等[19]利用生物信息學技術對EV71與人類蛋白數據庫進行比對，在VP1中獲得一個共同表位；相應單克隆抗體可有效結合至中介復合體亞基25(MED25)，而后者在腦干組織中高水平表達；體內實驗也證實，EV71感染小鼠7 d后靜脈注射該單抗，可分布在小鼠腦干區域；并且在EV71感染患者血清中也發現了類似抗體。這些發現意味著EV71感染致神經系統損傷的機制中可能涉及自身免疫因素。

2.2.2EV71特異性抗體介導的抗體依賴性增強作用 在病毒感染過程中，某些特異性抗體可發揮抗體依賴性增強作用(ADE)，并且在多種病毒感染過程中得到證實，如登革病毒、呼吸道合胞病毒、埃博拉病毒等[20,21]。小RNA病毒科成員如口蹄疫病毒、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒B組等，也有關于ADE的報道。Han等[22]發現亞中和抗體可增強EV71對THP-1細胞的感染，并可增加EV71感染的乳鼠死亡率，此外，他們建立了EV71再次感染的乳鼠模型，認為EV71初次感染產生的抗體可以增加再次感染的死亡率。基于這一研究結論，Cao等[23]進一步分析了EV71抗體不同亞類的中和作用與ADE效應的關系，發現IgG3無中和活性，但有顯著的ADE效應。ADE的效應機制通常由免疫細胞或宿主細胞表面的IgG Fc受體(FcγR)介導，而FcγR也在中樞神經組織中表達，當病毒侵入中樞神經系統后，是否也存在類似的ADE現象是個值得探討的問題。

2.3細胞免疫 大多數研究認為，細胞免疫水平與EV71感染嚴重程度緊密相關。來自我國臺灣的兩項研究均顯示，EV71感染引起的腦干腦炎伴肺水腫患者外周血中CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞數量與比例，以及植物血凝素(PHA)刺激指數均顯著降低，同時伴隨著細胞因子的動態變化，尤其是患者血漿IL-10、IL-13與IFN-γ顯著升高。他們認為，淋巴細胞損耗與細胞因子異常可能是EV71相關的神經源性肺水腫的關鍵發病機制[16,24]。動物模型研究也支持這一結論，有人發現，利用EV71感染CD4或CD8缺陷的小鼠時癥狀更嚴重[25]。另一方面，有人比較了不同毒力EV71臨床分離毒株感染乳鼠時的T細胞亞群差異，結果發現，與弱毒株相比，強毒株可以顯著增加宿主CD4+T細胞水平，但CD8+T細胞、NK細胞水平沒有差異[26]。

CD4+T細胞在適應性免疫中起到核心作用，對于抗體或CTL應答均有輔助作用，同時，CD4+T細胞介導的免疫應答在病毒感染相關的免疫病理機制中也有重要作用。Wei等[27]在EV71多聚蛋白中鑒定獲得一系列CD4+T細胞表位，其中有一個表位(記作A3)在腸道病毒屬成員中高度保守，包括柯薩奇病毒、埃可病毒、脊髓灰質炎病毒，尤其是脊髓灰質炎病毒3型Sabin株，作為疫苗免疫接種后，可對EV71感染起到一定的保護作用，他們推測，EV71感染后大部分患者臨床表現輕微，可能與脊髓灰質炎疫苗接種以及其他腸道病毒感染有關。然而該研究小組隨后的一項臨床研究認為，A3表位可以引起EV71特異性Th2型應答，抗原刺激后IL-4表達升高，并且與患者發熱時間顯著相關，據此作者認為該表位特異的Th2應答與EV71感染預后不良有關[28]。這種保守表位的特異性免疫究竟屬于保護性的還是參與病理損傷仍然是模糊的。

T細胞亞群失衡也可能與EV71感染免疫病理過程有關。Li等[29]調查了EV71感染后患者外周血T細胞亞群及相關細胞因子水平，發現與對照組相比，EV71感染患者Th1、Tc1細胞數量顯著增加，Th1/Th2比率以及IFN-γ增高；重癥病例與普通病例、對照組相比，Th17比例與IL-17A水平升高，相應的Th17/Treg比率也增高，暗示T細胞亞群失衡可能與EV71感染免疫病理機制有關。

2.4細胞因子與趨化因子 細胞因子在病毒感染誘導的免疫應答中的作用十分復雜，許多細胞因子既涉及到免疫應答的啟動與調節，也可直接或間接抑制病毒復制。在異常情況下，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間平衡失調，體液中多種促炎細胞因子過量產生，導致組織損傷。越來越多的證據顯示，細胞因子異常與EV71感染相關中樞神經系統并發癥相關[30]。EV71感染患者的血清與腦脊液中可以檢出高水平的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、G-CSF、IFN-γ及TNF-α[24,31-33]，尤其是腦脊液中IL-1β、IL-6與TNF-α的水平，在EV71感染并發的腦干腦炎、神經源性肺水腫患者中顯著升高，兩者高度相關[34,35]。由此可以推斷，致炎細胞因子水平與EV71感染臨床嚴重程度是緊密相關的。這些細胞因子參與EV71感染發病的機制在動物模型中得到進一步證實，Khong等[36]在EV71乳鼠感染模型中，觀察到血清中持續出現高水平的IL-6，注射IL-6單克隆抗體后可以顯著降低死亡率，減輕組織損害程度。

趨化因子可以募集淋巴細胞至感染局部組織，促進抗病毒免疫應答產生。有研究顯示，EV71感染IP-10基因敲除的小鼠，可降低MIG、IFN-γ水平以及CD8+T細胞數量，減緩病毒清除速度，顯著增加死亡率[37]。但趨化因子水平異常也可能是參與致病的免疫學因素。有研究顯示，CXCL8、CCL2/MCP-1、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10等在EV71感染合并肺水腫患者的血清與腦脊液中均顯著上調[38,39]，其中MCP-1的過表達在EV71感染小鼠模型中得到證實[40]。另有研究表明CXCL8、RANTES的表達水平與疾病嚴重程度相關，其水平的升高預示著病情由輕癥向重癥的發展趨勢，可見，CXCL8、RANTES參與了EV71感染重癥化的病理過程[41]。

3 結語

很顯然，病毒感染誘導的免疫應答在限制病毒感染、降低病毒負荷、減輕組織損傷等方面是十分有效的，另一方面，在清除病毒感染的同時，激活的免疫細胞以及釋放的應答產物也是其致病機制的一部分。綜上所述，EV71感染所致的中樞神經系統損害與異常的免疫應答緊密相關，但其確切機制仍然不清。絕大多數結論來自臨床研究，僅限于關聯性研究，因果關系并不明確。盡管體外及動物實驗取得了一定的進展，但鑒于動物模型本身的限制，與人體真實病理狀態相差甚遠，相應的研究結論仍然缺乏說服力。病毒特異性抗體、T淋巴細胞應答以及細胞因子失衡等在EV71致病機制中的作用仍然值得進一步探討。此外，未來研究應進一步關注免疫應答相關的遺傳學研究，突出個體因素在EV71感染發生發展中的作用。